Name: Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Aprenda um método otimizado de transfecção para expressão eletrofisiológica de canais de íon recombinantes em células HEK-293T. Esta técnica melhora a adesão celular e a estabilidade da membrana durante as gravações.

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Este trabalho foi financiado por uma subvenção de funcionamento Discovery para JDS da Ciências Naturais e Engenharia Research Council (NSERC) do Canadá, um NSERC Alexander Graham Bell Bolsas de Pós-Graduação no Canadá (doutorado) (para A. Senatore) ea Fundação do Coração e Derrame, Grant -In-Aid NA # 6284.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ser capaz de gravar toda célula correntes utilizando os protocolos descritos e soluções indica que a transfecção foi bem-sucedida e que o desejado dos canais de íon ou complexos de canal iônico estão presentes com quantidades significativas na membrana celular. Deve ser positivamente as células transfectadas (ie verde fluorescente), mas não têm correntes de gravação, tempo adicional a 28 ° C pode ser necessária para permitir a proteína de canal a ser devidamente embalados e inserida na membrana celular. Note-se que a in...

<table border="1"><tr><td> Material </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP plasmídeo </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Círculo de vidro lamínulas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Círculos No. 1 - 0,13 a 0,17 milímetros de espessura, tamanho: 12mm </td></tr><tr><td> Amplificador </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B ou 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de aquisição de dados </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Eletrofisiologia Software </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Manipuladores pipeta </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio invertido de epifluorescência </td><td> Zeiss Canadá </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Axon Instruments </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Suporte do eletrodo Headstage </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Titular de microeletrodos para eletrodo terra </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos capilares de eletrofisiologia </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> BF-150-86-15 </td><td> Vidro de borosilicato com filamento, OD 1.5mm, OD 0,86 milímetros, 15cm de comprimento </td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipeta Puller </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta fogo polidor </td><td> Narishige </td><td> Micro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Micro sistema de perfusão de drogas </td><td> AutoMate Scientific </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de perfusão de drogas </td><td> AutoMate Scientific </td><td> Valvelink8.2 com Teflon válvulas </td><td></td></tr></table>

estratégia de transfection otimizado para gravação de expressão e eletrofisiológicos de recombinante dos canais de íon em hek-293t células

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

A expressão in vitro e em gravação eletrofisiológicas de recombinante dos canais de íons nas culturas de células embrionárias do rim (HEK-293T) é uma estratégia de pesquisa onipresente. HEK-293T células devem ser semeados em lamínulas de vidro com uma densidade baixa o suficiente para que eles não estão em contato uns com os outros, a fim de permitir a gravação eletrofisiológicas sem efeitos de confusão devido ao contato com as células adjacentes. Canais transfectadas também deve expressar com alta eficiência na membrana plasmática de células inteiras de gravação patch clamp de correntes detectável acima dos níveis de ruído. Canais iônicos heteróloga muitas vezes exigem longos períodos de incubação a 28 ° C após a transfecção, a fim de alcançar expressão membrana adequada, mas há um aumento na perda de células-lamela aderência e estabilidade da membrana, a esta temperatura. Para contornar esse problema, desenvolvemos uma estratégia otimizada para células HEK-293T transfecção e placa. Este método requer que as células transfectadas ser em uma confluência relativamente alto, e incubados a 28 ° C por diferentes períodos de incubação pós-transfecção para permitir a adequada expressão da proteína de canal iônico. Células transfectadas são então banhado em lamínulas de vidro e incubados a 37 ° C por várias horas, que permite a penhora de células rígidas para as lamelas e restabilização membrana. As células podem ser gravadas logo após o plaqueamento, ou podem ser transferidos para 28 ° C para a incubação mais. Nós achamos que a incubação inicial a 28 ° C, após a transfecção, mas antes do plaqueamento, é a chave para a expressão eficiente de canais de íons heteróloga que normalmente não expressam bem na membrana plasmática. Positivamente transfectadas, as células cultivadas são identificados por co-expressas ou eGFP eGFP expressa a partir de um vector bicistronic (por exemplo, pIRES2-EGFP) contendo o canal iônico recombinante cDNA logo acima de um local de entrada interna ribossomo e uma seqüência de codificação eGFP. Whole-cell patch clamp gravação requer equipamentos especializados, além da elaboração de eletrodos de registro polido e eletrodos em forma de L chão de vidro de borosilicato. A entrega da droga para estudar a farmacologia dos canais iônicos podem ser alcançados diretamente micropipetting drogas no prato de gravação, ou usando microperfusão ou sistemas de fluxo por gravidade que produzem fluxos ininterruptos de solução de drogas sobre as células gravadas.

Método confiável para altamente eficiente<em&gt; In vitro</em&gt; Expressão e de gravação eletrofisiológicas subseqüente de recombinação dos canais de íons nas culturas de células embrionárias do rim (HEK-293T).

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

A expressão in vitro e o registro eletrofisiológico de canais iônicos dependentes de voltagem recombinantes em células cultivadas de rim embrionário humano (HEK-293T) ...

A eletrofisiologia é comumente utilizada para estudar a atividade de canais iônicos dependentes de voltagem recombinantes em células de rim embrionário humano cultivadas. O registro bem-sucedido exige que as células expressem canais em níveis suficientes na membrana celular para detecção e que as células sejam semeadas em densidade celular baixa o suficiente para isolamento de células individuais. A realização de registros celulares é frequentemente prejudicada pelos longos períodos de incubação a 28 graus Celsius necessários para essa expressão, nos quais ocorre tipicamente perda de adesão celular e estabilidade da membrana.Aqui, é demonstrado um método otimizado de cultura celular e transfeção que contorna esses problemas. As células são transfectadas em uma confluência moderada, em seguida incubadas a 28 graus Celsius até que seja alcançada uma expressão adequada de canais iônicos. As células transfectadas são então semeadas em lamínulas de vidro com baixa densidade e incubadas a 37 graus Celsius por várias horas para permitir a adesão celular e a estabilização da membrana.Uma vez que as células apropriadas são plaqueadas, elas são então identificadas pela coexpressão de EGFP e

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Vamos demonstrar como estudar o efeito de uma única mutação de ponto na função de um canal iônico.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

A expressão de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos está se tornando um método atraente para a produção de complexos proteicos para biologia estrutural. Aqui apresentamos um sistema de expressão simples, mas altamente eficiente, usando células de mamíferos cultivadas em suspensão para purificar complexos de proteínas para estudos estruturais.

Expressão de proteínas recombinantes de Biologia Estrutural em HEK 293F Suspensão Cells: Uma abordagem inovadora e acessível

Um método para imagens de alterações no potencial de membrana usando indicadores de tensão geneticamente codificados é descrito.

Membrana de imagem Potencial com dois tipos de sensores de tensão fluorescentes geneticamente codificados

A produção em escala laboratorial de proteínas eucarióticas com modificação pós-traducional apropriada representa uma barreira significativa. Aqui está um protocolo robusto com rápido estabelecimento e retorno para expressão de proteínas usando um sistema de expressão de mamíferos. Este sistema suporta aminoácidos seletivos, marcação seletiva de proteínas e moduladores de moléculas pequenas da composição de glicanos.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Novas estratégias terapêuticas na medicina regenerativa cardíaca exigem extensos e detalhados estudos em modelos animais pré-clínicos grandes antes que eles podem ser considerados para uso em seres humanos. Aqui, vamos demonstrar uma técnica de injeção contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelhos, que é valioso para a eficácia de tais terapias romance de testes de hipóteses.

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Usando a polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI), produzimos partículas lentivirais para expressão estável de shRNAs em células-tronco embrionárias humanas H9 (hESCs) e células progenitoras neurais derivadas de H9 (NPCs) com alta eficiência.

Entrega mediada lentiviral de shRNAs para hESCs e NPCs usando polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI)

O vírus adenoassociado recombinante (rAAV) é amplamente utilizado para liberação clínica e pré-clínica de genes. Um uso subestimado para rAAVs é a transdução robusta de células cultivadas sem a necessidade de purificação. Para pesquisadores iniciantes no rAAV, fornecemos um protocolo para clonagem de transgênico, produção bruta de vetores e transdução de cultura celular.

Expressão de Transgenes em Células Cultivadas Usando Vetores Virais Adenoassociados Recombinantes Não Purificados

Para estudar as respostas de células excitáveis in vitro, o protocolo descreve o monitoramento óptico de mudanças na geração de potencial de ação devido à eletroporação em um modelo de célula excitável simples de células HEK de pico tet-on geneticamente modificadas, bem como mudanças na voltagem transmembrana com extração automatizada de parâmetros relevantes.

Monitoramento de mudanças induzidas por eletroporação na geração de potencial de ação em células Tet-On Spiking HEK geneticamente modificadas

Aprenda um método otimizado de transfecção para expressão eletrofisiológica de canais de íon recombinantes em células HEK-293T. Esta técnica melhora a adesão celular e a estabilidade da membrana durante as gravações.

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células (Vídeo) | JoVE Journal

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

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