Construção de uma melhor Mosquito: identificar os genes habilitação Malária e Dengue Febre Resistência em A. gambiae e A. aegypti mosquitos

Sou George Dimopoulos. Sou professor assistente no Departamento de Microbiologia Molecular e Imunologia da Escola de Saúde Pública Johns Hopkins, no Instituto de Pesquisa sobre Malária. Meu grupo de pesquisa trabalha com o mosquito Anopheles gambiae, transmissor da malária, e estudamos a biologia molecular desse mosquito, com foco particular no sistema imunológico inato do inseto, que participa da eliminação dos parasitas da malária.

Queremos compreender como este sistema imunológico funciona e quais genes e moléculas são importantes para matar o parasita. Acreditamos que, ao entender a biologia deste sistema, poderemos utilizar esse conhecimento para desenvolver estratégias de controle da Malária no futuro. A Malária é uma das doenças mais graves do mundo.

Está presente na humanidade desde sempre, realmente, e é uma pena que ainda a tenhamos. A malária infecta 400 milhões de pessoas todos os anos e mata 2 milhões de pessoas, principalmente na região da África Subsaariana, mas também é encontrada em outros países em desenvolvimento na América do Sul e na Ásia. A malária é causada por um parasita protozoário do gênero *Plasmodium*, e existem quatro espécies de *Plasmodium* que podem causar malária humana.

O mais importante desses é o Plasmodium falciparum. O Plasmodium falciparum é transmitido principalmente por mosquitos pertencentes ao gênero Anos, e os mosquitos vetores mais importantes para a transmissão da malária na África Subsaariana pertencem ao Complexo de Espécies Ous Gambia, sendo principalmente distribuídos na região subsaariana da África. O vírus da dengue é um vírus do tipo flay, e é transmitido principalmente pelo mosquito Iida gti.

Sua distribuição geográfica é bastante semelhante à da malária. Encontramos a doença nas Américas, no Sudeste Asiático e na África. O vírus da dengue causa febre hemorrágica.

Existem cerca de 2,5 bilhões de pessoas em risco devido ao vírus da dengue, e o vírus causa febre hemorrágica em milhões de pessoas anualmente. A febre hemorrágica da dengue emergiu como uma das doenças transmitidas por vetores mais graves nos últimos 10 anos. Assim, o parasita da malária possui um ciclo de vida complexo tanto no vetor mosquito, que transmite entre o hospedeiro humano, quanto no próprio hospedeiro humano.

E meu grupo de pesquisa está estudando a biologia da transmissão da malária no mosquito. Quando um mosquito ingere uma refeição sanguínea infectada, ele também ingere os parasitas Plasmodium falciparum. Os gametócitos do parasita se fertilizarão no intestino médio e produzirão um oocisto ou quineto no período de aproximadamente 18 a 35 horas após a ingestão do sangue.

Essas formas de Orkin invadirão o epitélio intestinal dos mosquitos aqui. A maioria das formas de Orkin é eliminada pelo sistema imunológico dos mosquitos nesta fase, e é nesse ponto que estamos concentrando nossos estudos. Esta também é uma imagem de microscopia confocal da orquinina; as orquininas que conseguem atravessar o intestino médio formarão um cisto no lado basal aqui, e dentro desse cisto se desenvolverão milhares de parasitas na fase esporozoíta, que então migrarão — cerca de 15 dias após o mosquito ter ingerido a refeição sanguínea — até as glândulas salivares, e a partir das glândulas salivares os esporozoítas podem ser transmitidos a um novo hospedeiro. O sistema imunológico do mosquito também participa da eliminação dos esporozoítas nesta fase, quando são liberados no hemocele do mosquito.

O genoma do mosquito foi sequenciado recentemente em 2002, e isso nos permitiu desenvolver novas ferramentas de biologia molecular e genômica para estudar a expressão gênica de todos os mosquitos, aproximadamente 14.000 genes, em diferentes condições de infecção, utilizando microarranjos, também chamados de microarrays. Este microarranjo aqui, que desenvolvemos há alguns anos, contém o transcriptoma completo do mosquito, todos os genes do mosquito conhecidos naquela época, bem como os genes do parasita plasmódio. Assim, podemos analisar a atividade de genes tanto no mosquito quanto no parasita simultaneamente durante a infecção.

Uma vez que identificamos os genes que são ativados quando o mosquito é infectado com parasitas do plasmodium, precisamos testar se esses genes estão envolvidos na eliminação do parasita, e fazemos isso por meio de um método chamado silenciamento gênico por interferência de RNA. Basicamente, injetamos RNA dos genes que queremos alvejar, e esse RNA de fita dupla degradará os RNAm dos genes no mosquito que estamos alvejando, fazendo com que esses genes não produzam proteína. Em seguida, infectaremos o mosquito com um parasita.

Agora, se silenciarmos ou inativarmos um determinado gene no mosquito, e, após esse silenciamento, o parasita conseguir estabelecer uma infecção maior do que o normal nos mosquitos não tratados, isso sugeriria que esse gene é de alguma forma utilizado na eliminação dos parasitas da malária. E este é realmente o método principal que estamos utilizando para testar se genes estão envolvidos na eliminação de parasitas no mosquito.

A maioria dos parasitas do gênero Plasmodium é eliminada no mosquito, e temos fortes evidências de que o sistema imunológico inato do mosquito é principalmente responsável por essa eliminação. Nosso laboratório e os laboratórios colaboradores identificaram uma variedade de genes envolvidos nesse processo. Além disso, existem linhagens de mosquitos selecionadas geneticamente que não transmitem malária porque eliminam todos os parasitas no intestino médio por meio de mecanismos de defesa imune inata.

Parece que o mosquito possui uma variedade de componentes e mecanismos diferentes para atacar o parasita, e o maior desafio atual é compreender como essas funções atuam e como podemos manipulá-las para desenvolver mosquitos resistentes. O mosquito GTI utiliza mecanismos diferentes para controlar a infecção pelo vírus da dengue em comparação com os mecanismos que um Gambia horrível utiliza para controlar a infecção por odium. O mosquito aegypti, como todos os eucariontes, possui um mecanismo de defesa dependente de RNA chamado interferência de RNA.

É basicamente um mecanismo de defesa capaz de direcionar o RNA do vírus degradado e, dessa forma, proteger-se contra infecção viral. Estamos tentando compreender esse mecanismo de defesa e como podemos manipulá-lo para gerar mosquitos resistentes ao vírus. Nos últimos 10 anos, a biologia molecular experimentou avanços realmente dramáticos, principalmente avanços metodológicos que aceleraram enormemente nossa pesquisa.

Um dos principais avanços são as tecnologias de sequenciamento que permitiram o sequenciamento de alto rendimento de genomas inteiros. Graças a essas tecnologias, temos agora os genomas completos do *Anopheles gambiae* e do *Aedes aegypti* completamente sequenciados. Isso nos permite identificar genes envolvidos no controle de infecções de forma muito mais fácil do que anteriormente.

Outros avanços muito importantes na área de genômica funcional são a análise de expressão gênica em alto rendimento utilizando microarranjos. Microarranjos são pequenas lâminas de vidro nas quais milhares de fragmentos de DNA foram imobilizados, e podemos usar esses chamados chips de DNA para monitorar a expressão gênica de um número muito grande de genes. Outro avanço muito importante na área é a metodologia de silenciamento gênico por interferência de RNA, que nos permite direcionar genes e inativá-los no mosquito, utilizando assim uma abordagem denominada genética reversa para estudar a função gênica e como nossos genes de interesse são importantes na eliminação do parasita.

Os mosquitos sobre os quais nós e nossos colaboradores conduzimos a maioria desses estudos provêm de colônias de mosquitos que têm sido mantidas em condições de laboratório por até 30 anos. Atualmente, esses mosquitos diferenciaram-se bastante dos mosquitos que encontramos na natureza. Os mosquitos na natureza estão sob uma pressão seletiva contínua exercida por diferentes microrganismos e outros parâmetros que variam muito no campo, em comparação com as condições relativamente estáveis que temos em laboratório.

Assim, poder-se-ia argumentar que nossos estudos provavelmente seriam muito mais informativos se fossem realizados diretamente com mosquitos de campo. Infelizmente, no entanto, isso não é tão facilmente realizado. Como dito, não dispomos da infraestrutura necessária no campo, e também é muito complicado coletar mosquitos no ambiente natural e desenvolver colônias a partir desses mosquitos.

Portanto, os melhores modelos biológicos que temos hoje são os modelos de laboratório, mas é claro que em algum momento teremos de ir ao campo para verificar e confirmar as principais descobertas resultantes de nossas pesquisas com os mosquitos de laboratório. Sabemos que os sistemas de defesa dos mosquitos estão envolvidos na eliminação dos patógenos humanos que esses insetos transmitem. Agora, se pudermos compreender como essa eliminação ocorre, quais genes estão envolvidos e quais mecanismos participam desse processo, poderíamos potencialmente manipulá-los e utilizar essa manipulação para desenvolver mosquitos geneticamente modificados incapazes de transmitir o patógeno.

Uma vez que desenvolvemos esses mosquitos geneticamente modificados, podemos começar a pensar em como introduzi-los efetivamente no campo e torná-los uma espécie dominante frente aos mosquitos suscetíveis. Uma estratégia amplamente discutida para alcançar esse objetivo consiste basicamente em disseminar genes resistentes em populações naturais, genes que tornariam os mosquitos resistentes aos patógenos, e isso precisa ser alcançado por meio dos chamados mecanismos de condução genética. Atualmente, muitas pesquisas estão focadas no desenvolvimento desses mecanismos de condução genética.

É claro que existem muitas considerações éticas que devem ser feitas antes da liberação de qualquer tipo de organismo geneticamente modificado na natureza. É importante lembrar que a modificação genética ocorre naturalmente o tempo todo no ambiente. No caso dessas três mutações, há pouca razão para acreditar que acabaríamos com um mosquito melhor em transmitir um patógeno ou que possuísse alguma outra característica indesejável.

A pior coisa que poderia acontecer é que o patógeno desenvolvesse resistência a esse mosquito transgênico em algum momento, e é claro que teríamos de realizar muitos testes de campo e muitos testes laboratoriais antes de considerar a liberação de um mosquito geneticamente modificado no ambiente. Também teríamos de educar as pessoas sobre essas estratégias controladas e garantir que todos se sintam confortáveis e estejam a bordo com esse tipo de abordagem. Ainda existem muitos obstáculos para que possamos alcançar uma estratégia de controle de doenças baseada no bloqueio do patógeno no vetor mosquito.

Algumas dessas dificuldades estão relacionadas a questões técnicas e experimentais que precisamos resolver. Um obstáculo é, por exemplo, o desenvolvimento de mecanismos de condução genética, mecanismos que permitiriam eficientemente a disseminação desses genes resistentes nas populações. O campo científico da biologia de vetores de doenças sofreu um avanço significativo nas últimas 10 a 15 anos, principalmente devido ao reconhecimento de que a compreensão da biologia da interação entre insetos e patógenos poderia realmente nos ajudar a desenvolver estratégias de controle.

E esse reconhecimento levou a um aumento do financiamento para pesquisas nesta área. É extremamente importante que esse financiamento seja mantido e o compromisso continuado, para que possamos manter o impulso que alcançamos e cumprir nossa missão, compreendendo a biologia da interação entre vetores e patógenos e como podemos utilizar essa biologia para desenvolver estratégias de controle de doenças.