Ambientalmente induzido mudanças hereditárias em Linho

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método para cultivar uma variedade induzível de linho em condições que resultem em variação genômica herdável. Além disso, as alterações genômicas são monitoradas e o crescimento das plantas induzidas nas gerações subsequentes é observado em diversos ambientes. Para isso, o linho é cultivado sob uma variedade de condições indutoras.

O tecido foliar e do caule de Maris é então coletado em diversos momentos durante o crescimento das plantas sob os diferentes ambientes. Em seguida, o DNA e o RNA são isolados das amostras de tecido. O passo final do procedimento é realizar PCR usando as amostras de DNA e Q-R-T-P-C-R usando o RNA isolado para identificar alterações genômicas e alterações na expressão gênica resultantes do crescimento sob diferentes condições ambientais.

Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram a resposta genômica às condições de crescimento, com o aparecimento do elemento de inserção LIS-1 em um ponto específico do genoma e diferenças de expressão associadas à presença desse elemento, conforme visualizado por PCR e RT-PCR realizadas com ácidos nucleicos isolados dos tecidos de plantas tratadas. Olá, sou Chris Cull do Departamento de Biologia da Case Western Reserve University. Sou Cory Johnson do Laboratório Cull.

E eu sou Tiffany Moss, também do laboratório Cull. E eu sou Marshall Lucas, um aluno de graduação no programa de verão para pesquisa de graduação no laboratório Cull.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar alterações no genoma e na expressão gênica resultantes de variações no ambiente de crescimento. Então, vamos começar. Para cultivar linhaça em condições indutoras, inicie preenchendo vasos de cinco polegadas com solo e adubando.

Em seguida, plante três sementes de linhaça por vaso, a um quarto de polegada de profundidade. Depois, cubra as sementes com solo para as condições de controle não indutoras. Regue as plantas com 100 mililitros de uma solução de Miracle Grow em um décimo da concentração.

Trate as plantas em condições de alta nutrição com 100 mililitros de força total. Miracle Grow. Finalmente, aplique.

Apenas água da torneira para as plantas de baixo nutriente. Cultive as plantas sob luz natural durante o verão, conforme elas crescem. Regue todas as plantas por meio de um sistema de pulverização automático duas vezes ao dia, durante cinco minutos.

Aplicar as condições de crescimento às plantas uma vez por semana. Coletar as folhas nos caules mari em intervalos semanais. São coletadas seis folhas para extração de DNA, e três caules me são necessários para extração de RNA. Após a coleta, colocar o material vegetal em um tubo criogênico, congelar rapidamente em nitrogênio líquido e armazenar as amostras a menos 80 graus Celsius até a extração.

Os três genótipos crescem em taxas relativas diferentes dependendo das condições. Em condições controle, a variedade endogâmica de linhaça storm ou a linhagem PL cresce melhor. Várias linhagens foram derivadas desse progenitor, sendo a variedade grande ou L mais vigorosa do que a variedade pequena ou S.

No entanto, em condições de baixa disponibilidade de nutrientes, S cresce melhor do que L ou pl. E em condições de alta disponibilidade de nutrientes, L cresce melhor do que pl, que por sua vez cresce apenas ligeiramente melhor do que S. A comparação entre cada uma das linhagens cultivadas sob os três tratamentos diferentes revela que PL cresce melhor nas condições controle. L cresce melhor em condições de alta disponibilidade de nutrientes, e S cresce de forma semelhante tanto em condições de alta disponibilidade de nutrientes quanto em condições controle.

Esses dados mostram que as três linhagens podem ser diferenciadas com base em seu crescimento nos três ambientes. Enquanto PL e L crescem melhor em ambientes específicos, S cresce aproximadamente da mesma forma nas três condições. S não é capaz de aproveitar as condições de nutrientes melhoradas, mas é mais eficaz no crescimento sob condições de nutrientes muito baixas.

Para a extração de DNA, adicione o tampão AP1 do kit Qiagen DNeasy Plant DNA à seis folhas com areia estéril em um tubo microcêntrifuga e triture o tecido com uma haste de moagem até que nenhum grumo seja visível. Continue a extração seguindo as instruções do kit. Para iniciar a extração de RNA, transfira três caules de Maris mais algumas folhas adjacentes de um tubo criogênico para um tubo microcêntrifuga. Adicione areia estéril ao tubo e triture o tecido usando uma haste de moagem até obter uma pulverização fina.

Vortex a amostra por 15 segundos para auxiliar a lise, depois centrifugue por um minuto a 13.000 RPM para recolher a areia e quaisquer detritos. Adicione o SNAT à coluna de centrifugação e prossiga com a preparação do RNA conforme instruções do fabricante. Uma vez que o RNA seja extraído do tecido, transfira 10 XDNA buffer em um volume equivalente a um décimo do volume da amostra de RNA para a reação.

E com 30 unidades de DNase, incubar a reação a 37 graus Celsius por 30 minutos, seguido de 70 graus Celsius por cinco minutos. Realizar a transcrição reversa utilizando o kit RNA para cDNA da Applied Biosystems, conforme instruções do fabricante e do S. Incubar a reação a 37 graus Celsius por uma hora e, em seguida, a 95 graus Celsius por cinco minutos.

Por fim, aplique cinco microlitros do cDNA em um gel de agarose 1,5% para determinar o rendimento. Uma vez que o cDNA de linhaça tenha sido preparado, ele é utilizado para qPCR. Realize a qPCR utilizando um sistema ABI StepOne.

Realize todos os ensaios em triplicata para cada execução e use o gene de referência Acton como controle de número de cópias para preparar as reações de QPCR. Adicione um microlitro do par de primers apropriado a cada tubo. Dilua o DNA à concentração apropriada e adicione nove microlitros a cada tubo.

Finalmente, adicione 10 microlitros da mistura mestra PCR com corante ciber verde dois x a cada tubo. Em seguida, configure o programa de amplificação após a amplificação. Calcule os níveis relativos de expressão a partir do número de ciclos para o limiar, que é determinado pelos parâmetros padrão do software Step One e confirmado pela inspeção das curvas de amplificação.

A amplificação por PCR a partir do DNA, isolado de folhas em diferentes posições ao longo do caule, demonstra o aparecimento de um fragmento de DNA de 5,7 quilobases em cópia única, denominado sequência de inserção da linhagem, ou LIS um, quando as plantas são cultivadas em condições indutoras. A LIS um aparece quando a PL é cultivada em condições indutoras de baixo teor nutricional e eventualmente se torna homozigótica. Aqui, amostras de folhas de um a seis foram isoladas em intervalos semanais, sendo a amostra um a mais precoce após a semeadura. O DNA foi então extraído das amostras.

A amplificação por PCR revela a presença de ambas as extremidades do LAS um em todas as amostras, exceto na primeira. Isso corresponde ao desaparecimento do sítio inserido não cortado e nenhuma evidência dele na QPCR da quinta folha. Os resultados mostram que a presença do LAS um ou outras alterações genômicas associadas à indução afetam a expressão de genes na proximidade imediata de um S um.

Os seis genes mostrados aqui são todos diferencialmente expressos em PL e S; quatro dos genes apresentam maior expressão em PL, que não possui LIS um. Inversamente, dois apresentam maior expressão em S, que possui LIS um. Acabamos de mostrar como cultivar linhagens de linhaça induzíveis. Assim, o genoma se altera em resposta ao ambiente de crescimento e às características de crescimento das gerações subsequentes.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as condições de crescimento precisam ser replicadas para garantir a indução reprodutível de alterações. É isso aí. Sei que muitos de vocês são céticos em relação a este fenômeno, mas agora vocês podem reproduzir as observações por conta própria.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.