Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

A eletrofisiologia é comumente usada para estudar a atividade de canais iônicos dependentes de voltagem recombinante em células renais embrionárias humanas cultivadas. O registro bem-sucedido requer que as células expressem canais em níveis suficientes na membrana celular para detecção e que as células sejam plaqueadas em uma densidade celular baixa o suficiente para o isolamento de células individuais. A realização de gravações celulares é frequentemente dificultada pelos longos períodos de incubação a 28 graus Celsius necessários para tal expressão, onde normalmente há uma perda de adesão celular e estabilidade da membrana.

Aqui, é demonstrado um método otimizado para cultura e transfecção de células que contorna esses problemas. As células são transfectadas a uma cofluência moderada e, em seguida, incubadas a 28 graus Celsius até que a expressão adequada do canal iônico seja alcançada. As células transfectadas são então revestidas em lamínulas de vidro em baixa densidade e incubadas a 37 graus Celsius por várias horas para permitir a fixação das células e a estabilização da membrana.

Uma vez apropriadamente plaqueadas, as células são então identificadas por EGFP coexpresso e patch clamp de célula inteira. A gravação pode ser realizada ou as células podem ser incubadas novamente a 28 graus Celsius. Para aumentar ainda mais a expressão da superfície do canal, os resultados do registro de experimentos em células transfectadas com canais de cálcio dependentes de voltagem, como L CAV um, L CAV dois ou L cav três, indicam que os canais foram transfectados e expressos com sucesso pelas células.

Embora apenas resultados representativos para L CAV três sejam mostrados Em nosso laboratório, desenvolvemos um método para aumentar a expressão de genes de canal iônico de baixa expressão para registro de patch clamp em linhagens celulares humanas. Agora, a abordagem convencional é primeiro dividir as células nas lamínulas e transfectar com CDNAs de plasma contendo os genes do canal iônico e, em seguida, incubar por muitos dias a 28 graus Celsius para obter uma expressão de canal iônico de alta eficiência antes do registro eletrofisiológico. Nossa nova abordagem reduz muito o tempo de incubação necessário em 28 graus Celsius antes da gravação.

Agora, diminuindo o tempo de incubação de 28 graus, descobrimos que as membranas celulares são muito mais estáveis e as células transfectadas aderem muito mais às lamínulas. Isso aumenta o número de células registráveis e torna significativamente a experimentação mais eficiente. Antes da transfecção, divida um frasco totalmente confluente de células HEK 2 9 3 T, uma a quatro, em um novo frasco quadrado de 25 centímetros e coloque as células em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius 5%.

Deixe as células se ligarem por três a quatro horas após quatro horas, examine as células por contraste de interferência diferencial para verificar a fixação. Observe que as células não parecem mais redondas e estão se achatando. Extensões ou pseudópodes são visíveis.

Menos células de confluência teriam a mesma aparência, mas seriam espaçadas ainda mais. Uma vez que as células tenham se fixado, combine os reagentes necessários para realizar uma transfecção padrão de fosfato de cálcio. Preparar um total de 12 microgramas de ADN em 600 microlitros de solução de transfecção por frasco.

Aqui, CDNAs de vários canais iônicos são clonados no plasmídeo P-I-R-E-S dois EGFP Transfecção deste vetor de expressão em uma linhagem celular de mamíferos. Resulta na produção de proteína fluorescente verde aprimorada a partir do mesmo mRNA que a inserção clonada por meio da tradução iniciada em um local de entrada do ribossomo interno logo a jusante da sequência de revestimento do canal iônico e a montante da sequência de revestimento EGFP. Isso permite que as células transfectadas positivamente sejam identificadas sem possível interferência na função da proteína que pode ser causada pela fusão da proteína EGFP diretamente com a proteína de interesse.

Pipete a solução de transfecção sobre as células gota a gota, depois gire suavemente o frasco e coloque-o na incubadora a 37 graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Verifique a eficiência da transfecção visualizando as células sob um microscópio de fluorescência. As células transfectadas positivamente devem aparecer verdes em toda a célula.

Uma vez verificada a transfecção, pipetar cuidadosamente quatro a cinco mililitros de meio quente para o balão invertido. Lave as células virando lentamente o balão de modo a que a superfície da célula fique para baixo e balançando o balão de modo a que a solução de lavagem se mova suavemente sobre elas. Retire o meio e repita esta lavagem.

Passo mais duas vezes. Em seguida, adicione seis mililitros de meio ao frasco e incube a 37 graus Celsius por duas horas. A expressão de canais iônicos de invertebrados apresenta alguns desafios.

Primeiro, eles geralmente são de tamanho grande e, portanto, podem levar muito tempo para se traduzir no retículo endoplasmático. Além disso, eles podem não ser direcionados de forma eficiente para a membrana celular em uma linhagem celular de mamíferos. Finalmente, uma vez que diferentes espécies exibem diferentes frequências de uso de códons, CDNAs heterólogos podem abrigar altas frequências de códons que são incomuns em células de mamíferos, como HEK 2 9 3 T, para superar algumas dessas dificuldades.

Após a incubação de duas horas a 37 graus Celsius após a lavagem do transfecto, transferir os frascos para uma incubadora a 28 graus Celsius durante dois a seis dias para prolongar o período de expressão. O tempo de incubação deve ser determinado empiricamente para cada tipo de canal iônico que está sendo expresso. Uma vez que a incubação a 28 graus Celsius por períodos prolongados leva ao descolamento celular e à baixa estabilidade da membrana.

É necessária uma preparação celular adicional antes da realização de estudos eletrofisiológicos. Primeiro, remova o meio das células transfectadas por pipeta de aspiração um mililitro de solução de tripsina a 37 graus Celsius em um frasco invertido. Em seguida, retorne suavemente o frasco para a posição de superfície da célula para baixo para permitir que a tripsina escorra suavemente sobre as células.

Vire o frasco e remova a tripsina. Em seguida, adicione 250 microlitros de tripsina quente diretamente sobre as células e incube a 37 graus Celsius por três a cinco minutos até que as células se desprendam. Enquanto isso, coloque de três a oito lamínulas revestidas de poli L lisina em uma placa de cultura de 60 milímetros e adicione cinco mililitros de meio de cultura quente.

Uma vez que as células tenham destacado o resus, suspenda-as em quatro mililitros de meio quente pipetando para cima e para baixo cerca de seis vezes em seguida, usando a ponta da micropipeta, empurre as lamínulas para baixo para garantir que estejam no fundo do prato. Em seguida, adicione 250 a 500 microlitros de células ressuspensas. Incube as células a 37 graus Celsius por três horas para permitir que elas adiram às lamínulas.

Deixar as células por muito tempo a 37 graus resultará na divisão celular e diluição dos plasmídeos transfectados. As células transfectadas devem ser plaqueadas em uma densidade baixa o suficiente para que sejam isoladas umas das outras, conforme mostrado aqui. Isso facilitará o registro eletrofisiológico.

Para células que requerem subunidades acessórias, muitas vezes é necessário transferir as células para 28 graus Celsius e incubá-las por mais três a quatro dias antes da eletrofisiologia. A gravação é realizada para células que não requerem subunidades acessórias. A gravação pode ser realizada imediatamente após esta incubação.

O equipamento de eletrofisiologia usado aqui inclui um amplificador, manipuladores de pipeta dupla motorizados e microscópio de epifluorescência e sistemas de perfusão. O equipamento foi montado em uma mesa de isolamento de vibração e disperso. O ruído elétrico é limitado por um tipo de 40 polegadas de altura dois sistemas de controle eletrônico de gaiola ferrett, incluindo um PC equipado com um dígito de dados 1440, uma interface de conversor analógico para digital em conjunto com o software P clamp 10.1.

O amplificador do monitor do computador, o manipulador motorizado e um sistema de controle de profusão de ligação de válvula são todos montados fora da gaiola de Faraday. Em um rack elétrico de metal independente de 19 polegadas, todo o equipamento elétrico é aterrado a um distribuidor de cobre e conectado a um transformador de isolamento de grau médico, que fornece isolamento de linha, aterramento consistente e supressão de surtos. Prepare-se para experimentos montando micropipetas polidas a fogo com resistência de dois a cinco mega ohms no suporte da micropipeta no estágio principal.

As pipetas de remendo são preenchidas com movimento de solução interna para remover bolhas de ar e, finalmente, montadas no estágio principal. Em seguida, usando uma pinça, transfira uma lamínula com células revestidas para uma placa de Petri de plástico de 35 milímetros contendo três mililitros de solução de registro externa à temperatura ambiente. O volume da solução de registro deve ser medido com precisão ao realizar experimentos com drogas durante as quais quantidades conhecidas de drogas são adicionadas ao prato com uma micropipeta, coloque o prato no microscópio stage.

Em seguida, encha uma meia célula porta-eletrodo com cloreto de césio de três molares. Em seguida, insira o eletrodo de referência na meia célula e coloque o eletrodo de aterramento no banho usando o manipulador microm, abaixe a pipeta de remendo na solução do banho. Visualize as células no modo de fluorescência e centralize uma célula verde aderente transfectada positivamente isolada no meio do campo de visão.

Enquanto estiver no modo de banho, coloque a pipeta adesiva bem próxima da célula. Zero o traço de onda quadrada observado na tela do computador. Ajuste a posição da pipeta de remendo para que ela toque apenas a célula e o traço de corrente quadrada na tela comece a flutuar.

Aplique uma sucção suave com uma seringa acoplada até formar uma vedação de giga ohm. Assim que uma vedação de giga ohm for alcançada, mude o programa para o modo patch. Aplique um pulso rápido de sucção com a seringa para romper a membrana celular.

Em seguida, mude para o modo de célula e use os parâmetros de célula inteira no amplificador. Para compensar o transiente capacitivo, é necessário equilibrar o remendo para que a solução de registro intracelular dialise na célula remendada. Insira os protocolos de grampo de tensão escritos para este experimento aqui.

O experimentador projetou um protocolo para medir correntes de íons através de canais iônicos dependentes de voltagem que resultam quando a voltagem através da membrana celular é modulada. Nesse caso, estamos analisando um protocolo IV que especifica que o software mantém a célula em menos 110 milivolts e, em seguida, SEP em menos 70 milivolts por 250 milissegundos. Em seguida, volte para menos 110 milivolts de potencial de retenção cada vez que o passo aumenta em 10 milivolts, de modo que os passos sejam para menos 70 milivolts, menos 60 milivolts, etc., até que o último passo seja para mais 20 milivolts.

Filtre as correntes registradas a 10 kilohertz usando um filtro Lowpass Bessel no amplificador e digitalize a uma frequência de amostragem de dois kilohertz usando o software clamp X 10.1 use apenas gravações com vazamento mínimo inferior a 10% Para análise, as células T HEK 2 93 foram cultivadas e transfectadas com L Cav. Três canais de cálcio, como mostrado aqui. A transfecção bem-sucedida de CDNAs heterólogos de canais iônicos foi indicada pela fluorescência gerada a partir do vetor P-I-R-E-S dois EEG FP.

Aqui mostramos a expressão bem-sucedida de um canal de cálcio de três voltagens cav invertebrado. Quando as células não são transfectadas, nenhuma corrente de cálcio pode ser provocada. Considerando que as células transfectadas geram grandes correntes quando os protocolos de grampo de tensão da célula inteira são aplicados às células.

Os experimentadores podem usar várias condições eletrofisiológicas e regimes de análise de dados, dependendo de seus requisitos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar seu próprio julgamento em relação ao tempo dos experimentos. Uma vez que diferentes canais são expressos com diferentes eficiências na membrana celular, cabe a você determinar a estratégia ideal a ser usada para aumentar a viabilidade das células, bem como maximizar a expressão superficial dos canais nos quais você está interessado.

Depois de assistir a este vídeo, esperamos que você tenha obtido uma boa compreensão de como cultivar e manter uma linhagem celular humana, bem como transfectar CDNAs de canais iônicos heterólogos e CDNAs de subunidades nessas células. Para registro eletrofisiológico.