Name: Análise de células-tronco pluripotentes usando criosecções dos corpos embrióides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprenda a preparar criosecções de corpos embrióides derivados de células-tronco pluripotentes. Este método preserva a organização estrutural e permite análise detalhada dos processos celulares e moleculares durante a embriogênese.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo Pesquisa um do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Somos gratos a Bruna Paulsen e S. M. Aline Fernandes para as imagens EB.

1. Fixação e Criopreservação Células-tronco pluripotentes foram cultivados em fibroblastos de rato embrionárias (MEF) inativados com mitomicina C e mantidos em DMEM/F12 suplementado com a substituição knockout 20% de soro (KSR) e 8ng / mL do fator de crescimento de fibroblastos (FGF-2). , A fim de induzir a formação de células H9 EB foram transferidos para a não-aderente pratos e cultivadas por 7 dias, mantidos em DMEM/F12 suplementado com 15% KSR 8. Nota (!): Esta técnica pode ser usada para EBs derivado de uma célula embrionária e induziu-tronco pluripotentes. <ol><li> Recolher as EBs da placa de cultura com uma pipeta. </li><li> EBs transferência para um tubo cônico de 15 mL e espere até que o material se deposita no fundo do tubo. </li><li> Remova o meio e corrigir EBs com paraformaldeído a 4% (PFA) em solução de PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. Nota (!): Para a recuperação de hibridização in situ antígeno deve ser feito para evitar a reação de ligação cruzada com anticorpos, devido à utilização de PFA 6,7. </li><li> Remoção da solução de PFA e lavar com PBS por 5 min. </li><li> EBs deve ser colocado em diluição em série da PBS-buffered soluções de sacarose (10, 20 e 30%, em seqüência) a 25-28 ° C, cada solução deve ser substituído a cada 30 min. O material pode ser estocado em solução de sacarose 30% a 4 ° C até a etapa de incorporação com outubro </li></ol> 2. A incorporação de tecido de Orientação e Congelamento <ol start="6"><li> Cuidadosamente recolher os EBs do tubo. Descarga da solução de sacarose, tanto quanto possível. Nota (!): É importante para molhar a parede interna da ponta com a solução de sacarose antes de coletar a EBs. Este procedimento pode evitar EB para ser acoplado à extremidade. </li><li> EBs lugar no molde e remoção da solução de sacarose restante com papel de filtro. Nota (!): É importante para não encher o molde com EBs de evitar sobreposições. </li><li> Preencha o molde com outubro lentamente, tomando cuidado para não re-suspender EBs. Depois disso, coloque todas as EB no centro do molde e remover as bolhas com a pipeta. </li><li> Ligeiramente agitar por 15 minutos. </li><li> Cercam o molde com gelo seco moído para congelar a amostra. Outubro deve ser totalmente congelado. Neste ponto, os blocos podem ser armazenadas a -70 ° C, durante pelo menos um ano. </li></ol> 3. Cryosectioning Técnica <ol start="11"><li> Remover o bloco congelado entre -70 ° C e colocar no criostato previamente resfriado a uma temperatura entre -18 e -21 ° C. Nota (!): Temperaturas fora dessa faixa podem causar problemas como seções curling, derretimento ou rachaduras. </li><li> Retire o bloco de outubro do molde e coloque-o no suporte de criostato, adicionando outubro mais. </li><li> É importante orientar o bloco corretamente e alinhá-la paralelamente à borda da lâmina. Nota (!): Como EBs são menores do que outras amostras de tecido, esta etapa é extremamente importante para minimizar a perda de material. </li><li> Blocos de outubro deve ser seccionado superficialmente até que o plano de superfície é obtida. Cortes finos (10μm) da amostra de tecido devem ser tomados e montados em lâminas de vidro previamente revestido com 200 mg / mL poli L lisina (10 mL por slide) 9,10. Nota (!): Para evitar seções torned prestar atenção a qualquer danos na lâmina. </li><li> Todas as seções devem ser secas ao ar por 1 hora à temperatura ambiente e depois ser usado ou armazenado a -70 ° C até o uso. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-117 (1998).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6, 88-95 (2000).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+embryoid+body+formation%3A+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).</li>
<li>Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+propagation+and+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).</li>
<li>Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+combined+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry.</a> Mol Cells. 24, 76-82 (2007).</li>
<li>Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).</li>
<li>Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+modulate+cell+survival+in+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies.</a> Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).</li>
<li>Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+section+adhesion+for+immunocytochemistry+using+high+molecular+weight+polymers+of+L-lysine+as+a+slide+coating%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating.</a> Histochemistry. 77, 275-279 (1983).</li>
<li>Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+specific+relaxin-binding+cells+in+thecervix%2C+mammary+glands%2C+and+nipples+of+pregnant+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats.</a> Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito aqui fornece um fácil de seguir o protocolo para obter PFA seções fixas criostato fina de corpos embrióides útil para imunofluorescência e em ensaios de hibridização in situ. O criosecções resultando permitir o estudo de aspectos celulares e moleculares da embrionárias humanas diferenciação de células-tronco, preservando a sua estrutura e organização como agregados.

<table><tbody><tr><td>Sacarose D (+)</td><td>Reagente</td><td>Vetec</td><td>228</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Reagente</td><td>Rieden-de Ha&amp;#235;n</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>Solução de PBS</td><td>Reagente</td><td>LGC Biotecnologia</td><td>13-30259.05</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina hidrobrometo</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>200mg/mL em água</td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Reagente</td><td>Sakura Finetek</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Sacarose</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>Solução de 10% de Sacarose em PBS, p/v</td></tr><tr><td>Solução de Sacarose</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>Solução de 20% de Sacarose em PBS, p/v</td></tr><tr><td>Solução de Sacarose</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>Solução de 30% de Sacarose em PBS, p/v</td></tr><tr><td>Tubo cônico</td><td>Ferramenta</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td>Tubo cônico de 15 mL</td></tr><tr><td>Agitador de placas</td><td>Ferramenta</td><td>Biomixer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Ferramenta</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>Molde para plataforma OCT</td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td><td>Plataforma de molde plástico</td></tr></tbody></table>

análise de células-tronco pluripotentes usando criosecções dos corpos embrióides

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

-Tronco embrionárias (ES) são células pluripotentes derivadas da massa celular interna do blastocisto estágio precoce de embriões de mamíferos 1. A fase crucial na diferenciação de células-tronco embrionárias é a formação de corpos embrióides (EBs) agregados 2, 3. EB formação é baseada na agregação espontânea, quando as células ES são cultivadas em placas não aderente. Recapitula tridimensional EB muitos aspectos da embriogênese de mamíferos cedo e se diferenciam em três camadas germinativas: ectoderma, mesoderma e endoderma 4. Imunofluorescência e hibridização in situ são amplamente utilizadas técnicas para a detecção de proteínas-alvo e mRNA presente nas células de uma secção de tecido 5, 6, 7. Aqui nós apresentamos uma técnica simples para gerar criosecções alta qualidade dos corpos embrióides. Esta abordagem baseia-se na orientação espacial do EB incorporação em outubro seguido pela técnica cryosection. As seções resultante pode ser submetida a uma ampla variedade de procedimentos analíticos, a fim de caracterizar as populações de células que contêm certas proteínas, RNA ou DNA. Neste sentido, a preparação da EB criosecções (10μm) são ferramentas essenciais para análise histológica coloração (por exemplo, Hematoxilina e Eosina, DAPI), imunofluorescência (por exemplo, Oct4, nestina) ou hibridização in situ. Esta técnica pode também ajudar a compreender aspectos da embriogênese no que diz respeito à manutenção da estrutura tri-dimensional esférica de EBs.

Células-tronco pluripotentes de crescimento em suspensão se diferenciar em corpos embrióides (EBs). Aqui demonstramos como obter criosecções de alta qualidade EB útil para estudar os aspectos celulares e moleculares da embriogênese, preservando a sua organização como agregados.

Análise de células-tronco pluripotentes usando criosecções dos corpos embrióides

Células-tronco embrionárias (CTE) são células pluripotentes derivadas da massa celular interna de embriões precoces de mamíferos no estágio de blastocisto 1. Uma etapa crucial no...

Parte Um, Introdução. Olá, meu nome é Rafael. Sou pós-doutorando no laboratório do Professor Stevens Hans na Universidade Federal do Rio de Janeiro, no Brasil.Olá, meu nome é Ismail. Sou assistente de pesquisa e também professor. Neste vídeo, mostraremos como preparar cortes claros de corpos de Androides.Então vamos começar. Parte dois, materiais e equipamentos. Para este procedimento, precisaremos de um meio de inclusão para espécimes congelados.Solução de paraformaldeído a 4% para fixação das células, soluções de sacarose para proteção crioprotetora. Uma agulha com a ponta levemente curvada, um microscópio estereoscópico para melhor visualização da EBS e um agitador. Parte três.Aqui, os corpos de embrião humano estão sendo cultivados em placas de cultura não aderentes. Usando uma pipeta, agrupamos todos os corpos de embrião o mais próximo possível, a fim de transferi-los para um tubo cônico de 15 mililitros. Os SCE são cuidadosamente colhidos e transferidos para o tubo.É importante coletar todos os EBS, já que não há uma grande quantidade de material. Após os EBS serem decantados, o meio de cultura é cuidadosamente descartado. Você deve ser capaz de ver o pellet no fundo do tubo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós identificamos a placenta como um órgão hematopoiético importante durante o desenvolvimento. Descobrimos que as células-tronco hematopoéticas (HSCs) são gerados e se expandiu na placenta em única nichos microambientais. Aqui, descrevemos as técnicas experimentais necessárias para o isolamento e visualização de HSCs na placenta mouse.

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.

Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs humanas são induzidas a formar corpos embrióides (EBs). Os EBs são cultivados sobre um andaime de polímero usando um meio de indução, promovendo a diferenciação em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos. Finalmente, os EBs são embutidos em uma matriz e transferidos para um meio de manutenção para a formação de organoides cerebrais.

Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Este vídeo demonstra um método para a geração in vitro de células progenitoras neurais (NPCs) a partir de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs). As mESCs são cultivadas em suspensão para formar corpos embrióides (EBs), que são então guiados para se diferenciar em NPCs por meio de tratamento com ácido retinóico em uma cultura aderente.

Uma técnica para gerar células progenitoras neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Ensaio única expressão gênica de células é necessária para a compreensão da heterogeneidade de células-tronco.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

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Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema tridimensional (3-D) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) chamado corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D pode ser usado como uma cultura de fatia organotípica para modelar o desenvolvimento cortical humano e para a interrogação fisiológica do desenvolvimento de circuitos neurais.

Desenvolvimento de corpos de embrióide livres de soro derivado de HiPSC para a interrogação de culturas de células estaminais 3-D usando ensaios relevantes para o fisiologismo

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Aprenda a preparar criosecções de corpos embrióides derivados de células-tronco pluripotentes. Este método preserva a organização estrutural e permite análise detalhada dos processos celulares e moleculares durante a embriogênese.

Análise de células-tronco pluripotentes usando criosecções dos corpos embrióides

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