Indução e Monitoramento de hipersensibilidade do tipo retardada Ativa (DTH) em ratos

Olá, sou Christine Beaton. Trabalho no laboratório de George Chandy, no Departamento de Fisiologia e Biofísica da UCI. Hoje vou mostrar como induzir DTH ativo em ratos.

Para isso, vou preparar uma emulsão de KLH, que é meu antígeno, em adjuvante de Freund. Em seguida, vou injetar essa emulsão na base da cauda de ratos Lewis. Isso irá induzir a imunização dos ratos contra KLH. E em uma semana, vou desafiar os ratos com KLH e medir a reação de hipersensibilidade tardia (DTH) por meio da medição do inchaço.

Esse é o local do desafio e estamos utilizando isso no laboratório para observar o efeito de bloqueadores do canal PO sobre reações inflamatórias, como a HDT. Aqui está o adjuvante trans incompleto que vou usar para preparar a emulsão. Também poderia usar o adjuvante trans completo.

Aqui estão cristais de KLH, que é meu antígeno hoje, e tenho uma solução aqui a dois miligramas por ml. Em PBS, vou usar esta seringa de cinco ml para retirar o adjuvante incompleto e transferi-lo para um tubo de 15 ml. Em seguida, vou colocar o tubo no vórtex e, enquanto estiver vortexando, vou adicionar meu antígeno gota a gota ao adjuvante.

Em seguida, vou vortexar por mais cinco minutos. Após isso, vou encher esta seringa de vidro de 5 M com minha mistura, e ela precisa ser de vidro porque o adjuvante tem a tendência de degradar o plástico. As seringas de 5 M que encontramos são as melhores para preparar a emulsão.

Menores ou maiores não são tão bons. E, uma vez que encher minha seringa com a mistura, vou usar esta ponte metálica para conectar esta seringa de vidro a outra seringa de vidro de cinco mil. Em seguida, vou aplicar pressão sobre as seringas para fazer minha mistura passar de uma seringa para a outra o mais rápido possível, até que fique muito dura, até que a emulsão fique bem firme, e então estará pronta para injeção.

Então, vou colocar 2,5 mililitros do meu adjuvante. Vou injetar ar para poder retirar o adjuvante com mais facilidade e, em seguida, colocar todo o adjuvante no meu tubo. Agora, o que vou fazer é pegar 2,5 ml dessa quantidade e adicionar ao vórtex.

Como usei 2,5 mililitros do adjuvante, vou usar 2,5 mililitros do meu KLH. À medida que adiciono gota a gota, você verá que a mistura vai mudar de cor e ficar branca. Agora adicionei todo o antígeno ao adjuvante.

O que vou fazer é agitar a mistura em vórtex por mais cinco minutos. Mas, como não quero segurar o tubo durante cinco minutos, vou fixá-lo com fita ao vórtex para criar o movimento de vórtex dentro do tubo. Você não quer que fique instável; ao contrário, deseja que gire o mais rápido possível sem transbordar. Assim, deixarei dessa forma por cinco minutos.

Então, os cinco minutos terminaram. Agora vou parar o vórtex e minha mistura está branca. Então, retiro o tubo. Ops.

A mistura está completamente branca agora, mas ainda é bastante líquida. E eu queria uma consistência mais firme para a injeção. Então, o que vou fazer é transferir toda a mistura para uma seringa de vidro de 5 mL.

Essas seringas foram autoclavadas. Então, conecto uma seringa completa à minha ponte. E da outra seringa, conecto apenas o corpo.

Deixo o êmbolo de fora e então vou despejar minha mistura na seringa superior. Vou transferir tudo para a seringa inferior. Em seguida, preciso remover a bolha de ar que tenho aqui.

Então, vou desconectar a seringa superior e vou empurrar a bolha de ar. A bolha é difícil de ver, mas está bem aqui. Então, empurro a bolha de ar.

Eu também o retiro da ponte e, em seguida, reconecto a seringa superior. Verifico se tudo está firmemente conectado e, então, vou transferir minha mistura de uma seringa para a outra. No início, é fácil, mas logo a mistura começará a endurecer.

Então, hoje à noite está ficando mais difícil e eu não quero romper a ponte, então simplesmente giro minhas seringas. Às vezes, leva mais tempo. Isso varia de emulsão para emulsão.

Isso provavelmente depende da temperatura e do nível de umidade também. Mas acho que minha emulsão já está pronta. Está muito mais espessa do que quando eu a despejei.

É completamente branco. E há apenas uma fase. Nunca deve haver separação da fase de ACO do óleo.

Agora está pronto para a injeção. Agora a imersão está pronta para ser injetada. Para injetá-la, uso, vou injetar 200 microlitros por caixa.

E para isso, vou utilizar seringas de três mil. Uso seringas com ponta lu lock para garantir que a agulha não saia, pois a emulsão pode ser muito espessa e difícil de injetar. Quanto às agulhas, procuro usar as menores possíveis que ainda permitam a passagem da emulsão.

E descobri que as seringas de 20 mL 3G são boas o suficiente para esta emulsão. Para emulsões mais espessas, você pode precisar usar seringas maiores. Agora, da maneira como fazemos, uma pessoa segura o rato e a outra faz a injeção.

E, para máxima segurança, a pessoa que segura os ratos, embora esses ratos sejam muito calmos e estejam acostumados a ser manipulados, utiliza aquelas luvas resistentes aos dentes de roedores, apenas para garantir a máxima segurança, pois não queremos que o rato morda. Então, coloco toda a emulsão em uma seringa de vidro e desconecto a seringa de vidro vazia da ponte. No lugar dela, coloco minha seringa plástica de três mililitros com trava de segurança.

Agora transfiro mais do que preciso para uma canaleta de emulsão. Removo a bolha de ar. Como vou injetar 200 microlitros por canaleta, deixo 300 microlitros na minha seringa.

Desconecto a ponte, coloco minha agulha na seringa de plástico e, em seguida, encho a agulha e empurro o êmbolo até 200 microlitros. Assim tenho certeza de que não há bolhas de ar. E agora estamos prontos para injetar.

Portanto, queremos garantir que o rato não se mova. Pegamos o rato e coloco um dedo acima do ombro, outro abaixo, e com a outra mão seguro as patas traseiras e a cauda, e vamos injetar nos flancos aqui, microlitros deste lado e, em seguida, microlitros do outro lado. Na semana passada, imunizei os ratos com uma emulsão contendo KLH como antígeno.

E hoje vou desafiá-los intradérmicamente nas costas com KLH, que é meu antígeno, e com o albumina, que é um antígeno relevante, mas para poder injetá-los nas costas por via intradérmica, primeiro preciso depilá-los. E para isso estou usando apenas uma tesoura elétrica simples. Sim, bem, troco as agulhas entre cada rato para garantir que a agulha não fique romba.

Isso torna muito mais fácil a injeção intradérmica, especialmente porque estou injetando pequenos volumes de 20 microlitros de cada antígeno. Então, injetei meus dois antígenos em todos os ratos e vou deixá-los em suas gaiolas até amanhã. E amanhã vamos poder observar uma inflamação.

Portanto, o local da injeção ficará vermelho e inchado, e será possível medir o diâmetro da área inflamada como uma medida da inflamação. Ontem, injetei nos ratos, por via intradérmica nas costas, um antígeno relevante, que é a KLH, e um antígeno irrelevante, que é a albumina. Agora, 24 horas depois, vou examinar os ratos para verificar se há inflamação.

Então, espero inflamação apenas no local da KLH, e a inflamação se manifestará como vermelhidão e inchaço. Após observar a inflamação, vou medir a área inflamada medindo simplesmente o diâmetro da região. Este aqui é o local injetado com KLH, e você pode ver sem dificuldade que há uma inflamação acentuada.

É muito vermelha em comparação com a pele normal e está inchada. Se agora observarmos o outro local que recebeu albumina, é possível ver o local da injeção bem aqui, mas não há vermelhidão ou inchaço significativos. Assim, o controle negativo funcionou.

Agora vou medir o local da inflamação. Para isso, usarei uma régua comum e farei uma medição em milímetros. Isso mede seis milímetros e tomo uma segunda medida.

Isso pesa cinco milímetros. Há muito pouca vermelhidão; será feita a medição, mas mal atinge um milímetro. Então, o que mostrei aqui é como preparar uma emulsão com um antígeno, como imunizar ratos com essa emulsão e, depois, desafiá-los uma semana mais tarde com o antígeno usado para imunização e também com um antígeno relevante, além de como visualizar e medir o grau de inflamação no uso e no laboratório Chan.

Utilizamos esta técnica de forma bastante rotineira como um ensaio simples para medir o efeito de bloqueadores de canais de potássio na inflamação em ratos.