Name: Recapitulação de um Curve Ion IV Canal Usando componentes de freqüência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda a caracterizar a resposta em frequência de canais iônicos usando componentes de frequência em protocolos de voltagem. Esta técnica permite medir múltiplos tipos de canais simultaneamente sem bloqueadores farmacológicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde número de concessão R21-HL094828-01 atribuído ao Dr. Poelzing.

1. Prepare Função Ruído e Sinal de Entrada <ol><li> Crie uma função de ruído contendo os componentes de freqüência desejada. Isto pode ser feito por descrever os componentes de freqüência desejada no domínio da freqüência e depois calcular o inverso Transformada Rápida de Fourier. Neste estudo, 1 - 15 kHz foi utilizado. Todas as transformadas de Fourier e Fourier inversa transforma descritos neste estudo foram calculados utilizando Matlab FFT e IFFT funções. </li><li> Dimensionar a amplitude da função de ruído de forma adequada. Neste estudo, a função de ruído foi escalado de modo que o zero a amplitude de pico da função de ruído foi de 50 ou 100 mV. </li><li> Criar um arquivo de estímulo através de métodos apropriados para a aquisição de software a ser utilizado. Para Clampex 8, primeiro criar um arquivo de texto com o cabeçalho apropriado. Abaixo do cabeçalho, introduza os incrementos de tempo para uma única varredura na primeira coluna. Os incrementos de tempo deveria ter o mesmo espaçamento temporal como o intervalo de amostragem utilizado nas medições. Para cada varredura no protocolo de degrau de tensão inserir as tensões exato desejado em cada passo de tempo. Isto deve incluir a função de ruído. </li></ol> 2. Realizar medições de tensão Grampo <ol><li> Criar um protocolo de medição dentro do software de aquisição que é compatível com o arquivo de estímulo gerado anteriormente. Em Clampex, há um menu que permite ao usuário associar um arquivo de estímulo com o protocolo atual. </li><li> Anexar um modelo (ou biológicas) da célula para o equipamento de medição. </li><li> Realizar o experimento, como previsto. Para efeitos de controlo, certifique-se de incluir medições periódicas que não incluem todas as funções de ruído. </li></ol> 3. Análise Experimental de pós <ol><li> Calcular a curva IV de uma gravação individual. Se a gravação é no estado de equilíbrio quando a função de ruído é aplicado, a curva IV pode ser criado usando uma porção de estado estacionário da gravação temporariamente fora do intervalo da função de ruído. Se a gravação não estava em estado estacionário, a função de ruído pode interferir com o cálculo da curva IV, então uma segunda gravação deve ser feita sem a função de ruído presente. </li><li> Para cada etapa de tensão em uma gravação de calcular a Transformada Rápida de Fourier da parte da gravação em que a função do ruído foi inserido. Combine a transformada de Fourier para cada etapa de tensão em amxn matriz, onde m é o número de frequências na FFT, e n é o número de passos de tensão. Nesta configuração, cada linha da matriz representa a amplitude de uma única freqüência em todas as etapas de tensão no experimento. </li><li> Para cada freqüência (ou seja, cada linha na matriz acima) correlacionar a linha com a curva IV gerada em 3.1 e gravar o coeficiente de correlação. </li><li> Trama a correlação de frequência vs coeficiente de visualizar frequências que altamente correlacionados com a curva IV. Como o componente DC está contida dentro da primeira freqüência da FFT, o coeficiente de correlação para esta freqüência deve ser sempre&gt; 0,99. </li></ol> 4. Resultados representativos: As medições representativas braçadeira de tensão são apresentados para uma célula modelo sem (Figura 1A) e com (Figura 1B) um ruído função inserida no protocolo de degrau de tensão. A curva IV também foi calculado para a célula do modelo (Figura 1C). Para cada varredura, nas gravações da Figura 1, a FFT foi calculado sobre o período de tempo onde a função do ruído foi inserido (ver caixa vermelha nas figuras 1A, 1B). Figuras 2A e 2B mostram os FFTs calculado para as gravações mostrado na Figura 1A e 1B, respectivamente. Após a inspeção visual, o componente DC (destacado em vermelho) aparece para imitar a forma da curva IV. Sem a função de ruído, todas as frequências acima DC parecem ter amplitudes próximas de zero (Figura 2A). Quando a função de ruído é inserido, as freqüências entre 1 e 15 kHz têm amplitudes visualmente perceptível (Figura 2B). A Figura 3 mostra o resultado de correlacionar amplitudes de freqüência individual sobre a gama de medidas de tensão contra a curva IV. Figura 3A-C mostra os coeficientes de correlação quando o experimento foi feito sob condições de controle (sem função de ruído) e com amplitudes de ruído de 50 e 100 mV, respectivamente. Observe em todos os casos, o componente DC parece correlacionar quase perfeitamente com a curva IV. De fato, para todas as gravações, o coeficiente de correlação para esta freqüência foi maior que 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, média ± desvio padrão). Quando olhamos para a Figura 3A (condições de controle), não existem frequências para além da componente DC, cuja amplitude significativamente correlaciona-se com a curva IV. Especificamente, nenhuma dessas freqüências têm coeficientes de correlação maior que 0,5. Após a inserção dos mais baixos da função da amplitude de ruído (50 mV), estas mesmas freqüências ainda tinha coeficientes de correlação inferior a 0,5. Os coeficientes de correlação para ofreqüências si só também não se tornou maior do que 0,5 quando a amplitude do ruído foi aumentada para 100 mV. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> . Figura 1 Modelo Recordings Cell: gravações braçadeira de tensão são apresentados para uma célula de modelo sem (1A) e com (1B) um ruído função incluída no protocolo de degrau de tensão. Para o primeiro eo último 20 ms de cada varredura, o potencial foi mantido em potencial exploração (0 mV). Cada passo de tensão foi de 80 ms de comprimento, ea função do ruído foi inserido 40 ms após o início da etapa. A função do ruído teve uma duração de 30 ms e continha freqüências entre 1 e 15 kHz. Tensão foi intensificada fro, -150 a +50 mV em incrementos de 5 mV. Uma curva IV para a célula modelo também é mostrado (1C). Para fazer as gravações mais fáceis de ler, apenas varrer toda quinta foi incluída na 1A e 1B, mas todas as varreduras foram incluídos no 1C. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 FFT de Gravações:. A FFT foi calculado para a parcela ms 30 de cada varredura, onde a função de ruído é para ser inserido (a área delimitada pela caixa vermelha nas figuras 1A, 1B). Figuras 2A e 2B mostram os FFTs calculados sem e com a função do ruído, respectivamente. Mais uma vez, para maior clareza, apenas os FFT de cada quinta varredura está incluído na figura, mas todos varre foram usados ​​nos cálculos futuros. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 Correlações Frequency IV: Os resultados das correlações entre a curva IV de uma gravação ea amplitude de freqüências individuais em toda a gama de medidas de tensão é mostrado. Figuras 1A - 1C mostram o coeficiente de correlação para freqüências 0-20 kHz em condições de controle, e na presença de 50 ou 100 funções ruído mV, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 Re-Criação da Curva IV:. A curva IV para a célula do modelo (igual à Figura 1C) ea magnitude de duas freqüências foram sobrepostos. A primeira frequência foi o componente DC (R = 0,995), eo segundo foi uma freqüência escolhidos aleatoriamente com baixa correlação (R ​​= 0,3212). As amplitudes de freqüência foram dimensionadas para aproximadamente a mesma amplitude que a curva IV.

<ol><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mu%5Dl+Na%2B+channels+expressed+transiently+in+human+embryonic+kidney+cells%3A+Biochemical+and+biophysical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties.</a> Neuron. 8, 663-676 (1992).</li>
<li>Abriel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Arrhythmogenic+Mechanism+Revealed+by+a+Long-QT+Syndrome+Mutation+in+the+Cardiac+Na%2B+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel.</a> Circ Res. 88, 740-745 (2001).</li>
<li>Giles, W. R., Imaizumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+potassium+currents+in+rabbit+atrial+and+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells.</a> J Physiol. 405, 123-145 (1988).</li>
<li>Lee, K. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+calcium+channel+blockade+by+verapamil%2C+D600%2C+diltiazem+and+nitrendipine+in+single+dialysed+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells.</a> Nature. 302, 790-794 (1983).</li>
<li>Ozdemir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Inhibition+of+Na%2FCa+Exchange+Results+in+Increased+Cellular+Ca2%2B+Load+Attributable+to+the+Predominance+of+Forward+Mode+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block.</a> Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).</li>
<li>Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Block+and+Identification+of+the+Verapamil+Binding+Domain+to+HERG+Potassium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels.</a> Circ Res. 84, 989-998 (1999).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Poelzing, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+increased+right+ventricular+conduction+sensitivity+to+flecainide+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge.</a> Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).</li>
<li>Goodman, M., Art, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+by+a+potassium-selective+inward+rectifier+enhances+tuning+in+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells.</a> Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).</li>
<li>Han, A., Frazier, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+characterization+using+single+cell+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy.</a> Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).</li>
<li>Hayashi, H., Fishman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+K%2B-channel+kinetics+from+analysis+of+the+complex+conductance+of+Aplysia+neuronal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane.</a> Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).</li>
<li>Millonas, M. M., Hanck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+response+spectroscopy+of+voltage-sensitive+ion+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating.</a> Biophys. J. 74, 210-229 (1998).</li>
<li>Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+of+alternating+currents+through+the+Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel.</a> Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).</li>
<li>Sale, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Properties+of+hERG+1a%2F1b+Heteromeric+Currents+and+a+hERG+1b-Specific+Mutation+Associated+With+Long-QT+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome.</a> Circ Res. 103, 81-95 (2008).</li>
<li>Blatz, A. L., Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+description+of+three+modes+of+activity+of+fast+chloride+channels+from+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle.</a> J Physiol. 378, 141-174 (1986).</li>
<li>Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+the+persistent+sodium+current+in+spike+initiation+during+slowly+rising+inputs+in+mouse+spinal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones.</a> The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).</li>
<li>Thompson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+potassium-channel+selectivity+revealed+by+Na%28%2B%29+and+Li%28%2B%29+binding+sites+within+the+KcsA+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existem obstáculos técnicos que atualmente impedem os investigadores de medir tipos múltiplos canais de íon simultaneamente com a intenção de posteriormente determinar a quantidade de corrente deve ser atribuída a cada tipo de canal. Devido a esta limitação, canais iônicos são geralmente estudadas individualmente usando técnicas como tensão, corrente, acção e clamp potencial. Para um estudo tipos de canais individuais, sistemas de expressão heteróloga são usadas frequentemente. 2 Ao trabalhar com células isoladas de tecido, tais como cardiomiócitos , outros meios devem ser usados ​​para bloquear os canais de íons diferentes. Por exemplo, os canais de sódio podem ser inativados por uma rampa de tensão lenta despolarizantes, 3 canais de potássio para dentro de retificação pode ser bloqueado com BaCl2 extracelular, 4 e canais de cálcio pode ser bloqueado utilizando verapamil 5. Um método utilizado que parcialmente supera essa limitação é medir o fluxo de corrente através de dois tipos de canais em simultâneo, em seguida, repita a medição após seletivamente bloqueando um tipo de canal com um agente apropriado. Subtração das duas medições pode então ser usada para estimar a quantidade de atribuíveis atual para o tipo de canal que foi bloqueado. 6 No entanto, existem duas grandes limitações a esta técnica. Primeiro, agentes químicos não foram identificados que podem bloquear seletivamente cada canal iônico, e algumas drogas amplamente utilizadas têm interacções não específicas com os tipos de outro canal. 5,7 segundo lugar, não pode ser determinada a partir desta técnica se um canal é modulado por um outro canal. Por exemplo, a expressão heterogênea de Nav 1.5 e Kir 2.1 foi mostrado na ventrículos cobaia, e tem sido sugerido que existe uma relação sinérgica entre os dois canais, tais que a maior Kir 2,1 expressão no ventrículo direito deprime velocidade de condução. 8 Atualmente , isto não pode ser verificada. Neste estudo, sugerimos que a espectroscopia de impedância pode ser uma ferramenta útil para estudar os tipos de iões de vários canais medidos simultaneamente. Embora o método apresentado nunca foi usado para discernir as correntes a partir de dois tipos de canais medidos simultaneamente, espectroscopia de impedância tem sido usado para estudar uma série de outros aspectos da função do canal de íon. Goodman e Arte mostrou tartaruga usando células ciliadas auditivas que os protocolos de pinça de corrente pode ser modificado para sintonizar uma célula para diferentes freqüências, e as oscilações no potencial transmembrana é devido a uma interação entre um retificador interno da K + e um canal de Ca 2 + canal. 9 Han e Frazier demonstrado que a impedância pode ser medida em uma única célula em uma ampla faixa de freqüências (100 Hz a 5 MHz), eo aumento da impedância observada quando K + ou Ca 2 + canais foram bloqueados poderia ser um meio simples de detectar bloco do canal em telas de drogas de alto throughput. 10 Hayashi e Fishman usaram condutância complexos para estudar propriedades cinéticas de um retificador interno da K + canal 11. Outros grupos têm introduzido uma única freqüência no protocolo de fixação de voltagem de tipos de canais diferentes e mostraram que o resposta de freqüência observada concordou com a resposta esperada para algumas freqüências, mas outros não. 12,13 Millonas Hanck e sugeriu a razão algumas freqüências não produzir a resposta esperada é a presença de constantes de taxa múltipla no modelo de Markov. 12 Estudos como estes, bem como outros, têm demonstrado que existem casos em que as correntes iónicas medidas de canais iônicos, enquanto usando espectroscopia de impedância não concordar com a resposta de freqüência teórica. Esta não é uma preocupação neste estudo porque o objetivo do método neste estudo é identificar as freqüências que se correlacionam com a amplitude da corrente independente dos pressupostos subjacentes do circuito elétrico da membrana. Furtheremore, a amplitude da corrente é calculado a partir de partes das gravações que não têm qualquer função do ruído inserido dentro deles. Uma série de outros estudos também apresentam modelos de canais iônicos numerosas exibindo numerosos estados condução e não condução, todos com suas constantes próprio ritmo. 14,15,16 Thompson et al mostraram que o filtro de seletividade do canal KcsA tem diferentes sítios de ligação para o Na +, Li + e K +, e os custos energéticos de que se deslocam de um sítio de ligação para outro como se move de íons através do filtro de seletividade é o que faz o canal preferencialmente conduta K + íons através de seu poros. 17 Neste trabalho, inserido uma ampla de freqüências (função de ruído) em um protocolo de degrau de tensão e olhou para as frequências cuja amplitude altamente correlacionados com a amplitude total de corrente. Desde forte evidência foi apresentada sugerindo constantes de taxa múltipla desempenhar um papel na condução de íons através different canais, a introdução das freqüências associadas com estas constantes de velocidade podem causar certas freqüências de vibração ou altamente correlacionados com a amplitude da corrente, que não teria de outra forma. A técnica demonstrada neste estudo é realizado em uma célula de modelo, que é um circuito paralelo RC que é normalmente usado para testar o circuito braçadeira de tensão e equipamento de aquisição. Não se espera que qualquer freqüências além DC teria correlação com a magnitude atual, e isso é mostrado em nossos dados. Mostramos também que além da função de ruído não causa nenhum freqüências para altamente correlacionados com a amplitude da corrente. Esses dois achados são fundamentais porque mostram que o equipamento de medição e função de ruído não por si só causa qualquer freqüências para correlacionar com a amplitude atual. Quando estudos futuros fazer medições utilizando membranas contendo canais iônicos, espera-se que, dependendo do canal utilizado, as freqüências que correspondem às constantes de velocidade no filtro de seletividade ou, possivelmente, os poros irão influenciar a resposta de freqüência do canal e do afeto que têm freqüências altas ou baixa correlação com a amplitude atual. Uma vez que este método é uma nova técnica para estudar canais iônicos, há uma série de direções estudos futuros poderia seguir. Primeiro, a técnica deve ser usada para caracterizar a resposta de freqüência de canais específicos isolados. Trabalho adicional também precisa ser feito para calibrar as amplitudes de freqüência para as amplitudes atual. Uma vez que múltiplos canais são caracterizados individualmente, tipos de canais múltiplos devem ser medidos simultaneamente. A técnica também poderia ser adaptado para uso em grampo do potencial de ação, pinça de corrente, e estudos de estimulação de campo. Embora esta seja uma nova técnica, ele mostra o que pode ser uma forma poderosa de fazer medições eletrofisiológicas que anteriormente não eram possíveis e fornecer valiosas novos insights sobre o papel fisiológico dos canais de íons.

<table><tbody><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td>Natick, MA</td></tr><tr><td>Clampex 8</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 8</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Amplificador de Grampo com Integração</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Estágio de Cabeça</td><td>Molecular Devices</td><td>CV202</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Sistema de Aquisição de Dados de 16 Bits</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Célula Modelo</td><td>Molecular Devices</td><td>Célula Modelo Patch 1</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr></tbody></table>

recapitulação de um curve ion iv canal usando componentes de freqüência

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUÇÃO: Atualmente, não existem métodos estabelecidos para medir tipos múltiplos canais de íon simultaneamente e decompor a corrente medida em porções atribuível a cada tipo de canal. Este estudo demonstra como espectroscopia de impedância pode ser usado para identificar freqüências específicas que altamente correlacionados com a amplitude estado estacionário corrente medida durante as experiências braçadeira de tensão. O método envolve a inserção de uma função de ruído contendo freqüências específicas para o protocolo de degrau de tensão. No trabalho apresentado, uma célula de modelo é usado para demonstrar que não altas correlações são introduzidas pelo circuito braçadeira de tensão, e também que a função do ruído em si não introduzir qualquer altas correlações quando não canais iônicos estão presentes. Esta validação é necessária antes que a técnica pode ser aplicada às preparações que contêm canais iônicos. O objetivo do protocolo apresentado é demonstrar como para caracterizar a resposta de freqüência de um único tipo de canal iônico para uma função de ruído. Uma vez freqüências específicas foram identificadas em um tipo de canal individual, eles podem ser usados ​​para reproduzir o constante estado atual tensão curva (IV). Freqüências que altamente correlacionados com um tipo de canal e minimamente se correlacionam com os tipos de outro canal pode então ser usada para estimar a contribuição atual de tipos de canais múltiplos medidos simultaneamente. MÉTODOS: medições braçadeira de tensão foram realizadas em uma célula modelo usando um protocolo passo padrão de tensão (-150 a +50 mV, 5mV passos). Funções de ruído contendo magnitudes iguais de 15/01 kHz (zero ao pico amplitudes: 50 ou 100mV) foram inseridos em cada etapa de tensão. A componente real da Fast Fourier Transform (FFT) do sinal de saída foi calculado com e sem ruído para cada potencial passo. A magnitude de cada freqüência como uma função de degrau de tensão foi correlacionada com a amplitude da corrente nas tensões correspondentes. RESULTADOS E CONCLUSÕES: Na ausência de ruído (controle), magnitudes de todas as freqüências, exceto o componente DC correlacionados mal (| R | &lt;0,5) com a curva IV, enquanto que o componente DC teve um coeficiente de correlação maior que 0,999 em todas as medições. A qualidade da correlação entre as freqüências individuais e da curva IV não se alterou quando uma função de ruído foi adicionada ao protocolo passo de tensão. Da mesma forma, aumentando a amplitude da função de ruído também não aumentou a correlação. Medidas de controle demonstram que o circuito clamp tensão por si só não causa qualquer freqüências acima de 0 Hz a alta correlação com a curva IV steady-state. Da mesma forma, as medições na presença de ruído a função demonstrar que a função de ruído não causa qualquer freqüências acima de 0 Hz para correlacionar com a curva IV steady-state quando não há canais de íons estão presentes. Com base nesta constatação, o método já pode ser aplicado a preparações contendo um tipo único canal de íons com a intenção de identificar as freqüências cujos amplitudes correlacionam especificamente com esse tipo de canal.

Existem obstáculos técnicos para a medição do fluxo de corrente através de canais iónicos simultaneamente, e mais tarde discernir o que parte da corrente transmembrana é devido a cada tipo de canal. Para atender a essa necessidade, este método apresenta uma forma para gerar a curva IV de tipos de canais individuais usando componentes de freqüência específica.

Recapitulação de um Curve Ion IV Canal Usando componentes de freqüência

INTRODUÇÃO: Atualmente, não existem métodos estabelecidos para medir simultaneamente múltiplos tipos de canais iônicos e decompor a corrente medida em...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma técnica para caracterizar a resposta em frequência de canais iônicos com o propósito de medir o fluxo de corrente através de múltiplos tipos de canais simultaneamente. Isso é alcançado primeiramente criando a função de ruído que será incluída no protocolo de degrau de tensão e incorporando-a a um arquivo de estímulo, o que é necessário para utilizar formas de onda personalizadas com o software Clamp X. O segundo passo do procedimento consiste em aplicar o protocolo de degrau de tensão recém-criado a uma célula modelo utilizando técnicas padrão de grampo de tensão em célula inteira e registrar a corrente resultante. O terceiro passo do procedimento é calcular a curva IV da célula e a FFT da porção de cada varredura que contém a função de ruído.O passo final do procedimento consiste em correlacionar individualmente a amplitude de cada frequência em todos os degraus de tensão com a curva IV dessa célula. Os resultados mostram que nenhuma frequência apresenta alta correlação com a curva IV da célula modelo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o clamp de tensão padrão em célula inteira, é que ela pode fornecer um meio para medir mais de um tipo de canal iônico simultaneamente, sem o uso de agentes bloqueadores farmacológicos ou protocolos de inativação por tensão.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da fisiologia de canais iônicos, como qual o efeito do nível de expressão de um determinado tipo de canal iônico sobre a atividade de outros tipos de canais iônicos no mesmo tecido. O primeiro passo do protocolo é criar uma função de ruído contendo as componentes de frequência desejadas. Para isso, inicialmente, descreva as componentes de frequência desejadas no domínio da frequência.Neste estudo, são utilizadas componentes de frequência entre um e 15 quilohertz. Em seguida, calcule a transformada inversa rápida de Fourier utilizando a função IFFT do MATLAB para transformar as frequências selecionadas para o domínio do tempo. Na próxima etapa, ajuste adequadamente a amplitude da função de ruído.Neste estudo, a função de ruído é escalonada duas vezes, uma vez de modo que a amplitude de zero ao pico da função de ruído seja de 50 milivolts e uma segunda vez, de modo que a amplitude de zero ao pico seja de 100 milivolts. O próximo passo é criar um arquivo de estímulo usando um programa como o matlab. Um arquivo de estímulo é apenas um arquivo de texto com um cabeçalho que informa ao software de aquisição do clamp X eight exatamente qual tensão utilizar em cada ponto no tempo.Para criar o arquivo de estímulo primeiro, crie um arquivo de texto com o cabeçalho apropriado; abaixo do cabeçalho, insira os incrementos de tempo para um único varredura na primeira coluna, os incrementos de tempo devem ter o mesmo espaçamento temporal do intervalo de amostragem usado nas medições. Este protocolo utiliza uma taxa de amostragem de 200 quilohertz. Para cada varredura, insira as tensões exatas desejadas em cada etapa de tempo.Cada coluna é considerada uma varredura separada, portanto, para um protocolo que varia de menos 150 milivolts a mais 50 milivolts em incrementos de cinco milivolts, devem ser adicionadas 41 colunas após a coluna de tempo. As tensões especificadas devem incluir a função de ruído no clamp X. Um protocolo deve ser criado para cada experimento, então o próximo passo é criar um protocolo de medição compatível com um arquivo de estímulo gerado anteriormente. No clamp X, selecione a opção do menu editar protocolo de onda zero do acquirer, que permite associar um arquivo de estímulo ao protocolo atual.O próximo passo é aplicar o estímulo definido à célula. Este protocolo utiliza uma célula modelo que possui um circuito RC paralelo. Conecte a célula modelo ao equipamento de medição, clique no botão de gravação e realize a fixação de X.O experimento está programado para fins de controle. Certifique-se de incluir medições periódicas que não contenham quaisquer funções de ruído; após coletar os dados, o próximo passo é gerar as curvas IV e realizar as transformadas rápidas de Fourier. Para calcular a curva IV de um registro individual, utilize uma porção em estado estacionário do registro, temporalmente fora da faixa da função de ruído, para medir a amplitude da corrente.Se a gravação não estiver em estado estacionário quando a função de ruído for aplicada, a função de ruído poderá interferir no cálculo da curva IV, caso em que a gravação controle deve ser utilizada. Em vez disso, para calcular a curva IV para cada degrau de tensão em uma gravação, calcule a FFT da porção da gravação onde a função de ruído foi inserida. Combine a transformada de Fourier para cada degrau de tensão em uma matriz M por N, onde M é o número de frequências na FFT e N é o número de degraus de tensão nesta configuração.Cada linha da matriz representa a amplitude da FFT de uma única frequência em todos os passos de tensão do experimento. O próximo passo é calcular os coeficientes de correlação para cada frequência, correlacionando a linha com a curva IV gerada anteriormente. Registre o coeficiente de correlação.A seguir, gere um gráfico do coeficiente de correlação versus frequência para visualizar as frequências que se correlacionam fortemente com a curva IV. Os resultados das medições de fixação de tensão sem uma função de ruído inserida são mostrados aqui. Para os primeiros e últimos 20 milissegundos de cada varredura, o potencial foi mantido no potencial de retenção de zero milivolts.Entre os valores, a voltagem foi aumentada de menos 150 milivolts a mais 50 milivolts em incrementos de cinco milivolts. Cada degrau de voltagem teve duração de 80 milissegundos para facilitar a leitura da figura; apenas a cada cinco varreduras está incluída na figura. A caixa vermelha indica o momento em que a função de ruído teria sido aplicada, caso houvesse uma função de ruído nestas varreduras.Esta figura é semelhante à figura anterior, mas com a função de ruído inserida no protocolo de degrau de tensão 40 milissegundos após o início do degrau de tensão; a caixa vermelha indica onde a função de ruído foi inserida. A função de ruído teve uma duração de 30 milissegundos e continha frequências entre um e 15 quilohertz. Esta figura mostra a curva IV que foi calculada para a célula do modelo.Esta curva IV é linear, o que é esperado, já que a célula modelo é um circuito RC paralelo simples. Esta figura mostra o resultado da FFT sem a função de ruído para cada varredura. Nos registros da célula modelo, a FFT foi calculada no intervalo de tempo em que a função de ruído foi inserida.O componente CC, que é destacado em vermelho, parece imitar a forma da curva IV. Todas as frequências acima de CC parecem ter amplitudes próximas de zero; apenas para clareza, somente a FFT de cada quinto varredura está incluída na figura. Quando a FFT é calculada para as gravações com a função de ruído inserida, as frequências entre um e 15 quilohertz apresentam amplitudes notáveis. A presença dessas frequências mais altas, que normalmente não estão presentes em experimentos de clamp de voltagem, levanta a questão de saber se a magnitude de alguma dessas frequências muda proporcionalmente à amplitude da corrente.Essas próximas três figuras mostram o coeficiente de correlação entre a amplitude da frequência individual e a curva IV da gravação. Na primeira figura, nenhuma função de ruído é utilizada. Na segunda figura, a função de ruído tinha uma amplitude de pico de 50 milivolts, e na terceira figura, a função de ruído tinha uma amplitude de pico de 100 milivolts.Observe que, em todos os casos, a componente CC, em outras palavras, a resposta em zero hertz, apresenta um coeficiente de correlação superior a 0,99 e, portanto, parece correlacionar-se quase perfeitamente com a curva IV. Além disso, observe que, nas três figuras, nenhuma das outras frequências possui coeficientes de correlação superiores a 0,5. Adicionalmente, a inserção da função de ruído com amplitude de 50 ou 100 milivolts não alterou esse padrão.Esses resultados indicam que a circuitaria do clamp de voltagem e a própria função de ruído não introduzem altas correlações na curva IV. Essa validação é importante para aplicar esta técnica a preparações contendo canais iônicos. Esta figura recria a curva IV para mostrar a correlação ou a ausência dela em dois conjuntos de dados de frequência.A curva IV para a célula modelo rotulada como IV real nesta figura é a linha tracejada que parece se sobrepor à linha vermelha pontilhada. A linha vermelha pontilhada mostra a componente contínua, que possui um coeficiente de correlação de 0,995 em relação à linha IV real. A terceira curva, exibida como uma linha irregular, mostra uma frequência escolhida aleatoriamente de 4,399 quilohertz com baixa correlação.O coeficiente de correlação desta linha com a curva IV é 0,3212. Esses resultados mostram que o equipamento de medição e a função de ruído não causam, por si só, a correlação de quaisquer frequências com a amplitude da corrente. Com base nesta verificação, o método aqui apresentado, que insere uma função de ruído em degraus de tensão durante experimentos de fixação de tensão, pode ser aplicado inicialmente a preparações de membrana contendo um único tipo de canal iônico e posteriormente a preparações contendo múltiplos tipos de canais. Os resultados dos experimentos com canais iônicos únicos podem ser analisados utilizando a FFT e a análise de correlação proposta aqui.Essa análise pode ser utilizada para identificar frequências cujas amplitudes se correlacionam especificamente com aquele tipo particular de canal. Foram apresentadas fortes evidências sugerindo que múltiplas constantes de taxa desempenham um papel na condução de íons através de diferentes canais. Portanto, uma vez identificadas as frequências, elas apresentam alta correlação com um tipo específico de canal e correlação mínima com outros tipos de canais.Essas frequências podem então ser usadas para estimar a contribuição atual de múltiplos tipos de canais medidos simultaneamente seguindo este procedimento. Outros métodos, como bloqueio farmacológico e pulsos prévios, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o comportamento da resposta em frequência dos canais quando um canal iônico está em uma confirmação bloqueada ou inativa.

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Corrente iônica de canais BK é gravado usando técnicas de patch clamp. Canais BK são expressos...

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

Whole-cell patch-clamp gravações de dendritos do nervo auditivo fibra no interior da fita sinapse das células ciliadas da cóclea de mamíferos.

Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse

Nós descrevemos a preparação de fatias finas de retina aquático salamandras tigre...

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

A reconstituição da proteína transmembranar, KvAP, em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) é demonstrada por dois métodos de desidratação-re-hidratação - eletroformação, e inchaço assistida-gel. Em ambos os métodos, vesículas pequenas unilamelares que contêm a proteína são fundidos em conjunto para formar GUVs que pode, em seguida, ser estudadas por microscopia de fluorescência e de patch-clamp electrofisiologia.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Este artigo descreve como a seletividade iônica da channelrodopsina é determinada com registros eletrofisiológicos de patch-clamp de células inteiras usando células HEK293. Aqui, o procedimento experimental para investigar a seletividade de cloreto de uma channelrodopsina seletiva de ânions é demonstrado. No entanto, o procedimento é transferível para outras canalrodopsinas de seletividade distinta.

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Este artigo descreve um aumento da Fluorometria Voltagem-Clamp convencional (VCF) onde Fluorescente Aminoácidos Não-naturais (fUAA) são usados ​​em vez de corantes maleimida, para sondar rearranjos estruturais em canais iônicos. O procedimento inclui injeção de DNA de oócito de Xenopus , coinjeção de ARN / fUAA e medições simultâneas de corrente e fluorescência.

Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

O protocolo aqui descreve as interações da proteína de canal de íon hEAG1 purificado com a pequena molécula lipídica ligante fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2). A medida demonstra que BLI poderia ser um método potencial para rastreio de ligante de canal novela pequena molécula íon.

Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada

O presente protocolo descreve um método eficiente para a aquisição dinâmica e em tempo real de correntes de canal de potássio dependentes de voltagem (Kv) em cardiomiócitos H9c2 usando a técnica de patch-clamp de células inteiras.

Registro de Corrente de Potássio Dependente de Voltagem em Cardiomiócitos H9c2 através da Técnica de Patch-Clamp de Células Inteiras

A eletrofisiologia dinâmica do clamp pode estabelecer ligações causais entre déficits de disparo neuronal e disfunção do canal iônico. Descrevemos métodos e protocolos de grampo dinâmico em neurônios de Purkinje cerebelares de camundongos, observando recursos úteis e considerações técnicas. Em um estudo representativo, adicionamos condutância de sódio modelada aos neurônios Tsc1-/- Purkinje para resgatar disparos repetitivos.

Métodos dinâmicos de grampo para investigar a excitabilidade neuronal prejudicada associada ao autismo

Um protocolo experimental é apresentado para montar, estimular eletricamente e analisar bicamadas de interface de gotículas dopadas com gramicidina A. As relações estrutura-função lipídio-proteína são quantificadas medindo mudanças na área da membrana, fluxo iônico e condutância de canal único, e relacionando essas respostas a mudanças semelhantes à plasticidade na condução iônica em um modelo de membrana inspirado em sinapses elétricas.

Caracterização da Estrutura e Função da Membrana Lipídio-Proteína usando Bicamadas de Interface de Gotículas

Aprenda a caracterizar a resposta em frequência de canais iônicos usando componentes de frequência em protocolos de voltagem. Esta técnica permite medir múltiplos tipos de canais simultaneamente sem bloqueadores farmacológicos.

Recapitulação de um Curve Ion IV Canal Usando componentes de freqüência

Explorar mais vídeos