Name: Ambientalmente induzido mudanças hereditárias em Linho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a cultivar variedades de linho sob estresse nutricional para induzir variação genômica hereditária. Este método utiliza PCR e Q-R-T-P-C-R para monitorar mudanças genômicas e de expressão gênica em plantas.

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1. Crescimento de linho em condições induzir. <ol><li> 5 "panelas são preenchidos com terra e compactado. </li><li> Três sementes por vaso são plantadas ¼ de polegada de profundidade eo solo firmado sobre as sementes. </li><li> Os potes são, então, regada com 100ml de soluções adequadas de nutrientes <ol><li> A não-indução de controle (C) condições de usar uma força de 1 / 10 º Miracle-Gro a cada semana. A condição de alta de nutrientes (NPK tratamento) tinha plena força Miracle Grow aplicados semanalmente. Baixo de nutrientes - plantas só tinha água da torneira aplicadas em todo o seu crescimento. (Durrant 1971, Cullis, 1980). </li></ol></li><li> As plantas são cultivadas sob luz natural durante o verão. Durante o inverno, são cultivadas sob luzes de sódio com um 16 / 8 horas de ciclo claro / escuro. </li><li> Em intervalos semanais, folhas e meristemas são coletados. </li><li> O material vegetal é rápido congelados em nitrogênio líquido. </li></ol> Resultados Os três genótipos diferentes crescer a taxas relativas, dependendo das condições (Figura 1). Portanto, sob condições de controle da linha Pl cresce melhor com L sendo mais vigoroso que o S (Figura 1a). Em nutrientes baixa (água), S cresce melhor do que qualquer um L ou Pl (Figura 1b). Em nutrientes de alta (NPK) L cresce melhor do Pl que só cresce ligeiramente melhor do que S (Figura 1c). A comparação entre cada uma das linhas cultivadas sob os três tratamentos diferentes é mostrado na Figura 1 d - f. Pl cresce melhor em condições de controle (Figura 1d), o melhor L em nutrientes de alta (Figura 1e) e S de forma semelhante em ambos os nutrientes de alta e as condições de controle (Figura 1f). Estes dados mostram que as três linhas podem ser diferenciados com base no seu crescimento em três ambientes. De nota é que Pl cresce melhor nas condições de controle enquanto L cresce melhor nas condições NPK (em que foi induzida). S cresce quase o mesmo em todas as três condições, isto é, não é capaz de tirar proveito da melhoria das condições de nutrientes, mas é mais capaz de crescer sob condições muito baixo de nutrientes. Os parâmetros de crescimento que são relevantes para a diferenciação das plantas incluem a altura da planta (e associado a este comprimento de entrenós, isto é a distância entre cada folha), o tamanho da folha e do grau de ramificação. Para Pl sob condições de controle da planta é de altura com ramos e as folhas são verdes grandes e escuros. De acordo com os nutrientes da planta baixa é muito curto, a distância entre cada folha é também muito curto e as folhas são verde pequeno e leve. As folhas estão na ponta verde mais escuro do que as mais abaixo do tronco. Em nutrientes de alta da planta é muito parecido com que, sob condições de controle, exceto que ambos tronco principal e os brotos laterais são mais curtos do que nas plantas controle. Para o genotroph grandes as plantas são muito semelhantes aos de Pl exceto que o crescimento mais vigoroso em nutrientes sob alta. Novamente sob os nutrientes da planta baixa é muito pequena e tem folhas verde claro. O genotroph S cresce de forma semelhante em todos os três ambientes, embora as folhas são verde claro com os nutrientes baixa. No entanto, em condições de baixa de nutrientes do genotroph S é muito mais vigorosa do que qualquer uma das linhas ou Pl L. 2. RNA e DNA extrações de meristemas de linho e as folhas são feitas separadamente. A Roche total de RNA prep kit foi usado para a extração de RNA ea Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit foi usado para a extração de DNA. Extração de RNA <ol><li> 3 meristemas além de algumas folhas em redor são movidos de cryovial armazenamento em tubos eppendorf e colocados em nitrogênio líquido até estar pronto para ser moída. </li><li> Areia estéril é adicionado ao tubo e tecidos é terra usando um micropistilo até bem. </li><li> Lise 400 ul / buffer de ligação da Roche total de RNA prep kit é adicionado e tecidos é um terreno ainda mais até que não haja aglomerações são visíveis. </li><li> Amostra é agitadas por 15 segundos para ajudar lise e, em seguida, girou durante 1 min a 13.000 rpm para recolher areia e quaisquer detritos. </li><li> Sobrenadante é adicionado a girar coluna eo restante das instruções RNA prep kit são seguidas as instruções. </li></ol> DNAse tratamento <ol><li> 10/01 volume de amostra de RNA de tampão DNAse 10X é adicionado. </li><li> 30 unidades de DNAse é adicionado ea reação é incubada a 37 ° C por 30 min e 70 ° C por 5 min. </li></ol> Transcrição Reversa <ol><li> Applied Biosystems RNA para cDNA kit é usado como por direções, a reação incubados a 37 ° C por 1 hora e 95 ° C por 5 minutos. </li></ol> O cDNA é então usada na PCR ou para qPCR qPCR qPCR foi realizada utilizando um Passo ABI Um sistema. Todos os ensaios foram realizados em triplicata em cada execução. Do gene da actina foi usado como um controle do número de cópias comoo gene housekeeping melhor disponível. <ol><li> O par de primers apropriados foi adicionado a cada tubo em 1μl. </li><li> O cDNA foi diluído para a concentração adequada e 9μl adicionado a cada tubo </li><li> 10μl do Poder 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) e foi adicionado a cada tubo </li><li> O programa de amplificação programa foi: <ul><li> 10 minutos a 95 ° C </li><li> 40 ciclos de 15s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C </li></ul> Etapa de desnaturação térmica para verificar a especificidade de amplificação </li><li> Os níveis de expressão relativa foi determinada pelo valor de 2 (CTunknown - CTactin). </li></ol> Preparação de DNA <ol><li> Tampão AP1 da Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit é adicionado a 6 folhas com areia estéril em um tubo de microcentrífuga. O tecido é chão com micropistilo até que não haja aglomerações são visíveis. </li><li> As instruções do kit são seguidas as instruções. </li></ol> Resultados A amplificação do DNA isolado a partir de folhas em várias posições ao longo do tronco demonstra que o aparecimento do LIS-1 ocorre quando as plantas estão crescendo em condições indução (4). Os resultados mostram que a qPCR presença de LIS-1 (ou outras alterações genômicas associadas com a indução) afeta a expressão de genes nas imediações da LIS-1 (Figura 2). Os seis genes mostrado na Figura 2 são diferencialmente expressos em Pl e S com quatro ter maior expressão no PL (sem LIS-1) e dois com maior expressão em S (que tem LIS-1). Painel 1 e 2 são os dois genes mais próximo do ponto de inserção de LIS-1. A expressão destes genes s na genotroph grande (que teve mudanças induzidas, mas não tem LIS-1) ea expressão sob diferentes condições de crescimento serão necessários para determinar qualquer relação causal entre LIS-1 e as mudanças de expressão. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Pl, L e S cultivadas sob três diferentes regimes de nutrientes. Painéis a - controle, b - nutrientes baixo e c - NPK. d - Pl, e - S, f - Painéis L. d - f, da esquerda para a direita: baixo nutrientes, controle e NPK. D - Pl, e - L, F - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="Polegar da Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2 polegar"> Figura expressão gênica 2. Torno do ponto de inserção do LIS-1. Gene 1 (Inibidor de crescimento) é imediatamente 5 'para LIs1 eo gene 2 (Kip relacionados ciclina-dependente ID inibidor da quinase 3 "da LIS-1. Os genes que as outras pessoas ao longo do mesmo andaime (~ 500kb) construído a partir do sequência completa do genoma de linho. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">clique aqui para ver uma figura maior</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Amplificações PCR de DNA extraído de folhas individuais de plantas de Stormont Cirrus cultivadas sob condições de baixa de nutrientes. Os produtos de PCR foram separados em 2% gel agarose-TBE. O site uninserted é mostrado no painel, as duas extremidades do site inseridos são mostrados em painéis b e c. Amostras de folhas 1-6 foram isoladas em intervalos semanais, com a amostra 1 sendo o mais antigo após a semeadura.

<ol><li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li>
<li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li>
<li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environmentally+induced+adaptive+%28%3F%29+insertion+event+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Genet.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Linho parece ter um genoma inerentemente instável. Um certo número de variedades de linho de fibra comercial rapidamente se tornar não-uniforme, quando cultivada por algumas gerações. As mesmas observações não parecem verdadeiras para as variedades de linho de óleo. Portanto, parece haver uma associação entre a seleção para qualidade da fibra e da instabilidade do genoma. O ambientalmente induzida mudanças hereditárias em linho foram originalmente identificados através da investigação das observações agronômicas do crescimento da safra de fibra. Estas observações específicas repetível de variações fenotípicas e genômica levanta a questão de como o estresse ambiental pode influenciar o conjunto de rearranjos genômicos que podem ocorrer. O aparecimento repetido de LIS-1 em resposta a ambientes particulares é consistente com essa mutação ser direta ou indiretamente selecionado. O crescimento das linhas induzidas por vários tratamentos também indica um melhor desempenho nas condições indução relevantes. As mudanças na expressão também associada com a presença de LIS-1 novamente indica que essa inserção afetar o desempenho da planta. A apresentação de vídeo oferece um fórum para observar as mudanças fenotípicas da planta de uma forma impossível de transmitir através de material impresso tradicional.

<ul><li> Sementes de linho do original variedade Cirrus Stormont denotado Pl e genotrophs L e S. </li><li> 5 &quot;panelas </li><li> envasamento solo </li><li> Miracle-Gro </li><li> estufa </li><li> Lâmpadas de sódio de alta pressão </li><li> Nitrogênio líquido </li><li> Argamassa e pilões </li><li> Micropestles e tubos de microcentrífuga </li><li> Termociclador </li><li> Agarose equipamentos de eletroforese em gel </li><li> Imagem digital de instalação </li><li> StepOne qPCR módulo </li><li> Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit </li><li> Applied Biosystems RNA para cDNA kit </li><li> Roche total de RNA prep kit </li></ul>

ambientalmente induzido mudanças hereditárias em linho

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Algumas variedades de linho respondem ao estresse de nutrientes, modificando seu genoma e estas modificações podem ser herdadas por várias gerações. Também associados a essas alterações genômicas são hereditárias 1,2 variações fenotípicas. A variedade de linho Stormont Cirrus (Pl) quando cultivados sob três diferentes condições de nutrientes pode permanecer induzível (nas condições de controle), ou tornar-se estavelmente modificado para tanto o genotroph grande ou pequena pelo crescimento sob condições de alta ou baixa de nutrientes, respectivamente. As linhas resultantes do crescimento inicial em cada uma dessas condições parecem crescer melhor quando cultivadas sob as mesmas condições nas gerações posteriores, nomeadamente a linha Pl cresce melhor sob o tratamento controle, indicando que as plantas crescem sob ambos os nutrientes de alta e baixa estão sob stress. Uma das alterações genômicas que estão associados com a indução de mudanças hereditárias é o aparecimento de um elemento de inserção (LIS-1) 3, 4, enquanto as plantas estão crescendo sob o estresse de nutrientes. Com relação a este evento de inserção, a variedade de linho Stormont Cirrus (Pl) quando cultivados sob três diferentes condições de nutrientes pode permanecer inalterada (nas condições de controle), têm a inserção aparecem em todas as plantas (em nutrientes baixa) e ter esse transmitida para a próxima geração, ou a inserção (ou partes dela) aparecer, mas não são transmitidos através das gerações (com nutrientes de alta) 4. A frequência do aparecimento dessa inserção indica que ele está sob seleção positiva, que também é consistente com a resposta de crescimento em gerações subseqüentes. Folhas ou meristemas colhidas em vários estágios de crescimento são usadas para DNA e RNA de isolamento. O RNA é usado para identificar a variação na expressão associada ao crescimento ambientes diversos e / ou t ele presença / ausência de LIS-1. O DNA isolado é usado para identificar as plantas em que a inserção ocorreu.

Crescendo algumas variedades de linho com resultados de tensão de nutrientes em variações genômicas dentro de um subconjunto do genoma e da variação fenotípica. A inserção complexo em um local específico está associado com o crescimento sob vários regimes de nutrientes e com mudanças na expressão gênica em torno deste site.

Ambientalmente induzido mudanças hereditárias em Linho

Algumas variedades de linho respondem ao estresse nutricional modificando seu genoma, e essas modificações podem ser herdadas por muitas gerações. Além disso...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método para cultivar uma variedade induzível de linho em condições que resultem em variação genômica herdável. Além disso, as alterações genômicas são monitoradas e o crescimento das plantas induzidas nas gerações subsequentes é observado em diversos ambientes. Para isso, o linho é cultivado sob uma variedade de condições indutoras.O tecido foliar e do caule de Maris é então coletado em diversos momentos durante o crescimento das plantas sob os diferentes ambientes. Em seguida, o DNA e o RNA são isolados das amostras de tecido. O passo final do procedimento é realizar PCR usando as amostras de DNA e Q-R-T-P-C-R usando o RNA isolado para identificar alterações genômicas e alterações na expressão gênica resultantes do crescimento sob diferentes condições ambientais.Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram a resposta genômica às condições de crescimento, com o aparecimento do elemento de inserção LIS-1 em um ponto específico do genoma e diferenças de expressão associadas à presença desse elemento, conforme visualizado por PCR e RT-PCR realizadas com ácidos nucleicos isolados dos tecidos de plantas tratadas. Olá, sou Chris Cull do Departamento de Biologia da Case Western Reserve University. Sou Cory Johnson do Laboratório Cull.E eu sou Tiffany Moss, também do laboratório Cull. E eu sou Marshall Lucas, um aluno de graduação no programa de verão para pesquisa de graduação no laboratório Cull.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar alterações no genoma e na expressão gênica resultantes de variações no ambiente de crescimento. Então, vamos começar. Para cultivar linhaça em condições indutoras, inicie preenchendo vasos de cinco polegadas com solo e adubando.Em seguida, plante três sementes de linhaça por vaso, a um quarto de polegada de profundidade. Depois, cubra as sementes com solo para as condições de controle não indutoras. Regue as plantas com 100 mililitros de uma solução de Miracle Grow em um décimo da concentração.Trate as plantas em condições de alta nutrição com 100 mililitros de força total. Miracle Grow. Finalmente, aplique.Apenas água da torneira para as plantas de baixo nutriente. Cultive as plantas sob luz natural durante o verão, conforme elas crescem. Regue todas as plantas por meio de um sistema de pulverização automático duas vezes ao dia, durante cinco minutos.Aplicar as condições de crescimento às plantas uma vez por semana. Coletar as folhas nos caules mari em intervalos semanais. São coletadas seis folhas para extração de DNA, e três caules me são necessários para extração de RNA. Após a coleta, colocar o material vegetal em um tubo criogênico, congelar rapidamente em nitrogênio líquido e armazenar as amostras a menos 80 graus Celsius até a extração.Os três genótipos crescem em taxas relativas diferentes dependendo das condições. Em condições controle, a variedade endogâmica de linhaça storm ou a linhagem PL cresce melhor. Várias linhagens foram derivadas desse progenitor, sendo a variedade grande ou L mais vigorosa do que a variedade pequena ou S.No entanto, em condições de baixa disponibilidade de nutrientes, S cresce melhor do que L ou pl. E em condições de alta disponibilidade de nutrientes, L cresce melhor do que pl, que por sua vez cresce apenas ligeiramente melhor do que S. A comparação entre cada uma das linhagens cultivadas sob os três tratamentos diferentes revela que PL cresce melhor nas condições controle. L cresce melhor em condições de alta disponibilidade de nutrientes, e S cresce de forma semelhante tanto em condições de alta disponibilidade de nutrientes quanto em condições controle.Esses dados mostram que as três linhagens podem ser diferenciadas com base em seu crescimento nos três ambientes. Enquanto PL e L crescem melhor em ambientes específicos, S cresce aproximadamente da mesma forma nas três condições. S não é capaz de aproveitar as condições de nutrientes melhoradas, mas é mais eficaz no crescimento sob condições de nutrientes muito baixas.Para a extração de DNA, adicione o tampão AP1 do kit Qiagen DNeasy Plant DNA à seis folhas com areia estéril em um tubo microcêntrifuga e triture o tecido com uma haste de moagem até que nenhum grumo seja visível. Continue a extração seguindo as instruções do kit. Para iniciar a extração de RNA, transfira três caules de Maris mais algumas folhas adjacentes de um tubo criogênico para um tubo microcêntrifuga. Adicione areia estéril ao tubo e triture o tecido usando uma haste de moagem até obter uma pulverização fina.Vortex a amostra por 15 segundos para auxiliar a lise, depois centrifugue por um minuto a 13.000 RPM para recolher a areia e quaisquer detritos. Adicione o SNAT à coluna de centrifugação e prossiga com a preparação do RNA conforme instruções do fabricante. Uma vez que o RNA seja extraído do tecido, transfira 10 XDNA buffer em um volume equivalente a um décimo do volume da amostra de RNA para a reação.E com 30 unidades de DNase, incubar a reação a 37 graus Celsius por 30 minutos, seguido de 70 graus Celsius por cinco minutos. Realizar a transcrição reversa utilizando o kit RNA para cDNA da Applied Biosystems, conforme instruções do fabricante e do S. Incubar a reação a 37 graus Celsius por uma hora e, em seguida, a 95 graus Celsius por cinco minutos.Por fim, aplique cinco microlitros do cDNA em um gel de agarose 1,5% para determinar o rendimento. Uma vez que o cDNA de linhaça tenha sido preparado, ele é utilizado para qPCR. Realize a qPCR utilizando um sistema ABI StepOne.Realize todos os ensaios em triplicata para cada execução e use o gene de referência Acton como controle de número de cópias para preparar as reações de QPCR. Adicione um microlitro do par de primers apropriado a cada tubo. Dilua o DNA à concentração apropriada e adicione nove microlitros a cada tubo.Finalmente, adicione 10 microlitros da mistura mestra PCR com corante ciber verde dois x a cada tubo. Em seguida, configure o programa de amplificação após a amplificação. Calcule os níveis relativos de expressão a partir do número de ciclos para o limiar, que é determinado pelos parâmetros padrão do software Step One e confirmado pela inspeção das curvas de amplificação.A amplificação por PCR a partir do DNA, isolado de folhas em diferentes posições ao longo do caule, demonstra o aparecimento de um fragmento de DNA de 5,7 quilobases em cópia única, denominado sequência de inserção da linhagem, ou LIS um, quando as plantas são cultivadas em condições indutoras. A LIS um aparece quando a PL é cultivada em condições indutoras de baixo teor nutricional e eventualmente se torna homozigótica. Aqui, amostras de folhas de um a seis foram isoladas em intervalos semanais, sendo a amostra um a mais precoce após a semeadura. O DNA foi então extraído das amostras.A amplificação por PCR revela a presença de ambas as extremidades do LAS um em todas as amostras, exceto na primeira. Isso corresponde ao desaparecimento do sítio inserido não cortado e nenhuma evidência dele na QPCR da quinta folha. Os resultados mostram que a presença do LAS um ou outras alterações genômicas associadas à indução afetam a expressão de genes na proximidade imediata de um S um.Os seis genes mostrados aqui são todos diferencialmente expressos em PL e S; quatro dos genes apresentam maior expressão em PL, que não possui LIS um. Inversamente, dois apresentam maior expressão em S, que possui LIS um. Acabamos de mostrar como cultivar linhagens de linhaça induzíveis. Assim, o genoma se altera em resposta ao ambiente de crescimento e às características de crescimento das gerações subsequentes.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as condições de crescimento precisam ser replicadas para garantir a indução reprodutível de alterações. É isso aí. Sei que muitos de vocês são céticos em relação a este fenômeno, mas agora vocês podem reproduzir as observações por conta própria.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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