Ambientalmente induzido mudanças hereditárias em Linho

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método para o cultivo de uma variedade de linho induzível sob condições que resultem em variação genômica hereditária. Além disso, as mudanças genômicas são monitoradas e o crescimento das plantas induzidas nas gerações subsequentes é observado nos vários ambientes. Para conseguir isso, o linho é cultivado sob uma variedade de condições indutoras.

O tecido da folha e do caule de Maris é então coletado em vários momentos durante o crescimento das plantas nos vários ambientes. Em seguida, DNA e RNA são isolados das amostras de tecido. A etapa final do procedimento é realizar PCR usando as amostras de DNA e Q-R-T-P-C-R usando o RNA isolado para identificar alterações genômicas e alterações de expressão gênica resultantes do crescimento em diferentes condições ambientais.

Em última análise, os resultados podem ser obtidos para mostrar a resposta genômica às condições de crescimento com o aparecimento do LIS um elemento de inserção em um ponto específico do genoma e as diferenças de expressão associadas à presença desse elemento, conforme visualizado por PCR e R-T-P-C-R realizado com ácido nucléico isolado dos tecidos das plantas tratadas. Olá, sou Chris Cull, do Departamento de Biologia da Case Western Reserve University. Eu sou Cory Johnson do Cull Lab.

E eu sou Tiffany Moss, também do laboratório de abate. E eu sou Marshall Lucas. Um estudante de graduação no programa de verão para pesquisa de graduação no laboratório Cull.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar mudanças no genoma e na expressão gênica resultantes de variações no ambiente de crescimento. Então vamos começar. Para cultivar linho sob condições indutoras, comece enchendo vasos de cinco polegadas com terra e firmando.

Próxima planta, três sementes de linho por vaso, um quarto de polegada de profundidade. Em seguida, do solo sobre as sementes para as condições de controle não indutoras. Regue as plantas com 100 mililitros de uma solução de cultivo milagroso de 10ª força.

Trate as plantas em condições de alto teor de nutrientes com 100 mililitros de força total. Milagre crescer. Finalmente aplique.

Apenas água da torneira para as plantas com baixo teor de nutrientes. Cultive as plantas sob luz natural durante o verão, à medida que as plantas crescem. Regue todas as plantas por um sistema de pulverização automática duas vezes ao dia por cinco minutos.

Aplique as condições de crescimento nas plantas uma vez por semana. Colete as folhas em caules de mari em intervalos semanais. Seis folhas são coletadas para extração de DNA e três hastes são necessárias para extração de RNA após a coleta, coloque o material vegetal em um frasco criogênico, congele-o rapidamente em nitrogênio líquido e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até serem extraídas.

Os três genótipos crescem em taxas relativas diferentes, dependendo das condições. Sob condições de controle, a variedade de linho endogâmico storm ou a linha PL cresce melhor. Várias linhagens foram derivadas deste pai, com uma variedade grande ou L sendo mais vigorosa do que a variedade pequena ou S.

No entanto, sob baixos nutrientes, S cresce melhor do que L ou pl. E sob condições de alto teor de nutrientes, L cresce melhor do que pl, que cresce apenas um pouco melhor do que S.A comparação entre cada uma das linhagens cultivadas sob os três tratamentos diferentes revela que o PL cresce melhor sob condições de controle. L cresce melhor em condições de alto teor de nutrientes e S cresce de forma semelhante em condições de alto teor de nutrientes e controle.

Esses dados mostram que as três linhagens podem ser diferenciadas com base em seu crescimento nos três ambientes. Enquanto PL e L crescem melhor em ambientes específicos, S cresce aproximadamente da mesma forma em todas as três condições. S não é capaz de tirar proveito de melhores condições de nutrientes, mas é mais capaz de crescer em condições de nutrientes muito baixos.

Para extração de DNA, adicione tampão, AP um da planta Qiagen, DNEZ, kit de preparação de DNA a seis folhas com areia estéril em um tubo de micro fuga, triture o tecido com um micro pilão até que nenhum aglomerado seja visível. Continue a extração seguindo as instruções do kit conforme as instruções para iniciar a transferência de extração de RNA, três hastes de maris mais algumas folhas circundantes de um frasco criogênico de armazenamento para um tubo de microfuga. Adicione areia estéril ao tubo e triture o tecido usando um micropilão até ficar bem moído.

Vortex a amostra por 15 segundos para ajudar na lise e, em seguida, gire por um minuto a 13.000 RPM para coletar areia e quaisquer detritos. Adicione o SNAT à coluna de rotação e continue com a preparação do RNA de acordo com as instruções do fabricante. Uma vez que o RNA é extraído do tecido, transfira 10 tampão XDNA em um décimo do volume da amostra de RNA para a reação.

E a 30 unidades de D Ns, incube a reação a 37 graus Celsius por 30 minutos, seguida de 70 graus Celsius por cinco minutos. Realize a transcrição reversa usando o kit de RNA para CD NA aplicado aos biossistemas. De acordo com as instruções dos fabricantes e S, incube a reação a 37 graus Celsius por uma hora e depois a 95 graus Celsius por cinco minutos.

Por fim, execute cinco microlitros de CDNA em um gel AROS a 1,5% para determinar o rendimento. Uma vez que o CD NA de linho tenha sido preparado, ele é usado para QPCR. Realize o QPCR usando um sistema A BI Step one.

Realize todos os ensaios em triplicado para cada execução e use o Gene Acton de manutenção como um controle de número de cópias para preparar as reações para QPCR. Adicione um microlitro do par de primers apropriado a cada tubo. Diluir o CD NA até a concentração apropriada e adicionar nove microlitros a cada tubo.

Por fim, adicione 10 microlitros da mistura mestre de PCR verde dois x cyberg a cada tubo. Em seguida, configure o programa de amplificação após a amplificação. Calcule os níveis de expressão relativos a partir do número do ciclo para o limite, que é determinado pelos parâmetros padrão no software da etapa um e confirmado pela inspeção das curvas de amplificação.

A amplificação por PCR a partir do DNA, isolada das folhas em várias posições ao longo do caule, demonstra o aparecimento de uma única cópia de 5,7 kilobase, fragmento de DNA denominado sequência de inserção de linha, ou LIS um quando as plantas são cultivadas sob condições indutoras. LIS um aparece quando o PL é cultivado em condições de baixa indução de nutrientes e, eventualmente, torna-se homozigoto. Aqui. As amostras de folhas de um a seis foram isoladas em intervalos semanais, sendo a amostra um a mais antiga após a extração do DNA de costura das amostras.

A amplificação por PCR revela a presença de ambos os terminais de LAS um em todas as amostras, exceto no primeiro. Isso corresponde ao desaparecimento do local inserido pelas unins e nenhuma evidência disso pelo QPCR da quinta folha. Os resultados mostram que a presença de LAS um ou outras alterações genômicas associadas à indução afetam a expressão de genes nas imediações de um S.

Os seis genes mostrados aqui são todos diferencialmente expressos em PL e S quatro dos genes têm maior expressão em PL, que não possui LIS um. Por outro lado, dois têm maior expressão em S, que tem LIS um, Acabamos de mostrar como cultivar linhas de linho induzíveis. Portanto, o genoma muda em resposta ao ambiente de crescimento e às características de crescimento das gerações subsequentes.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que as condições de crescimento precisam ser replicadas para a indução reprodutível de alterações. Então é isso. Eu sei que muitos de vocês são céticos em relação a esse fenômeno, mas agora vocês podem reproduzir as observações por si mesmos.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.