Análise de células-tronco pluripotentes usando criosecções dos corpos embrióides
December 8th, 2010
Células-tronco pluripotentes de crescimento em suspensão se diferenciar em corpos embrióides (EBs). Aqui demonstramos como obter criosecções de alta qualidade EB útil para estudar os aspectos celulares e moleculares da embriogênese, preservando a sua organização como agregados.
Parte Um, Introdução. Olá, meu nome é Rafael. Sou pós-doutoranda no Professor Stevens Hans Lab da Universidade Federal do Rio de Janeiro, no Brasil.
Olá, meu nome é Ismail. Sou assistente de pesquisa, também professor. Neste vídeo, mostraremos como preparar seções claras de corpos Android.
Então vamos começar. Parte dois, materiais e equipamentos. Para este procedimento, precisaremos de um meio de incorporação para amostras congeladas.
Solução de aldeído paraforme a 4% para fixação das células, soluções de sacarose para crioproteção. Uma agulha com a ponta ligeiramente dobrada, um microscópio estéreo para melhor visualização do EBS e um agitador. Parte três.
Aqui, os corpos embrionários humanos estão sendo cultivados em placas de cultura não aderentes. Usando uma pipeta, agrupamos todos os corpos embrionários o mais próximo possível para transferi-los para um tubo cônico de 15 mililitros. Os EBS são cuidadosamente colhidos e transferidos para o tubo.
É importante coletar todos os EBS, pois não há uma grande quantidade de material Após a decantação dos EBS, os meios de cultura são cuidadosamente descartados. Você deve ser capaz de ver o pellet no fundo do tubo. Agora podemos prosseguir para o procedimento de fixação.
O EBS será fixado em solução de aldeído paraforme a 4% em PBS ou solução salina tamponada com fosfato. É importante ressuspender o pellet com solução de PFA. Os EBS são então fixados em solução de fixação por 30 minutos.
Após a fixação, a solução de PFA é cuidadosamente removida. Tomando cuidado para evitar que o Resus suspenda o EBS e seja substituído por uma solução de sacarose a 10% em PBS para iniciar a crioproteção do ebs, o material é mantido por 30 minutos nesta solução. Em seguida, removemos cuidadosamente a solução de sacarose a 10% e ressuspendemos o EBS em uma solução de sacarose a 20%.
Mais uma vez, os EBS são mantidos por 30 minutos nesta solução. Finalmente, a solução de sacarose a 20% é removida e substituída por uma solução de sacarose a 30% em PBS, onde é mantida por mais 30 minutos. Agora podemos prosseguir para a orientação e bloqueio de ebs.
Em nosso laboratório, usamos invólucros de cápsulas vazias como moldes. Para o bloqueio do ebs, é importante revestir as paredes internas da ponta com solução de sacarose antes de coletar o ebs. Agora podemos coletar cuidadosamente o EBS e esperar até que ele decanta até o fundo da ponta.
Em seguida, o EBS é colocado no centro do bloco. Esta deve ser a posição final do EBS dentro do bloco. Com a ajuda de um microscópio estéreo e uma ponta fina, coletamos e descarregamos o máximo possível de solução de sacarose.
Sempre tomando cuidado para não coletar o ebs. Usando uma agulha com a ponta ligeiramente dobrada, todos os EBS são posicionados no centro do bloco. Finalmente, a solução de sacarose restante é coletada com pedaços de papel de filtro.
A localização específica do EBS dentro do bloco é muito importante para a obtenção de fatias de boa qualidade. Aqui está um exemplo de mau posicionamento EB dentro do shell. Após o posicionamento do EBS e a remoção da solução de sacarose, a casca é preenchida com OCT começando pelas bordas, sempre tomando cuidado para evitar que o Resus suspenda o ebs.
As bolhas restantes são removidas usando uma pipeta e as cascas são agitadas por 15 minutos. Após agitação. O bloco OCT é congelado em gelo seco.
Neste ponto, você pode armazenar o bloco envolto em papel alumínio a menos 80 graus Celsius para análise posterior ou prosseguir para o criostato Parte quatro, Corte. Para fazer as seções criogênicas, você precisará de uma lâmina descartável ou permanente, OCT e lâminas de vidro pré-tratadas com poli L lisina. O bloco OCT é removido do freezer e mantido dentro do criostato até atingir 20 graus Celsius negativos.
O bloco é então posicionado no suporte e alinhado paralelamente à borda da lâmina. As amostras de EB são muito menores do que a maioria das outras amostras de tecido, por isso é muito importante ter certeza de que toda a superfície do bloco toca a lâmina ao mesmo tempo, minimizando assim a perda de material. Depois de posicionado, o bloco é cortado em fatias de 10 micrômetros, que são coletadas diretamente nas lâminas de vidro.
As lâminas podem ser armazenadas, de preferência a 70 graus Celsius negativos, ou também podem ser usadas no mesmo dia. O material pode ser corado para imuno-histoquímica ou imunofluorescência. Conclusão. O método aqui descrito fornece um protocolo razoavelmente barato e fácil de seguir para obter seções finas de criostato de corpos embrionários desenvolvidos a partir de linhagens de células-tronco H nove humanas ou US P um de camundongo.
As seções criogênicas resultantes podem ser usadas em uma ampla variedade de procedimentos para analisar a expressão proteica ou a morfologia da EB.
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Visão Geral
Este artigo demonstra o processo de obtenção de criossecções de alta qualidade de corpos embrionários (EBs) derivados de células-tronco pluripotentes cultivadas em suspensão. Essas criossecções são essenciais para estudar os aspectos celulares e moleculares da embriogênese, mantendo a organização dos EBs.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Biologia das Células-Tronco
- Embriogênese
- Diferenciação Celular
Fundamentos
- Células-tronco pluripotentes podem se diferenciar em vários tipos celulares.
- Corpos embrionários são agregados que imitam o desenvolvimento embrionário precoce.
- Estudar EBs ajuda a entender os mecanismos da embriogênese.
- Criossecções de alta qualidade são cruciais para análise detalhada.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método para preparar criossecções de EBs.
- Facilitar o estudo dos processos celulares e moleculares durante a diferenciação.
- Preservar a organização estrutural dos EBs na análise.
Métodos Utilizados
- Preparação de células-tronco pluripotentes em cultura de suspensão.
- Indução de diferenciação em corpos embrionários.
- Técnicas de criossecções para obter amostras de alta qualidade.
- Análise das características celulares e moleculares dos EBs.
Principais Resultados
- Preparação bem-sucedida de criossecções de EBs.
- Preservação da organização dos EBs nas criossecções.
- Capacidade aprimorada para estudar a embriogênese em nível celular.
- Método demonstrado pode ser aplicado a vários contextos de pesquisa.
Conclusões
- O método permite uma análise detalhada dos EBs.
- Criossecções de alta qualidade são valiosas para estudos embrionários.
- Esta abordagem pode avançar a compreensão da diferenciação das células-tronco.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
High-quality cryosectioning of embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells enables precise spatial analysis of differentiation markers and tissue organization, supporting early discovery and target validation in regenerative medicine and developmental biology. This capability enhances predictive confidence in stem cell-based models and informs risk-adjusted decisions at key inflection points in the discovery pipeline. Reliable EB cryosections facilitate cross-functional data integration for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pluripotency and lineage-specific marker expression within three-dimensional EB structures.
- Supports biological de-risking by clarifying differentiation pathways and cellular heterogeneity.
- Provides spatial context for functional target validation in stem cell-derived systems.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized EB cryosections for reproducible immunofluorescence and in situ hybridization assays.
- Enables quantitative assessment of protein and RNA distribution across EB sections.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening in stem cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with in vivo developmental processes for disease-relevant modeling.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by preserving EB architecture and marker localization.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This cryosectioning method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation studies through assay development and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pluripotency and lineage commitment within EBs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for marker expression and tissue organization.
- Analytics: Enables spatially resolved measurements for comparative analysis of differentiation conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo developmental relevance when supported by marker expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for EB analysis applicable across multiple stem cell lines and differentiation protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and target validation.
- Operational Value: Standardizes EB sectioning for reproducible downstream analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust spatial and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and handling of delicate three-dimensional cell aggregates.
- Needs access to cryostats, embedding media, and imaging infrastructure for downstream analysis.
- Demands cross-team standardization of EB preparation and sectioning protocols.
- Adaptable to various pluripotent stem cell lines and differentiation models with attention to EB size and morphology.
- Dependent on careful orientation and embedding to ensure high-quality, interpretable sections.
