Name: Indução e Monitoramento de hipersensibilidade do tipo retardada Ativa (DTH) em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Aprenda a induzir hipersensibilidade do tipo retardada ativa em ratos Lewis usando emulsão de antígeno KLH em adjuvante de Freund. Este método permite monitorar respostas inflamatórias mediadas por linfócitos T.

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1. Preparação da emulsão <ol><li> A emulsão é uma mistura 1:1 do antígeno (DTH pode ser induzida a vários antígenos: ovalbumina, toxóide tetânico, limpet keyhole hemocianina ....) em solução aquosa adicionado ao adjuvante completo de Freund. É muito importante adicionar o antígeno ao adjuvante e não o contrário! </li><li> Há uma grande quantidade de resíduos ao fazer e injetando uma emulsão, por isso sempre preparar 1,5 ou 2 vezes mais do que o que você precisa. </li><li> Dissolver antígeno em solução salina para preparar uma solução de 2 mg / ml. Não filtro, que você não quer perder os agregados! </li><li> Coloque completa adjuvante de Freund H37Ra (Difco, catalogo 231.131) em um tubo de vórtice e em alta velocidade. Adicionar a gota a gota, enquanto o antígeno vórtex. Quando todos o antígeno é adicionada vórtice, por mais 5 minutos. A mistura deve ficar branco. </li><li> Coloque a emulsão em uma seringa de vidro e vinculá-lo a outra seringa de vidro usando uma ponte de 18G (Fisher catálogo # 14-825-17L). Enviar a emulsão de uma seringa para o outro até que se torne rígido (5-10 min). É melhor usar duas seringas 5 ml. Se mais de 5 ml de emulsão são necessários, use vários conjuntos de 5 ml seringas. </li><li> A emulsão pode ser armazenada nas seringas a 4 ° C por 3 semanas. </li></ol> 2. Imunização dos ratos <ol><li> Misture a emulsão nas seringas por alguns minutos e transfira para a seringa utilizada para a injeção. Injetar 200 ml por via subcutânea em 1-2 locais na base da cauda usando agulhas 23G e uma ponta Luer-Lok seringa de 3 ml. </li></ol> 3. Desafio com o antígeno na parte de trás <ol><li> Sete dias após a imunização, a barba duas manchas nas costas dos ratos e injetar por via intradérmica de 20 ml de uma solução de antígeno 1 mg / ml em um ponto e salina (ou antígeno irrelevante) no outro ponto. Não filtrar a solução de antígeno, como você pode perder agregados que aumentam a reação inflamatória. </li><li> Os ratos devem ser anestesiado para evitar movimentos. Injectar a solução por via intradérmica, utilizando 27G ½ agulhas e seringas de 1 ml. Mudança de agulhas entre as injecções. Nota: o desafio pode ser feito no pavilhão das orelhas, em vez de as costas para as medições mais precisas. Veja vídeo em <a href="/index/Details.stp?ID=325">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325</a> </li></ol> 4. Medição de DTH <ol><li> O local da injecção irão começar a transformar vermelhas e inchaço como um sinal de inflamação. Medir o diâmetro da área inflamada usando uma régua ou, melhor ainda, um paquímetro. O inchaço máxima deve ocorrer entre 24 e 72 horas. </li></ol>

<ol>
	<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+monitoring+of+adoptive+delayed-type+hypersensitivity+in+rats.">Induction and monitoring of adoptive delayed-type hypersensitivity in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. 8, (2007).</li></ol>

Os autores são co-fundadores e consultores para Airmid Inc.

Para uma medição mais precisa da reação DTH recomendamos desafiando os ratos com o antígeno no pavilhão da orelha. A reação pode ser medido como uma diferença no ouvido inchaço entre o ouvido antígeno desafiou relevantes eo ouvido desafiados com solução salina, sozinho ou com o antígeno irrelevante. Uma demonstração do desafio no ouvido é mostrado na 1.

Usar reagentes estéreis soluções e seringas. As seringas de vidro e pontes 18G pode ser autoclavado. Leia folha de dados do material antes de manusear um reagente para a primeira vez e usar equipamentos de proteção adequados.

indução e monitoramento de hipersensibilidade do tipo retardada ativa (dth) em ratos

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por linfócitos efetores CCR7-T de memória que infiltram o local da injeção de um antígeno contra o qual o sistema imunológico tem sido preparado. A reação inflamatória é caracterizada por vermelhidão e inchaço do local de desafio antigênico. É um modelo conveniente para determinar a eficácia in vivo de imunossupressores. DTH cutânea pode ser induzida ou por transferência adotiva de linfócitos T antígeno-específicos ou por imunização ativa com um antígeno e subseqüente desafio intradérmico com o antígeno para induzir a reação inflamatória da pele em uma área determinada. Respostas DTH pode ser induzida a vários antígenos, por exemplo ovalbumina, tuberculina, toxóide tetânico, ou limpet keyhole hemocianina (KLH). Aqui demonstramos como para induzir uma reação ativa DTH em ratos Lewis. Vamos primeiro preparar uma emulsão de água em óleo de KLH, nosso antígeno de interesse, em completa adjuvante de Freund e injetar este emulsão por via subcutânea a ratos. Isso vai preparar o sistema imunológico para desenvolver células de memória T direcionado para KLH. Sete dias mais tarde, vai desafiar os ratos por via intradérmica na parte traseira com KLH de um lado e com ovalbumina, um antígeno irrelevante, do outro lado. A reação inflamatória será visível 16-72 horas mais tarde, a área vermelha e inchada será medida como uma indicação da gravidade da DTH.

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por CCR7 efetuador linfócitos T de memória. Aqui demonstramos como induzir DTH ativa em ratos Lewis e monitorar a resposta inflamatória.

Indução e Monitoramento de hipersensibilidade do tipo retardada Ativa (DTH) em ratos

A hipersensibilidade do tipo tardio (HTL) é uma reação inflamatória mediada por linfócitos T de memória efetores CCR7+ que infiltram o local de injeção de ...

Olá, sou Christine Beaton. Trabalho no laboratório de George Chandy, no Departamento de Fisiologia e Biofísica da UCI. Hoje vou mostrar como induzir DTH ativo em ratos.Para isso, vou preparar uma emulsão de KLH, que é meu antígeno, em adjuvante de Freund. Em seguida, vou injetar essa emulsão na base da cauda de ratos Lewis. Isso irá induzir a imunização dos ratos contra KLH. E em uma semana, vou desafiar os ratos com KLH e medir a reação de hipersensibilidade tardia (DTH) por meio da medição do inchaço.Esse é o local do desafio e estamos utilizando isso no laboratório para observar o efeito de bloqueadores do canal PO sobre reações inflamatórias, como a HDT. Aqui está o adjuvante trans incompleto que vou usar para preparar a emulsão. Também poderia usar o adjuvante trans completo.Aqui estão cristais de KLH, que é meu antígeno hoje, e tenho uma solução aqui a dois miligramas por ml. Em PBS, vou usar esta seringa de cinco ml para retirar o adjuvante incompleto e transferi-lo para um tubo de 15 ml. Em seguida, vou colocar o tubo no vórtex e, enquanto estiver vortexando, vou adicionar meu antígeno gota a gota ao adjuvante.Em seguida, vou vortexar por mais cinco minutos. Após isso, vou encher esta seringa de vidro de 5 M com minha mistura, e ela precisa ser de vidro porque o adjuvante tem a tendência de degradar o plástico. As seringas de 5 M que encontramos são as melhores para preparar a emulsão.Menores ou maiores não são tão bons. E, uma vez que encher minha seringa com a mistura, vou usar esta ponte metálica para conectar esta seringa de vidro a outra seringa de vidro de cinco mil. Em seguida, vou aplicar pressão sobre as seringas para fazer minha mistura passar de uma seringa para a outra o mais rápido possível, até que fique muito dura, até que a emulsão fique bem firme, e então estará pronta para injeção.Então, vou colocar 2,5 mililitros do meu adjuvante. Vou injetar ar para poder retirar o adjuvante com mais facilidade e, em seguida, colocar todo o adjuvante no meu tubo. Agora, o que vou fazer é pegar 2,5 ml dessa quantidade e adicionar ao vórtex.Como usei 2,5 mililitros do adjuvante, vou usar 2,5 mililitros do meu KLH. À medida que adiciono gota a gota, você verá que a mistura vai mudar de cor e ficar branca. Agora adicionei todo o antígeno ao adjuvante.O que vou fazer é agitar a mistura em vórtex por mais cinco minutos. Mas, como não quero segurar o tubo durante cinco minutos, vou fixá-lo com fita ao vórtex para criar o movimento de vórtex dentro do tubo. Você não quer que fique instável; ao contrário, deseja que gire o mais rápido possível sem transbordar. Assim, deixarei dessa forma por cinco minutos.Então, os cinco minutos terminaram. Agora vou parar o vórtex e minha mistura está branca. Então, retiro o tubo. Ops.A mistura está completamente branca agora, mas ainda é bastante líquida. E eu queria uma consistência mais firme para a injeção. Então, o que vou fazer é transferir toda a mistura para uma seringa de vidro de 5 mL.Essas seringas foram autoclavadas. Então, conecto uma seringa completa à minha ponte. E da outra seringa, conecto apenas o corpo.Deixo o êmbolo de fora e então vou despejar minha mistura na seringa superior. Vou transferir tudo para a seringa inferior. Em seguida, preciso remover a bolha de ar que tenho aqui.Então, vou desconectar a seringa superior e vou empurrar a bolha de ar. A bolha é difícil de ver, mas está bem aqui. Então, empurro a bolha de ar.Eu também o retiro da ponte e, em seguida, reconecto a seringa superior. Verifico se tudo está firmemente conectado e, então, vou transferir minha mistura de uma seringa para a outra. No início, é fácil, mas logo a mistura começará a endurecer.Então, hoje à noite está ficando mais difícil e eu não quero romper a ponte, então simplesmente giro minhas seringas. Às vezes, leva mais tempo. Isso varia de emulsão para emulsão.Isso provavelmente depende da temperatura e do nível de umidade também. Mas acho que minha emulsão já está pronta. Está muito mais espessa do que quando eu a despejei.É completamente branco. E há apenas uma fase. Nunca deve haver separação da fase de ACO do óleo.Agora está pronto para a injeção. Agora a imersão está pronta para ser injetada. Para injetá-la, uso, vou injetar 200 microlitros por caixa.E para isso, vou utilizar seringas de três mil. Uso seringas com ponta lu lock para garantir que a agulha não saia, pois a emulsão pode ser muito espessa e difícil de injetar. Quanto às agulhas, procuro usar as menores possíveis que ainda permitam a passagem da emulsão.E descobri que as seringas de 20 mL 3G são boas o suficiente para esta emulsão. Para emulsões mais espessas, você pode precisar usar seringas maiores. Agora, da maneira como fazemos, uma pessoa segura o rato e a outra faz a injeção.E, para máxima segurança, a pessoa que segura os ratos, embora esses ratos sejam muito calmos e estejam acostumados a ser manipulados, utiliza aquelas luvas resistentes aos dentes de roedores, apenas para garantir a máxima segurança, pois não queremos que o rato morda. Então, coloco toda a emulsão em uma seringa de vidro e desconecto a seringa de vidro vazia da ponte. No lugar dela, coloco minha seringa plástica de três mililitros com trava de segurança.Agora transfiro mais do que preciso para uma canaleta de emulsão. Removo a bolha de ar. Como vou injetar 200 microlitros por canaleta, deixo 300 microlitros na minha seringa.Desconecto a ponte, coloco minha agulha na seringa de plástico e, em seguida, encho a agulha e empurro o êmbolo até 200 microlitros. Assim tenho certeza de que não há bolhas de ar. E agora estamos prontos para injetar.Portanto, queremos garantir que o rato não se mova. Pegamos o rato e coloco um dedo acima do ombro, outro abaixo, e com a outra mão seguro as patas traseiras e a cauda, e vamos injetar nos flancos aqui, microlitros deste lado e, em seguida, microlitros do outro lado. Na semana passada, imunizei os ratos com uma emulsão contendo KLH como antígeno.E hoje vou desafiá-los intradérmicamente nas costas com KLH, que é meu antígeno, e com o albumina, que é um antígeno relevante, mas para poder injetá-los nas costas por via intradérmica, primeiro preciso depilá-los. E para isso estou usando apenas uma tesoura elétrica simples. Sim, bem, troco as agulhas entre cada rato para garantir que a agulha não fique romba.Isso torna muito mais fácil a injeção intradérmica, especialmente porque estou injetando pequenos volumes de 20 microlitros de cada antígeno. Então, injetei meus dois antígenos em todos os ratos e vou deixá-los em suas gaiolas até amanhã. E amanhã vamos poder observar uma inflamação.Portanto, o local da injeção ficará vermelho e inchado, e será possível medir o diâmetro da área inflamada como uma medida da inflamação. Ontem, injetei nos ratos, por via intradérmica nas costas, um antígeno relevante, que é a KLH, e um antígeno irrelevante, que é a albumina. Agora, 24 horas depois, vou examinar os ratos para verificar se há inflamação.Então, espero inflamação apenas no local da KLH, e a inflamação se manifestará como vermelhidão e inchaço. Após observar a inflamação, vou medir a área inflamada medindo simplesmente o diâmetro da região. Este aqui é o local injetado com KLH, e você pode ver sem dificuldade que há uma inflamação acentuada.É muito vermelha em comparação com a pele normal e está inchada. Se agora observarmos o outro local que recebeu albumina, é possível ver o local da injeção bem aqui, mas não há vermelhidão ou inchaço significativos. Assim, o controle negativo funcionou.Agora vou medir o local da inflamação. Para isso, usarei uma régua comum e farei uma medição em milímetros. Isso mede seis milímetros e tomo uma segunda medida.Isso pesa cinco milímetros. Há muito pouca vermelhidão; será feita a medição, mas mal atinge um milímetro. Então, o que mostrei aqui é como preparar uma emulsão com um antígeno, como imunizar ratos com essa emulsão e, depois, desafiá-los uma semana mais tarde com o antígeno usado para imunização e também com um antígeno relevante, além de como visualizar e medir o grau de inflamação no uso e no laboratório Chan.Utilizamos esta técnica de forma bastante rotineira como um ensaio simples para medir o efeito de bloqueadores de canais de potássio na inflamação em ratos.

induction-monitoring-active-delayed-type-hypersensitivity-dth

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Indução e Monitoramento de hipersensibilidade tardia-Type Adoptive em Ratos

Aqui demonstramos um método para induzir e gravar o progresso de um atraso de hipersensibilidade do tipo-reação (DTH) na orelha de ratos. Isso é seguido por uma demonstração da preparação do tecido da orelha de rato para geração de imagens de dois fótons da resposta das células de memória / T efectoras.

As células de memória efetoras T imagem no ouvido após a indução de DTH Adoptive

Basófilos teste de ativação é uma potente ferramenta para a detecção de IgE-dependente...

Basófilos Teste de ativação de Investigação de IgE-mediada Mecanismos Hipersensibilidade a Drogas

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Trans-vivo Atraso Tipo Ensaio Hipersensibilidade para o Antigen Regulamento Específico

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