Em tempo real de imagens de leucotrienos B ₄ Migração mediada por células e BLT1 Interações com β-arrestina

O leucotrieno B quatro é uma molécula pró-inflamatória que media suas ações por meio dos receptores acoplados à proteína G, BT um e BT dois, em diversos tipos de células inflamatórias. Demonstrou-se que a via LTB quatro B LT um é crítica em diversas doenças inflamatórias, incluindo asma, artrite e aterosclerose. Os receptores acoplados à proteína G, ou gpcr, mediam a transdução de sinais extracelulares que geram respostas intracelulares, como quimiotaxia, liberação de cálcio intracelular e regulação gênica.

A ligação do ligante extracelular induz uma série de mudanças conformacionais que levam à ativação de proteínas G heterotrímeras. As proteínas G, então, modulam os níveis de mensageiros secundários, como o ciclo de adenosina monofosfato, trifosfato de acetol e diacilglicerol, para monitorar em tempo real a migração celular mediada pelo leucotrieno B4. Células dendríticas derivadas de medula óssea, ou BMDCs, são observadas enquanto o ligante é fornecido por meio de fluxo controlado a partir de uma micropipeta. A aquisição de imagens com lapso de tempo é realizada para avaliar a migração.

Utilizando essas técnicas de imagemagem em tempo real em células vivas, nosso laboratório descobriu que o receptor leucotrieno B4 BT1 é funcionalmente expresso em células dendríticas. Também identificamos mecanismos dependentes de fosforilação e de beta-arrestina para a internalização de BT1. O Dr. Jla, professor assistente em nosso laboratório, que desenvolveu muitas dessas técnicas, demonstrará tanto a migração de células vivas quanto a internalização do receptor. Para preparar células dendríticas derivadas de medula óssea (B MDCs) para ensaios de migração celular, plaque 0,5 milhão de células em meio de cultura RPMI 1640 contendo soro fetal bovino, G-M-C-S-F recombinante e FLT3 recombinante em uma placa de fundo de vidro de 35 milímetros.

Uma vez semeadas, incubar as células por 16 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono após 16 horas. Adicionar três mililitros de PBS e, em seguida, aspirar. Repetir essa lavagem pelo menos mais duas vezes; após a última aspiração, adicionar dois mililitros de PBS ao plaque.

As células estão agora prontas para o experimento e devem ser mantidas a 37 graus Celsius. Até então, o sistema de imageamento utilizado para os experimentos neste vídeo consiste em um sistema epifluorescente A-T-E-F-M acoplado a um microscópio invertido Nikon Eclipse TE 300, equipado com uma platina aquecida e uma câmera digital CCD em preto e branco Cool SNAP hq.

Os comprimentos de onda de excitação e emissão são controlados por rodas de filtros e por um controlador de roda de filtros Lambda 10 dash two. O controle de hardware e a aquisição de imagens são gerenciados pelo software MetaMorph. Dois micromanipuladores estão acoplados à platina do microscópio para segurar as pipetas, que podem ser fabricadas de acordo com as instruções no texto acompanhante ou adquiridas prontas.

Transfira 1,5 mililitros de um estoque de 100 nanomolar do ligante pró-inflamatório leucotrieno B quatro ou LTB quatro para um tubo fuge de 1,5 mililitro. Reabra a micropipeta colocando a ponteira da micropipeta na solução e permitindo que a solução entre; esse método de carregamento evitará a formação de bolhas de ar na extremidade da micropipeta. Em seguida, carregue uma seringa tuberculínica de um centímetro cúbico acoplada a uma agulha microfill com um mililitro de LTB quatro.

Em seguida, utilize-o para encher lentamente uma micropipeta a partir do topo, conectando um tubo à micropipeta cheia do LTB quatro. Depois, conecte a micropipeta e o tubo a uma agulha de 21 graus, com um e meio polegada de comprimento, acoplada a uma seringa de um mililitro, também preenchida com ligante. Agora, fixe cuidadosamente a micropipeta contendo o ligante a um dos micromanipuladores localizados na platina do microscópio, a fim de realizar a imagem celular viva de células dendríticas derivadas da medula óssea.

Em resposta à aplicação do ligante LTB quatro, retire as bMDCs imaturas cultivadas da estufa e coloque-as sobre a platina aquecida do microscópio. Traga as células para o campo de visão utilizando uma objetiva de imersão em óleo de 60 x. Encontre uma área na qual as células não estejam excessivamente concentradas, de modo que a migração possa ser adequadamente monitorada.

Remova a tampa do recipiente de fluoro. Em seguida, utilizando o manipulador manual grosso, abaixe cuidadosamente a pipeta carregada com ligante e introduza-a. Aproxime-a das células utilizando o micro manipulador hidráulico de ajuste fino.

Coloque a pipeta em foco. Aplique uma pequena quantidade de pressão a partir da seringa para iniciar a liberação lenta do ligante LTB4 a partir da ponta; o ligante deve se espalhar lentamente pelo meio por difusão. Em seguida, utilizando o software MetaMorph, configure os parâmetros de aquisição de imagem para adquirir uma imagem em campo claro a cada 15 segundos durante duas horas.

Continue monitorando a cada cinco minutos a progressão da migração em direção ao ligante. O método descrito neste protocolo foi utilizado para determinar a migração de células dendríticas em direção ao leucotrieno B quatro. Aqui, a migração de células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongo em direção a 100.

Nan Animal ou LTB4 é observado neste vídeo de imagem com lapso de tempo, que mostra a migração de células vivas de B MDCs em direção ao LTB4. Métodos semelhantes podem ser aplicados para determinar a resposta quimiotática de diversos tipos celulares a uma variedade de quimioatraentes. Esse tipo de imagem, em combinação com moléculas marcadas com proteínas fluorescentes, pode ser usado para rastrear movimentos e interações de moléculas em tempo real em células vivas.

Aqui demonstramos as interações em tempo real do receptor um de leucotrieno B quatro marcado com fluoróforo com a beta-arrestina. RBL dois H três é uma linhagem celular de leucemia basofílica de rato isolada de ratos Wistar, que pode ser obtida da A TCC. Essas células não expressam muitos receptores de quimiocinas, mas possuem os componentes celulares necessários para mediar vias de sinalização dependentes de quimiocinas.

Para avaliar a internalização induzida por ligante de BT um em tempo real, células RBL dois H três são transfectadas com BT um RFP e beta-arrestina GFP. Durante a aquisição de imagens em lapso de tempo, o ligante é adicionado à placa. As alterações na localização dessas proteínas podem ser avaliadas por análise de imagem.

Para estudar a internalização do GPCR em tempo real, transfecte B LT one RFP e beta arrestina GFP em células RBL two H three de acordo com as instruções no texto acompanhante. Em seguida, transfira 300 microlitros da mistura de células eletroporadas e meio de crescimento regular para placas fluoro de 35 milímetros contendo dois mililitros de meio de crescimento regular. Incube as células a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada de 95% ar, 5% dióxido de carbono para permitir que adiram ao fundo da placa.

Após uma hora, substitua o meio de transfeção pelo meio de crescimento regular e coloque as células de volta no incubador por mais 18 a 24 horas. Após a incubação, lave as células duas ou três vezes adicionando dois mililitros de RPMI morno sem vermelho de fenol contendo 10 milimolares de hippies diretamente na placa e aspirando o meio. Em seguida, adicione mais 1,8 mililitro.

Em seguida, coloque a placa de cultura sobre a platina aquecida do microscópio. Capture imagens com ampliação de 600 x utilizando uma objetiva de imersão em óleo de 60 x. Em seguida, mude para o filtro de fluorescência apropriado.

Escolha uma célula saudável que expresse HBL BT um RFP na superfície celular e capture aqui a imagem. Usando o filtro RFP, mude para o filtro GFP e certifique-se de que a beta arrestina e a GFP estejam expressas no citoplasma, capturando então a imagem. Em seguida, examine as imagens pseudocoloridas sobrepostas para garantir que não haja vazamento de fluorescência, o qual pode ocorrer como resultado de interferência.

A direcionamento dos receptores não ocorre entre RFP e GFP. Em seguida, insira os parâmetros para a aquisição de imagens com lapso de tempo aqui. Imagens de 16 bits são adquiridas com o ajuste de binning da câmera definido para um por um.

As imagens de fluorescência vermelha e verde são capturadas sequencialmente usando filtros de fluorocromo RFP e GFP por meio de um divisor de feixe R-F-P-G-F-P. Instrua o software a capturar imagens em intervalos de tempo de 32 segundos durante uma hora. Ajuste os tempos de exposição da câmera de modo que faixas dinâmicas semelhantes sejam obtidas.

Para a intensidade de fluorescência de RFP e GFP. Adquira imagens durante um minuto, depois em t igual a zero. Adicione os 200 microlitros do ligante diretamente na placa sem perturbá-la.

Continue coletando imagens de fluorescência por 60 minutos. Após a adição do ligante, à medida que as imagens forem adquiridas, elas serão armazenadas automaticamente como imagens TIFF com nomes de arquivo sequenciais. Os arquivos podem então ser visualizados como imagens individuais ou combinadas usando o software.

Por fim, após todas as imagens das células terem sido adquiridas, adquira imagens com meio sem células utilizando as mesmas configurações. Salve os arquivos para uso como imagens de fundo para analisar as imagens. Utilize a função de subtração de imagem no Metamorph para subtrair o fundo das imagens reais obtidas acima.

Isso levará em consideração qualquer fundo ou autofluorescência proveniente do meio. Em seguida, no menu arquivo, abra a opção de arquivo de pilha gerado final e abra as pilhas individuais de imagens. Depois, em medições de região, selecione rastreamento de região de elipse e desenhe as regiões de interesse, selecione as regiões superficiais e citosólicas para medir a intensidade de fluorescência de RFP e GFP correspondentes à translocação de BLT um e beta-arrestina.

Utilizando a opção de dados logarítmicos, que vincula automaticamente ao Excel, coloque a quantidade de intensidades de fluorescência em função do tempo. Este gráfico fornecerá informações sobre a cinética de translocação de uma determinada molécula. Na análise de imagem, é possível revelar a localização de G PCR R, proteínas citosólicas e do núcleo.

Aqui é observada a expressão de BT um RFP na superfície de uma célula RBL dois H três. Esta imagem mostra a localização de beta repouso e GFP no citosol da mesma célula e aqui p nuke CFP é observado no núcleo. A imagem combinada em cores mostrada aqui indica a localização celular distinta de cada fluoróforo. A interação induzida por ligante entre GPCRs de superfície e proteína citosólica também pode ser avaliada aqui.

Translocação induzida por ligante do receptor BLT um e da beta-arrestina. Este vídeo mostra a imagem em tempo real de uma célula expressando BLT um RFP e beta-arrestina GFP. Após a adição de um micromolar de LTB quatro, os padrões de translocação podem ser quantificados utilizando o software Metamorph.

Uma varredura linear das intensidades de fluorescência em uma célula representativa é mostrada no tempo T igual a zero. O BT1-RFP é observado na membrana e a beta arrestina-GFP é observada no citosol. Após a adição do ligante, observa-se sobreposição das linhas RFP e GFP, sugerindo colocalização do receptor e da beta arrestina.

Além disso, a cinética do movimento proteico pode ser determinada aqui. A cinética da internalização do receptor e da translocação da beta-arrestina. Após a adição de um micromolar de LTB quatro foi examinada.

As intensidades de fluorescência foram medidas em função do tempo nas localizações da membrana e do citosol da célula. A adição do ligante LTB4 a células RRB2H3 transfectadas com BT1-RFP e beta-arrestina1-GFP leva à translocação da beta-arrestina1-GFP do citosol para a membrana, observável como a formação de um anel amarelo dentro de um minuto. Após a interação com a beta-arrestina1-GFP, o BT1-RFP forma um complexo receptor-beta-arrestina1-GFP e transloca-se através do citosol na forma de endossomos, evidente pelo aparecimento de pontos amarelos dentro de cinco minutos. Utilizando estes métodos, pode-se determinar o estado de ativação do receptor dependente de ligante e os motivos ou processos críticos envolvidos na ativação do receptor.

A coisa mais importante no experimento é observar atentamente o tampão na placa enquanto ele está sendo operado. À medida que o experimento ultrapassa uma hora após o seu início. Esta técnica surgiu para os pesquisadores na área de quimiocinas e seus receptores, permitindo explorar a migração celular e as interações entre receptores e ligantes em diversos tipos de células de mamíferos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar experimentos de imagem em tempo real envolvendo quimiocinas e seus receptores, bem como suas interações com proteínas citosólicas, como as betarrestinas.