In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de ratos E16

Olá, meu nome é William Ti. Sou do laboratório Arnold Creek Stein. Hoje, eu e outros vamos demonstrar a injeção intrauterina de embriões de rato E 16. Olá, meu nome é Laura Elias.

Hoje vou mostrar como preparar as pipetas de microinjeção e carregá-las para as injeções intraventriculares e eletroporação que realizaremos hoje. Também mostrarei como realizar as injeções intraventriculares e a eletroporação em embriões de rato E16. Assim, as injeções e eletroporação in utero no rato são particularmente úteis porque o rato é um sistema no qual não é fácil realizar manipulações genéticas.

Ok, então há uma série de instrumentos cirúrgicos que utilizamos para este procedimento. Utilizamos um freer, um par de pinças de Adson, um par com superfície serrilhada e outro par com um pequeno dente na extremidade. Utilizamos também um par de hemostáticos.

Este é um par de tesouras, e então usamos esses dois grampeadores. Este é o maior, que usamos para ratos. Este é o menor, que usamos para camundongos, utiliza um grampo tamanho sete, e este utiliza um grampo tamanho nove, sendo ambos com mola.

Algumas das coisas que usamos aqui para auxiliar nas cirurgias incluem uma simples fonte de luz de fibra óptica com cabeça dupla. Utilizamos um pad aquecido que circula água morna aquecida para manter o ambiente quente. Na superfície de trabalho, usamos este sistema de eletroporação eletiva fabricado pela BTX.

Temos alguns tamanhos diferentes de espátulas que utilizamos com base no tamanho dos embriões. O lado azul é o lado positivo. Muito bem, agora vamos biselar nossas pipetas de injeção.

E isso é muito importante para que sua pipeta tenha uma abertura suficientemente grande para que você possa carregar seu DNA, mas também seja muito, muito afiada para não danificar o embrião durante a injeção. E se você danificar o embrião ao injetar, terá uma taxa muito mais alta de mortalidade. E isso não é bom.

Portanto, este é realmente um processo muito importante nesta cirurgia. Primeiro, vamos colocar um pouco de água nesta pedra de afiar que está girando aqui. Em seguida, vamos pegar, vejamos aqui, apenas um bastão.

E vamos colocar nossa pipeta, que acabamos de puxar, neste suporte usando fita adesiva. E vamos usar um desses micromanipuladores para segurar a pipeta no bisel e permitir que ela fique inclinada aqui. Então, vamos apenas posicionar isso e usamos um microscópio para visualizar a ponta da pipeta.

E vamos apenas colocá-lo diretamente na água, sobre o bisel feito anteriormente, de modo que haja uma pequena pressão. E você pode ver a ponta pressionando contra a pedra aqui. E deixe-o em contato por algum tempo, por pelo menos, digamos, 15 minutos.

Gosto de deixá-los, sabe, até por uma hora. Às vezes eles ficam realmente, realmente afiados, mas definitivamente depende da pessoa quanto tempo demora para biselar suas pipetas. Muito bem, então aqui temos, você pode ver na parte superior uma pipeta que foi puxada, mas ainda não foi biselada.

Portanto, embora seja afiado, não possui nenhuma abertura pela qual você possa carregar seu, seu DNA. Agora, a ponta da pipeta foi biselada, e você pode ver essa boa abertura em ângulo. Isso permitirá que você carregue seu DNA, mas ainda possui uma ponta afiada, de modo que você possa injetar sem causar danos. Muito bem, agora vamos encher nossas pipetas de injeção com DNA.

Portanto, é importante que você prepare seu DNA de maneira livre de endotoxinas para que não injete nenhuma das lipopolissacaridas quando administrar seu DNA. Então vamos pegar nosso DNA e, na verdade, aqui, preparar nossa paraforma. Você vai preparar sua paraforma aqui e vai querer coletar seu DNA e simplesmente colocá-lo como um pequeno ponto sobre essa paraforma.

Em seguida, vamos pegar, então normalmente utilizo, para cada 10 microlitros do meu DNA, que geralmente uso na concentração de cerca de 1,5 a 1,7 microgramas por microlitro, aproximadamente um microlitro dessa tintura rápida. Isso serve apenas para nos ajudar a localizar nossa injeção e garantir que injetamos com sucesso no ventrículo.

Então, vou misturar rapidamente este corante verde com o meu DNA. Em seguida, pegue seu eletrodo de injeção e vamos encher a pipeta puxando o êmbolo para trás. E aqui você pode ver que, se a pipeta estiver correta e tiver uma abertura suficientemente grande, o DNA deverá ser carregado com bastante facilidade.

Às vezes, é necessário mover o êmbolo para frente e para trás para ajudar a carregá-lo corretamente. Assim, você pode carregar a pipeta desta forma. Dessa forma, temos o DNA totalmente carregado nesta pipeta e ele está pronto para a injeção.

Ok, então vou anestesiar o animal. Usamos esses cones descapicantes. Eu apenas dobro levemente a borda para trás para facilitar a segurá-lo.

Então vamos começar. Normalmente, coloco-o apenas na borda da gaiola para formar um pequeno túnel, assim, para ele entrar. Ok, este animal parece estar inativo.

Vamos realizar um aperto no dedo do pé para confirmar isso; basta pegar o dedo do pé e apertar com firmeza. Não muito forte. Você não quer ferir o animal, mas apenas certificar-se de que ele está inconsciente.

E este animal está definitivamente anestesiado. Então vou prosseguir e depilar o abdômen dela. Só quero evitar o tet para que você não corte as pontas deles.

Acho que poderia ser muito doloroso para o animal. Portanto, o animal é depilado. Agora vou levá-lo para a câmara de fluxo laminar.

Vamos limpá-la e iniciar o procedimento. Ok, confirmamos novamente que este animal está inconsciente e estamos prontos para limpá-la primeiro. O que quero fazer é aplicar um pouco de pomada ocular, apenas para evitar que os olhos dela sequem.

E então o que vamos fazer é alternar lavagens com compressas de álcool e compressas de iodo. Fazemos isso três vezes, três esfregaços alternados. Precisamos ser muito cuidadosos para não danificar os embriões durante o procedimento.

Então você quer apenas deslizar diretamente para baixo, esperando reto novamente. Este é o número um. Primeiro preciso deixá-la bem úmida para poder fazer as limpezas. Bom.

Isso é dois e isso é três. Ok, colocamos esta tampa para auxiliar na esterilização e agora vou prosseguir e abrir o animal. Vamos cortar.

Tudo bem, a primeira coisa que preciso fazer é colocar a esterilização. Colocamos luvas estéreis e estamos prontos para abrir aqui. Sempre devemos confirmar que o animal ainda está inconsciente.

Então, farei outra pressão com pinça no dedo do pé, o que realizaremos ao longo de todo o procedimento. Normalmente, eu avanço e aperto levemente um pouco do tecido, faço uma incisão rápida, seguro-o na parte superior e corto para baixo, pego o outro par de pinças e mantenho o tecido afastado.

Então você pega o músculo desejado, corta exatamente na linha média para não atingir vasos ou nervos. Tenha cuidado para não segurar com muita força. Então, parece que temos um bom rendimento aqui.

Quero garantir que o material permaneça bem lubrificado para que não desidrate. E farei outra verificação apenas para ter certeza de que está tudo certo, e parece que está tudo bem. Então, eu sempre posiciono estes para Laura, e o que geralmente faço, ou melhor, o que sempre faço, é posicionar a cabeça de forma que a cabeça do embrião fique do lado direito da rata mãe, apenas para manter a uniformidade.

E então vou começar agora. Aqui podemos ver o embrião. Podemos ver a cauda e a lente posterior aqui, e a cabeça mais acima aqui.

Aqui estamos observando a cabeça deste embrião. É possível ver a linha média nesta faixa escura. É possível identificar o hemisfério esquerdo e o hemisfério direito, bem como o cérebro posterior.

Agora vou direcionar o hemisfério esquerdo na injeção. Pipeteie, injete, levante um pouco e injete o corante. Agora você vê que ele está se espalhando pelo ventrículo lateral esquerdo.

E isso parece ser uma injeção bem-sucedida. Muito bem, agora podemos ver que os ventrículos foram preenchidos adequadamente. O corante passou efetivamente do ventrículo esquerdo para o direito.

Portanto, temos D e DNA em ambos os ventrículos. Neste momento, vou pegar meus eletrodos de eletroporação e posicioná-los sobre o cérebro, com um eletrodo positivo no lado esquerdo. Assim, o DNA entrará nos progenitores e na parede cortical do hemisfério esquerdo.

E agora estou passando a corrente. E quando começamos a passar a corrente elétrica, você vê alguma espuma na extremidade negativa do eletrodo. E isso é tranquilizador e indica que você fez os contatos corretos.

Ok, agora que eletroporamos esses embriões, vou colocá-los de volta e fechar a incisão. Vou agora administrar a ela 10 mL de antibiótico e realizar a sutura cirúrgica. Gosto de usar pontos bloqueados.

Depois disso, vamos grampear a pele com o grampeador de pele. Está bem? Está bem. Então, apliquei uma dose de buprenorfina nela para garantir que não sinta qualquer dor ao acordar. Agora, vou apenas colocá-la na incubadora, o que manterá seu corpo aquecido enquanto acorda, apenas para assegurar que não sofra hipotermia.

Ok, acabamos de mostrar como realizar injeções intraventriculares e eletroporação in utero. No rato, é possível injetar diversas substâncias diferentes. Pode-se simplesmente injetar um vírus, incluindo lentivírus ou retrovírus, diretamente no ventrículo.

E neste caso, você não precisará realizar a eletroporação porque o vírus se integrará nas células. Se você injetar plasmídeo, plasmídeos de DNA, como fizemos hoje, terá que realizar a eletroporação para introduzir os plasmídeos nas células que revestem o ventrículo. Assim, você pode usar esses vetores para diversas possibilidades.

Você pode usá-los apenas para simplesmente acompanhar as células que expressam GFP, permitindo observar a divisão e a migração desses progenitores. Você também pode usar esses vetores para manipular as células. Assim, é possível expressar alças de S-H-R-N-A e, dessa forma, silenciar genes específicos.

Você também pode superexpressar genes específicos e, dessa forma, manipular as células que foram eletroporadas ou infectadas com o vírus. Isso pode ser uma técnica muito poderosa para estudar o papel de proteínas específicas no processo de seu interesse. E isso é particularmente importante para estudos em ratos, porque não é possível realizar manipulações genéticas em ratos com a mesma facilidade que em camundongos.