Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Neurônios do hipocampo e do córtex têm sido amplamente utilizados para estudar a polarização neuronal do sistema nervoso central, o crescimento de axônios e dendritos e a formação e função de sinapses. Uma vantagem do cultivo desses neurônios é que eles polarizam prontamente, formando axônios e dendritos distintos em um substrato bidimensional, com densidades muito baixas. Este vídeo demonstra uma técnica para dissecar, cultivar e transfectar neurônios embrionários do hipocampo e do córtex de camundongo por nucleofecção, o que permite a expressão de proteínas de fusão marcadas com fluoróforo no início do desenvolvimento, aproximadamente quatro a oito horas após o semeadura. A expressão das proteínas marcadas com fluoróforo é mantida durante toda a vida do neurônio, por mais de dois meses em cultura. Isso possibilita o estudo da função proteica durante eventos iniciais do desenvolvimento, como o crescimento axonal, e eventos posteriores, como a sinaptogênese e a plasticidade sináptica.

Primeiramente, as células gliais são isoladas de hemisférios corticais de camundongos pós-natais de um a três dias de idade e semeadas em frascos. Após atingirem de 70 a 100% de confluência, as células gliais são então replantadas em lamínulas de vidro.

Em seguida, neurônios do hipocampo ou do córtex são isolados de camundongos E 15,5 e transfectados por nucleofecção com plasmídeos que codificam proteínas de fusão fluorescentes, como a proteína fluorescente vermelha. Os neurônios transfectados são então semeados em câmaras de imagem para estudos de curta duração. Para culturas de longa duração, células gliais em lamínulas de vidro são invertidas sobre culturas de hipocampo ou córtex para fornecer suporte trófico, permitindo que neurônios individuais sejam analisados por microscopia para demonstrar a localização dinâmica das proteínas de fusão ao longo dos axônios ou dendritos dos neurônios.

Olá, sou Eric Dent, professor assistente de anatomia na Universidade de Wisconsin-Madison. Hoje, três dos meus alunos de graduação, Chris Wezelman, Jason Bwe e Derek Lombard, vão demonstrar um procedimento para o isolamento, semeadura e manutenção de culturas de neurônios corticais e hipocampais para cultivo de curto e longo prazo. Essas culturas podem ser utilizadas para estudar a dinâmica de proteínas de fusão fluorescentes durante todo o desenvolvimento neuronal, desde o crescimento inicial dos neuritos até o desenvolvimento de axônios e dendritos e a sinaptogênese.

Para preparar as câmaras para a aquisição de imagens de neurônios hipocampais e corticais de camundongo embrionário, inicie com placas de Petri de 35 milímetros com orifícios de 15 milímetros perfurados no fundo e todas as rebarbas removidas. Derreta uma mistura de parafina e vaselina na proporção de três para um em um tubo cônico, colocando-o em um banho-maria fervente.

Em seguida, use um pincel pequeno para revestir a parte inferior da placa ao redor do orifício. Certifique-se de mexer a mistura de parafina e vaselina entre as câmaras, pois ela se separará. Coloque a lamínula sobre o orifício.

Após todos os recipientes terem sido preparados, coloque-os em uma estufa a 80 graus Celsius até que a mistura de parafina derreta. Isso deve levar cerca de 10 minutos. Em seguida, retire os recipientes e coloque-os sobre uma superfície plana, deixando a mistura de parafina solidificar por pelo menos um minuto.

Coloque as placas de cabeça para baixo e posicione-as sob uma campânula. Ligue a luz ultravioleta por 30 minutos para esterilizar tanto o interior das tampas quanto a base das câmaras. Em seguida, revestimento.

Cubra as câmaras com lamínulas de poli-D-lisina por uma hora. Em seguida, enxágue cuidadosamente as lamínulas revestidas de três a cinco vezes com água desionizada estéril filtrada para remover todos os vestígios de tampão bore. Após o enxágue final, use um vácuo para secar as câmaras. Estas podem ser usadas imediatamente ou armazenadas em uma sala de cultura de tecidos para uso posterior.

As câmaras revestidas devem ser usadas dentro de uma semana após a preparação, caso sejam preparadas culturas de longo prazo. As camadas alimentadoras de glia cortical precisarão ser iniciadas de duas a três semanas antes de prosseguir com as dissecações corticais ou hipocampais. Coloque os cérebros de quatro camundongos P1 a P3 em uma placa contendo meio de dissecação frio e posicione-a sob o microscópio estereoscópico.

Remova os bulbos olfativos, os dois hemisférios cerebrais e as meninges. Transfira os hemisférios para um novo recipiente contendo sem meio. Usando uma lâmina de barbear estéril e limpa, pique os córtices o mais finamente possível.

Em seguida, com uma pipeta de plástico, transfira o tecido picado para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 12 mililitros de meio de dissecação frio. Adicione tripsina e DNAse a concentrações finais de 0,25% e 0,1%, respectivamente. Incube em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos, com agitação intermitente.

Após a incubação, remova o tubo do banho-maria e limpe-o completamente com etanol 70% antes de levá-lo para a capela de cultura de tecidos. Pipete o tecido cortical para cima e para baixo.

Com uma pipeta de 10 mililitros, aspire e expulse aproximadamente 10 a 15 vezes ou até que a maioria dos fragmentos desapareça, retorne o tubo ao banho-maria por mais 10 minutos com agitação intermitente. Novamente, limpe completamente o tubo com etanol 70% e leve-o de volta à capela de cultura de tecidos.

Pipete o tecido cortical para cima e para baixo. Desta vez, como antes, com uma pipeta de cinco mililitros, adicione 15 mililitros de meio glial aquecido e centrifugue a 1000 RPM por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em pellet em 20 mililitros de meio glial fresco.

Utilize um hemocitômetro para contar as células. Em seguida, plaque de cinco a 7,5 milhões de células em 15 mililitros de meio glial por frasco de 75 centímetros quadrados. Coloque as células no incubador a 37 graus Celsius e, após um dia e a cada dois ou três dias subsequentes em cultura, desprenda quaisquer células soltas batendo o frasco contra a superfície da cabine de segurança.

Remova o meio juntamente com quaisquer células destacadas e substitua por 15 mililitros de meio glial fresco. O meio glial pode ser colhido após uma a duas semanas de crescimento nos frascos, quando estiverem prestes a atingir 100% de confluência. Para preparar lamínulas individuais revestidas com glia, comece colocando seis lamínulas limpas com ácido nítrico e esterilizadas.

Lâminas de cobertura redondas de 25 milímetros em uma placa de 10 centímetros e, usando um pincel pequeno, coloque três pontos da mistura três para um de parafina com vaselina. Em cada lâmina de cobertura, disponha os pontos em um padrão triangular. Coloque dois pontos nas bordas da lâmina de cobertura para fixá-la à placa.

Trate as placas abertas com luz UV por 30 minutos. Revestir as lamínulas com poli-D-lisina por uma hora. Em seguida, lave abundantemente três a cinco vezes com água desionizada estéril filtrada e deixe secar, removendo as células gliais do incubador.

Descarte o meio e lave com cinco mililitros de tripsina pré-aquecida. Adicione três mililitros de tripsina ao frasco e incube por um minuto a 37 graus Celsius. Assim que as células se desprendem, adicione cinco mililitros de meio glial para interromper a ação da tripsina.

Remova o GL do frasco pipetando para cima e para baixo de 10 a 15 vezes. Em seguida, transfira o meio para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 1000 RPM durante oito minutos. Após a centrifugação, ressuspenda as células em 10 mililitros de meio glial.

Em seguida, após a contagem celular, plaque cinco vezes 10 à quinta células em 12,5 mililitros de meio glial por placa de 10 centímetros contendo lamínulas. Troque o meio por meio glial fresco, previamente aquecido, a cada dois ou três dias, no dia anterior à dissecação neuronal. Remova o meio glial e substitua por meio sem soro.

Utilize posteriormente este meio livre de soro condicionado por gliócitos. Ao inundar culturas corticais ou hipocampais, adiciona-se um C a uma concentração final de cinco micromolares. A fim de prevenir a proliferação de gliócitos, utilize os reagentes de nucleofecção por transfeção conforme indicado nas instruções do fabricante e, em seguida, aqueça a solução até a temperatura ambiente.

Coloque uma placa contendo cérebros de camundongo E 15,5 em meio de dissecção frio. Sob microscópio estereoscópico, use uma agulha de tungstênio curvada para remover ambas as neocortes. Em seguida, utilizando pinças finas, remova as meninges e coloque as cortes em uma nova placa com meio de dissecção frio.

O hipocampo e o córtex são visíveis ao longo do lado medial do hemisfério cerebral com tesoura de íris pequena. Remova cuidadosamente o hipocampo. Em seguida, remova o córtex restante.

Repita a dissecação em cérebros de toda a ninhada. Coloque os córtices do hipocampo em tubos microcentrífugos separados de 1,5 mililitro contendo um mililitro de meio de dissecação frio. Coloque os tubos no gelo após dissecar todos os córtices nos hipocampos.

Adicione 110 microlitros de tripsina a 2,5% aos tubos microfuga contendo o tecido e coloque os tubos em um incubador a 37 graus Celsius por 20 minutos. Usando uma pipeta P1000, remova o máximo de fluido possível do tubo. Em seguida, adicione um mililitro de meio de plaqueamento a cada tubo e lave o tecido invertendo suavemente o tubo microfuga.

Repita a lavagem duas vezes. Após a última lavagem, adicione um mililitro de meio de plaqueamento. Utilize uma pipeta P1000 para triturar os fragmentos 15 vezes. Em seguida, transfira o sobrenadante e as células para um novo tubo cônico de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio de plaqueamento, deixando quaisquer fragmentos remanescentes no tubo microcêntrifugo.

Centrifugue o tubo de 15 mililitros a 350 RPM durante sete minutos com a frenagem desativada após a centrifugação, descarte o sobrenadante e adicione 100 microlitros da solução de afetação nuclear pré-misturada em temperatura ambiente. Pipete para cima e para baixo cinco vezes para misturar. Em seguida, transfira 100 microlitros da solução de afetação nuclear e da mistura celular para cada novo tubo microcêntrifuga contendo uma quantidade apropriada de DNA — um a dois microgramas de DNA por transfeção — para culturas de longo prazo, o que rotulará menos de 10% dos neurônios na cultura.

Embora cinco a dez microgramas de DNA por transfeção resultem em uma eficiência de transfeção mais alta para o cultivo, adicione a suspensão celular e a mistura de DNA a um vete de eletroporação. Em seguida, coloque o vete no eletro. Para neurônios do SNC de camundongo, configure o programa do nucleo efetor para oh 0 0 5; trabalhando rapidamente, adicione 500 microlitros do meio de plating pré-aquecido e equilibrado ao qve e transfira a solução celular para um novo tubo microfuge de 1,5 mililitro.

Adicione quantidade suficiente de meio de plaqueamento para levar o volume de cada transfeção a um mililitro. Após a contagem das células, plaque de três a cinco vezes 10 à terceira células por centímetro quadrado para culturas jovens, ou de cinco a dez vezes 10 à terceira células por centímetro quadrado para culturas de longo prazo, geralmente cinco vezes 10 à quinta ou uma vez 10 à sexta. As células são usadas por transfeção para preparar culturas de curto prazo.

Uma hora após a semeadura, alague as placas de cultura de 35 milímetros com dois mililitros de meio livre de soro, equilibrado com dióxido de carbono e aquecido. As câmaras de imagem resultam em um teor muito baixo de soro, inferior a 0,5%. Culturas de curto prazo não precisam ser cultivadas com uma camada de apoio de gliócitos e não precisam ser resemadas. Para preparar culturas de longo prazo, adicione um mililitro de condição glial ao meio livre de soro.

Remova uma lamínula com cobertura de GL contendo três gotas de vaselina parafínica e inverta-a sobre o orifício de 15 milímetros na placa de 35 mm. Em seguida, adicione mais um mililitro de meio para alimentar os cultivos de longo prazo. Substitua um terço do meio sem soro a cada dois ou três dias.

Após cinco a sete dias em cultura, citosina arábica IDE ou AEE é adicionada a uma concentração final de cinco micromolar para prevenir a proliferação glial. As imagens pareadas a seguir de neurônios hipocampais vivos representativos mostram tanto uma imagem de contraste de interferência diferencial quanto uma micrografia fluorescente correspondente. Cada uma dessas células foi transfectada com EGFP, tubulina e DS Red dois em vetores PA.

Na fase um, os neurônios inicialmente se fixarão e, ao longo de um período de aproximadamente um dia, emitirão lâminas semelhantes a lamelopódios e prolongamentos digitiformes semelhantes a filopódios ao redor da periferia do corpo celular. Na fase dois, as protrusões iniciais se diferenciarão em vários neuritos que se originam do corpo celular, permanecendo geralmente com cerca de 30 a 50 micrômetros de comprimento. Na fase três, estocasticamente, um dos neuritos começa a se alongar rapidamente para tornar-se o axônio.

Os outros neuritos permanecem curtos e são denominados processos menores. A maioria dos neurônios do hipocampo e do córtex progride para a fase três entre dois e três dias em cultura. Durante a fase quatro, que ocorre na semana ou nas duas semanas seguintes, os processos menores espessam, alongam e ramificam-se para se tornarem as dendrites, mostradas aqui em verde. Enquanto isso, o axônio afinase à medida que continua a crescer e ramificar entre duas e três semanas.

Em cultura, os dendritos se diferenciam formando espinhos dendríticos, pequenas protuberâncias ao longo dos dendritos. Neurônios na fase cinco variarão em forma e tamanho, mas a maioria deverá passar por essa série de estágios de desenvolvimento. Neurônios transfectados podem não progredir por essas fases se a superexpressão de proteínas interromper o desenvolvimento neuronal.

Além disso, os neurônios podem não progredir por todas as fases do desenvolvimento. Se as lamínulas não forem limpas adequadamente ou se a politlisina não aderir corretamente, as glias também podem proliferar extensivamente, especialmente se um C não for utilizado. Esta é uma imagem de contraste de fase de um cultivo com duas semanas de idade no qual as glias tomaram conta do cultivo em culturas de longo prazo.

Alterar o meio com muita frequência ou com pouca frequência também pode comprometer a viabilidade dos neurônios. Esta é uma imagem de contraste de fase de uma cultura na qual a maioria dos neurônios morreu e os neurônios remanescentes apresentam corpos celulares encolhidos e prolongamentos com aspecto em conta. Para comparação, esta é uma imagem de contraste de fase de neurônios hipocampais saudáveis após duas semanas em cultura. Observe os corpos celulares maiores e a ausência de espessamentos em forma de conta nos prolongamentos.

Além disso, nesta fase, os processos dendríticos já se tornaram mais espessos e há uma extensa rede de processos axonais. Uma vez dominados, o isolamento de embriões, o dissecção cortical, a transfeção e o plaqueamento de toda uma ninhada de fetos podem ser realizados em duas horas, se executados corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os neurônios hipocampais e corticais são muito sensíveis à perturbação mecânica.

Além disso, é importante manter as soluções o mais frias possível durante o isolamento de neurônios para manter a atividade metabólica baixa. Após este procedimento, outros métodos, como imagem de células vivas e gravação fisiológica da atividade, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma como proteínas de fusão fluorescentes de interesse se segregam para diferentes regiões do neurônio. Se a localização proteica está associada a alterações na atividade sináptica, ou como as funções dessas proteínas são afetadas por diferentes tratamentos farmacológicos.