Name: Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Aprenda a nucleofeção e cultura primária de neurônios hipocampais e corticais de embriões de rato. Este método permite estudar dinâmicas de proteínas fluorescentes durante o desenvolvimento neuronal e plasticidade sináptica.

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Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade de Wisconsin Comissão do Animal Care e estavam em acordo com as diretrizes do NIH. Agradecemos ao Dr. Katherine Kalil para o uso generoso do seu dispositivo Nucleofector. Agradecemos também aos membros do laboratório de Dent para comentários sobre o protocolo. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH R01-NS064014, Dana Foundation e Fundação para Whitehall EWD Christopher Viesselmann, Jason Ballweg e Derek Lumbard contribuíram igualmente para este papel.

1. Preparação de Lamelas e Câmaras <ol><li> Preparação de lamelas limpo e câmaras é essencial para culturas saudáveis. Atalhos não deve ser tomado em qualquer uma dessas etapas. </li><li> Lavar as lamelas (redondo 12mm ou 22mm, de vidro alemão - Carolina Marca Assistant) durante a noite em ácido nítrico concentrado (HNO3) em uma jarra de vidro dedicado ou copo. </li><li> Retirar as lamelas de ácido nítrico e lavar extensivamente (5-7x) em água deionizada. </li><li> Separar as lamelas e seco em uma capela de fluxo laminar ou gabinete de biossegurança. Quando seca, esterilizá-las com a luz UV por 30 minutos. Lugar lamínulas esterilizadas em pratos de Petri estéreis para armazenamento. Se os neurônios plaqueamento em lamínulas 12 milímetros diretamente lamínulas lugar em um prato estéreis de 35 mm e prossiga para a Secção 2. </li><li> Câmaras de imagens são construídos por perfuração de um furo 15mm no fundo de pratos de Petri 35 milímetros (remover todas as rebarbas) e anexar as lamelas limpos com uma mistura 3:1 de parafina e vaselina. </li><li> Derreta a parafina / mistura de geléia de petróleo em um tubo cônico dentro de um banho de água fervente. Use um pincel pequeno e revestimento de baixo do prato ao redor do buraco 15mm. Certifique-se manter a parafina agitação / mistura de geléia de petróleo, uma vez que irá separar. Isso geralmente resulta em câmaras coladas com uma maior concentração de vaselina, que se tornará viscoso quando os pratos são colocados na incubadora, resultando em descolamento lamela. A parafina restante / vaselina pode ser armazenado em temperatura ambiente. </li><li> Coloque o prato de cabeça para baixo em uma bandeja plana e coloque a lamínula sobre o buraco. Calor em 80 ° C forno até que a mistura de parafina é derretida (~ 10 minutos). Retire os pratos em uma superfície plana e deixe o jogo mistura de parafina. </li><li> Vire os pratos mais e esterilizar tanto o interior das tampas e os fundos de câmaras com luz UV. </li><li> Lamínulas casaco ou regiões copo de câmaras com 1.0mg/mL Poly-d-lisina (30kDa) em borato tampão (0,1 M de borato de sódio, pH 8,5) por uma hora. Enxágüe 3-5 vezes com grandes quantidades de água grau cultura de tecido deionizada. Certifique-se de remover todos os vestígios de tampão borato. Seco e use imediatamente ou armazenar câmaras / lamínulas para uso posterior. Nós usamos geralmente lamínulas limpo dentro de um mês de preparação. </li></ol> 2. Preparação de Dissection Neuronal e meio de cultura <ol><li> Prepare o suporte de dissecção (DM) pela adição de quantidades adequadas de HBSS 10x e HEPES 100X para o tecido de água grau cultura. Armazenar a 4 ° C. Manter em gelo durante a dissecção. </li><li> O dia antes da dissecção preparar o meio de revestimento (PM) e sem soro médio (SFM). PM é composto por Medium Neurobasal, B27 suplemento, 2 mM de glutamina, glicose 0,3%, 37,5 mM NaCl e 5% de soro fetal bovino (FBS). SFM é composto por Medium Neurobasal, B27 suplemento, 2 mM de glutamina, glicose 0,3% e 37,5 mM NaCl. </li><li> Faça apenas o suficiente para a dissecção e armazenar em um cultura de tecidos incubadora durante a noite com a tampa entreaberta para que a temperatura eo teor de CO 2 da equilibra médio. Nós adicionamos glicose extra e aumentar a osmolalidade de aproximadamente 310mOsm com NaCl. Encontramos as culturas fazer melhor em uma osmolaridade mais fisiológica (osmolalidade Neurobasal é tipicamente 205-245mOsm). </li></ol> 3. Preparação da camada cortical Glial Alimentador de longo prazo Culturas <ol><li> Se a longo prazo são culturas que estar preparado, realizar esta parte do protocolo de duas a três semanas antes de continuar com as dissecações cortical ou do hipocampo. </li><li> Prepare médio glial (GM) com MEM, a glicose 0,3%, penicilina / estreptomicina e soro de cavalo de 10%. </li><li> Euthanize filhotes P1-P3 do mouse pelo resfriamento em gelo por 5 minutos. Retire cada filhote do gelo e spray com etanol 70%. Rapidamente decapitar com uma tesoura. Remova todo o cérebro a um prato contendo frio DM (passo 2.1). </li><li> Remova os dois hemisférios cerebrais e das meninges. Neocórtex o consumo e remover para um novo prato que não contém mídia. Prepare córtices de 4 cérebros total. </li><li> Picar os córtices com uma lâmina de barbear limpa, estéril mais fino possível e remover o tecido cortado com uma pipeta de plástico para um tubo cônico de 50 mL contendo 12 mL de frio DM. Adicionar tripsina e DNase para concentrações finais de 0,25% (1,5 mL) e 0,1% (1,5 mL), respectivamente. Incubar em banho-maria a 37 ° C por 10 minutos, sob agitação intermitente. </li><li> Remova o tubo que contém o tecido cortical e limpar cuidadosamente com etanol 70% antes de trazer para a capa de cultura de tecidos. Tecido cortical pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL aproximadamente 10-15 vezes, ou até mais pedaços desaparecem. </li><li> Retornar o tubo a 37 ° C em banho-maria por mais 10 minutos, sob agitação intermitente. </li><li> Limpe cuidadosamente o tubo com etanol 70% e trazê-lo de volta para a capa de cultura de tecidos. Pipeta o tecido cortical cima e para baixo com um m 5L pipeta cerca de 10-15 vezes, ou até que os pedaços desaparecem. </li><li> Adicionar 15 mL de GM quente e centrifugar a 200xg (1000rpm) por 10 minutos. </li><li> Elimine o sobrenadante, ressuspender as células peletizada em 20 mL de GM fresco e contar com um hemocitômetro. Placa 5 7.5x10 6 células em 15 mL de GM por 75 centímetros balão 2. </li><li> Depois de um dia e cada 2-3 dias subseqüentes na cultura, desalojar células soltas batendo o frasco contra a sua mão. Remova a mídia, juntamente com as células desalojadas e substituir com 15 mL de GM fresco. </li><li> Glia pode ser colhida após 1-2 semanas de crescimento nos frascos, quando eles estão prestes 70-100% confluentes. Para preparar lamínulas individuais revestidos com glia, lugar de ácido nítrico 6 limpos e esterilizados 25 milímetros lamínulas redondas em um prato de 10cm, e coloque 3 pontos da mistura 3:1 de parafina / vaselina em cada lamela em um padrão triangular com um pequeno pincel . Tratar pratos aberto com luz UV por 30 minutos. Brasão as lamelas com 0,1 mg / mL Poly-d-lisina (30kDa) em tampão borato de uma hora, depois lave bastante (3-5x) com água estéril grau de cultura de tecidos deionizada e deixar secar. </li><li> Retirar o balão da glia, contendo a partir de incubadora, descartar a médio e enxágüe com 5 mL de pré-aquecido tripsina / EDTA. Remover a solução de tripsina / EDTA do frasco e pipeta de 3 mL de frescos pré-aquecido tripsina / EDTA para o balão. Incubar o balão durante 1 minuto a 37 ° C antes de adicionar 5 mL de GM para parar o tripsinização. </li><li> Remova o frasco da glia por repetidas pipetagens 10-15 vezes, e depois transferir os meios de comunicação a um tubo de 15 mL cônico. Centrifugar a 200xg (1000rpm) por 8 minutos. Remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de GM, contagem de células, e placa de 5x10 5 células em 12,5 mL de GM por 10 centímetros prato contendo as lamelas. </li><li> Troca o meio com frescos pré-aquecido GM a cada 2-3 dias. O dia antes da dissecção neurônio, remova a GM e substituir com SFM (seção 2.2). Utilize este SFM glial-condicionado no passo 4,12 quando a inundação culturas corticais ou hipocampais. </li></ol> 4. Dissecação cortical e / ou hipocampo e Eletroporação <ol><li> Remover quantidades apropriadas de soluções nucleofection (Lonza), combinar e à temperatura ambiente antes de iniciar a dissecação. Como a solução Nucleofection tem uma duração limitada quando combinado, só combinar a quantidade necessária para cada preparação (100 mL por transfecção). </li><li> Euthanize um rato grávidas em E15.5 com CO 2 (dia de plug é E0.5) e remover o útero de uma placa de Petri de 10 cm. Remover fetos e decapitar em frio DM (seção 2.1). </li><li> Remova todo o cérebro em um prato separado de DM frio e com uma agulha de tungstênio dobrado, remova os dois neocórtices. Remove as meninges com micropinças e córtices lugar em novo prato da DM frio. Com uma tesoura pequena íris ou Wecker, remova o córtex ou hipocampo e coloque em um tubo de 1,5 mL cheio Eppendorf com 1,0 mL de frio DM. Manter este tubo em gelo. </li><li> Depois de dissecar todos os córtices ou hipocampo, adicione 110 mL de tripsina 2,5% para o tubo Eppendorf contendo o tubo de tecido e coloque em uma incubadora de 37 ° C por 20 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante e lavar córtices ou hipocampo com 1,0 mL PM (seção 2.2) invertendo suavemente o tubo Eppendorf. Repetir a lavagem duas vezes, deixando 1 mL da PM no tubo. </li><li> Triturar os pedaços 15 vezes com uma pipeta P1000, e remover as células sobrenadante / para um novo tubo de 15 mL cônico contendo 4 mL de PM, deixando qualquer pedaços que permanecem no tubo de Eppendorf. </li><li> Girar o tubo de 15 ml em 20xg (350 rpm) por 7 minutos com o freio. Desprezar o sobrenadante e adicionar 100 mL de pré-misturado, a solução nucleofection temperatura ambiente (Lonza) para cada transfecção. Triturar 5 vezes com um movimento suave para cima e para baixo da pipeta P1000. </li><li> Remover 100 mL da solução de mistura nucleofection / célula a cada tubo Eppendorf novo e adicionar a quantidade adequada de DNA. Por muito tempo as culturas termo geralmente usamos 1-2μg de DNA por transfecção. No entanto, este etiquetas apenas uma pequena proporção &lt;10% dos neurônios na cultura. Geralmente usamos 5-10μg de DNA por transfecção se querem maior eficiência de transfecção para a cultura de curto prazo. Temos utilizado até um total de 40μg de DNA, quando transfecting com dois plasmídeos diferentes. Plasmídeos são armazenadas em tampão TE a 1μg / mL. </li><li> Adicionar suspensão de células / DNA para a cubeta (Lonza) e electroporate as células do Nucleofector (Lonza), usando o programa O-005 (neurônios do SNC Mouse). </li><li> Trabalhando rapidamente, adicionar 500 mL da PM pré-aquecido e equilibrado para a cuvete e remoção da solução / células para um novo tubo de 1,5 mL Eppendorf. Adicionar PM suficiente para trazer o volume de cada transfecção a 1,0 mL. Contar as células com um hemocitômetro e placa em 3-5x10 3 células / cm 2 para as culturas jovens, ou 5-10x10 3 células / cm 2 para o longo prazo culturas. &lt;/ Li&gt; </li><li> De curto prazo culturas, inundar a placas de cultura de 35mm com 2,0 mL de aquecido, CO 2-SFM equilibrada após uma hora de galvanização. Se estiver usando lamínulas, nós removemos a metade da PM e substituí-lo com SFM, em seguida, repita mais duas vezes. Nem as câmaras cheias de imagens ou lavar os resultados lamínulas em um teor muito baixo de soro (&lt;0,5%). Curto prazo culturas não precisa ser cultivada com uma camada de alimentação glial e não precisam ser re-alimentados. </li><li> A longo prazo culturas, nós removemos uma lamela glia coberto com três pontos de parafina / vaselina e invertê-lo em cima do buraco 15 milímetros no prato de 35 mm, uma hora após o início do cultivo. Dois mililitros do SFM condicionado do prato glial é então adicionado à câmara de imagem. Para alimentar as culturas de longo prazo, nós removemos um terço do SFM cada 2-3 dias e substituí-lo com frescos, pré-aquecido e CO 2-SFM equilibrada. </li></ol> 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Viva os neurônios do hipocampo em fases sucessivas de desenvolvimento. Emparelhados imagens de representante vivo neurônios do hipocampo são mostrados como tanto uma imagem de contraste de interferência diferencial e uma micrografia correspondente fluorescente. Cada uma dessas células tem sido transfectadas com EGFP-tubulina e DsRed2 em vetores pCAX. Os neurônios foram fotografadas no dia seguinte in vitro (DIV): Fase 1 (1DIV), Stage 2 (1DIV), Fase 3 (2DIV), Fase 4 (11DIV) e Stage 5 (32DIV). Barra de escala é 20Hm.

<ol><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li>
<li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li>
<li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li>
<li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+Ena%2FVASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li>
<li>Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeberg%2C+PJ+%22Neurons%3A+Methods+and+Applications+for+the+Cell+Biologist%22">Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist</a>. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. , Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo para cultivo embrionário neurônios do hipocampo do rato e cortical foi desenvolvido como uma modificação do protocolo de Banker, que usa 1,2 neurônios de rato. Nós temos usado esse protocolo para mouse cultura e neurônios hamster bem 3,4,5,6,7. Este protocolo funciona igualmente bem para ambos os neurônios do hipocampo e neocortical e é semelhante a um protocolo publicado pela Meberg e Miller 8. Geralmente, nós usamos os neurônios do hipocampo para o longo prazo de cultura, porque eles estão bem caracterizadas e um sistema modelo mais estabelecida. Além disso, são susceptíveis de conter uma população mais homogênea de neurônios do neocórtex. No entanto, os neurônios neocorticais cultivadas usando este protocolo também sobrevivem e se diferenciam de forma semelhante (dados não publicados). Nós usam rotineiramente os neurônios do hipocampo e neocortical para a cultura de curto prazo. Dissecção do neocórtex também resulta em neurônios substancialmente mais (1.5x10 6 neurônios por par de córtices) do que a dissecação do hipocampo (2.5x10 5 neurônios por par de hipocampo), o que torna uma melhor escolha do material para secar Ocidental, por exemplo. Como acontece com qualquer cultura primária, é essencial para minimizar o tempo que leva desde a morte do animal para o revestimento das células. Ele geralmente leva 10-20 dissecções para se tornar consistentemente rápido em dissecção e revestimento. Além disso, ao trabalhar com o Nucleofector Lonza, é fundamental para trabalhar com rapidez durante o processo de eletroporação, como a viabilidade dos neurônios diminui rapidamente se forem deixados no buffer nucleofection. Grande parte da nossa imagem é realizado com microscopia de fluorescência interna reflectância total (TIRFM). Este tipo de microscopia só é capaz de imagem várias centenas de nanômetros além da lamela. Portanto, as áreas dos neurônios que freqüentemente imagem, o cone de crescimento axonal e espinhas dendríticas, devem ser respeitados diretamente para a lamela. Assim, usamos as culturas de baixa densidade que exigem alimentação glial de longo prazo de cultura. Temos usado as culturas de maior densidade (&gt; 2x10 4 células / cm 2), sem camadas de alimentação glial, a longo prazo culturas e descobriram que eles sobrevivem muito bem com a alimentação pouco. No entanto, as espinhas dendríticas desses neurônios são muitas vezes muito longe do substrato para a imagem em TIRFM, embora possam ser facilmente detectados com ampla microscopia de campo ou microscopia confocal. Na maioria dos nossos estudos, transfectar neurônios antes do plaqueamento, e ter imaginado proteínas fluorescentes marcado por até três meses em cultura. Esta expressão de longo prazo de proteínas fluorescentes marcado nos dá confiança de que, ao utilizar baixas concentrações de DNA (1-2μg) que não estão produzindo artefatos superexpressão nos neurônios. No entanto, este procedimento também pode ser usado para estudar a superexpressão de proteínas se grandes quantidades de DNA são utilizadas (10-20μg). Os plasmídeos que usamos para transfecção neurônios geralmente contêm proteínas de fusão EGFP ou mCherry, embora também rótulo do citoplasma neuronal com DsRed2 ou EGFP sozinho. Esta técnica funciona bem eletroporação com um número de vetores. Nós preferimos plasmídeos que contêm um promotor de β-actina com um enhancer CMV e β-globina cauda poli-A (pCAGGs ou pCAX plasmídeos) 9, devido aos níveis relativamente altos de expressão, eo fato de que eles são bem tolerados pelos neurônios tanto na cultura de curto e longo prazo. Geralmente, as proteínas começam a se expressar dentro de cerca de 4 horas de revestimento e alcançar níveis suficientes para a imagem latente dentro de 10-24hs 10. Temos utilizado com sucesso CMV-promotor-driven plasmídeos em curto prazo culturas, mas descobriram que eles podem causar altos níveis de superexpressão que matam neurônios em longo prazo de cultura. No entanto, temos verificado que o condicionamento glial de culturas de baixa densidade ajuda na sobrevivência de neurônios transfectadas com CMV-promotor plasmídeos impulsionado, em comparação com maior densidade (não-glial alimentados) culturas.

* A maioria dos reagentes que nós armazenamos a -80 ° C podem ser armazenadas a -20 ° C também. Armazenando-os a -80 ° C aumenta sua vida útil e os resultados em culturas pouco mais consistente.

nucleofection e cultura primária de neurônios do hipocampo do rato embrionárias e cortical

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Neurônios do hipocampo e cortical tem sido amplamente utilizado para o estudo do sistema nervoso central (SNC) de polarização neuronal, axônio / dendrite conseqüência, e formação de sinapses e função. Uma vantagem do cultivo desses neurônios é que eles prontamente polarizar, formando axônios e dendritos distintivo, sobre um substrato bidimensional em densidades muito baixas. Esta propriedade tornou-os extremamente útil para determinar muitos aspectos do desenvolvimento neuronal. Além disso, através do fornecimento condicionado glial para estes neurônios que continuará a desenvolver, formando conexões sinápticas funcionais e sobreviver por vários meses em cultura. Neste protocolo, esboçamos uma técnica para dissecar, cultura e transfectar neurônios do hipocampo e embrionárias de camundongos cortical. Transfecção é realizado por electroporating DNA nos neurônios antes do plaqueamento via nucleofection. Este protocolo tem a vantagem de expressar proteínas de fusão fluorescente-tag no início do desenvolvimento (~ 4-8hrs após o plaqueamento) para estudar a dinâmica e função de proteínas durante a polarização conseqüência axônio, e de ramificação. Também descobrimos que este transfecção único antes do plaqueamento mantém a expressão da proteína fluorescente-tag de fusão em níveis adequados para a imagem latente durante toda a vida do neurônio (&gt; 2 meses em cultura). Assim, esta metodologia é útil para estudar a localização de proteínas e função ao longo do desenvolvimento do SNC, com pouca ou nenhuma perturbação da função neuronal.

Este protocolo descreve os passos necessários para dissecar, transfectar via de eletroporação e neurônios do hipocampo e da cultura do mouse cortical. Curto prazo, as culturas podem ser utilizados para estudos sobre crescimento do axônio e orientação, enquanto culturas a longo prazo podem ser usados ​​para estudos de sinaptogênese e análise espinha dendrítica.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Neurônios hipocampais e corticais têm sido amplamente utilizados para estudar a polarização neuronal do sistema nervoso central (SNC), o crescimento de axônios/dendritos e...

Neurônios do hipocampo e do córtex têm sido amplamente utilizados para estudar a polarização neuronal do sistema nervoso central, o crescimento de axônios e dendritos e a formação e função de sinapses. Uma vantagem do cultivo desses neurônios é que eles polarizam prontamente, formando axônios e dendritos distintos em um substrato bidimensional, com densidades muito baixas. Este vídeo demonstra uma técnica para dissecar, cultivar e transfectar neurônios embrionários do hipocampo e do córtex de camundongo por nucleofecção, o que permite a expressão de proteínas de fusão marcadas com fluoróforo no início do desenvolvimento, aproximadamente quatro a oito horas após o semeadura. A expressão das proteínas marcadas com fluoróforo é mantida durante toda a vida do neurônio, por mais de dois meses em cultura. Isso possibilita o estudo da função proteica durante eventos iniciais do desenvolvimento, como o crescimento axonal, e eventos posteriores, como a sinaptogênese e a plasticidade sináptica.Primeiramente, as células gliais são isoladas de hemisférios corticais de camundongos pós-natais de um a três dias de idade e semeadas em frascos. Após atingirem de 70 a 100% de confluência, as células gliais são então replantadas em lamínulas de vidro.Em seguida, neurônios do hipocampo ou do córtex são isolados de camundongos E 15,5 e transfectados por nucleofecção com plasmídeos que codificam proteínas de fusão fluorescentes, como a proteína fluorescente vermelha. Os neurônios transfectados são então semeados em câmaras de imagem para estudos de curta duração. Para culturas de longa duração, células gliais em lamínulas de vidro são invertidas sobre culturas de hipocampo ou córtex para fornecer suporte trófico, permitindo que neurônios individuais sejam analisados por microscopia para demonstrar a localização dinâmica das proteínas de fusão ao longo dos axônios ou dendritos dos neurônios.Olá, sou Eric Dent, professor assistente de anatomia na Universidade de Wisconsin-Madison. Hoje, três dos meus alunos de graduação, Chris Wezelman, Jason Bwe e Derek Lombard, vão demonstrar um procedimento para o isolamento, semeadura e manutenção de culturas de neurônios corticais e hipocampais para cultivo de curto e longo prazo. Essas culturas podem ser utilizadas para estudar a dinâmica de proteínas de fusão fluorescentes durante todo o desenvolvimento neuronal, desde o crescimento inicial dos neuritos até o desenvolvimento de axônios e dendritos e a sinaptogênese.Para preparar as câmaras para a aquisição de imagens de neurônios hipocampais e corticais de camundongo embrionário, inicie com placas de Petri de 35 milímetros com orifícios de 15 milímetros perfurados no fundo e todas as rebarbas removidas. Derreta uma mistura de parafina e vaselina na proporção de três para um em um tubo cônico, colocando-o em um banho-maria fervente.Em seguida, use um pincel pequeno para revestir a parte inferior da placa ao redor do orifício. Certifique-se de mexer a mistura de parafina e vaselina entre as câmaras, pois ela se separará. Coloque a lamínula sobre o orifício.Após todos os recipientes terem sido preparados, coloque-os em uma estufa a 80 graus Celsius até que a mistura de parafina derreta. Isso deve levar cerca de 10 minutos. Em seguida, retire os recipientes e coloque-os sobre uma superfície plana, deixando a mistura de parafina solidificar por pelo menos um minuto.Coloque as placas de cabeça para baixo e posicione-as sob uma campânula. Ligue a luz ultravioleta por 30 minutos para esterilizar tanto o interior das tampas quanto a base das câmaras. Em seguida, revestimento.Cubra as câmaras com lamínulas de poli-D-lisina por uma hora. Em seguida, enxágue cuidadosamente as lamínulas revestidas de três a cinco vezes com água desionizada estéril filtrada para remover todos os vestígios de tampão bore. Após o enxágue final, use um vácuo para secar as câmaras. Estas podem ser usadas imediatamente ou armazenadas em uma sala de cultura de tecidos para uso posterior.As câmaras revestidas devem ser usadas dentro de uma semana após a preparação, caso sejam preparadas culturas de longo prazo. As camadas alimentadoras de glia cortical precisarão ser iniciadas de duas a três semanas antes de prosseguir com as dissecações corticais ou hipocampais. Coloque os cérebros de quatro camundongos P1 a P3 em uma placa contendo meio de dissecação frio e posicione-a sob o microscópio estereoscópico.Remova os bulbos olfativos, os dois hemisférios cerebrais e as meninges. Transfira os hemisférios para um novo recipiente contendo sem meio. Usando uma lâmina de barbear estéril e limpa, pique os córtices o mais finamente possível.Em seguida, com uma pipeta de plástico, transfira o tecido picado para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 12 mililitros de meio de dissecação frio. Adicione tripsina e DNAse a concentrações finais de 0,25% e 0,1%, respectivamente. Incube em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos, com agitação intermitente.Após a incubação, remova o tubo do banho-maria e limpe-o completamente com etanol 70% antes de levá-lo para a capela de cultura de tecidos. Pipete o tecido cortical para cima e para baixo.Com uma pipeta de 10 mililitros, aspire e expulse aproximadamente 10 a 15 vezes ou até que a maioria dos fragmentos desapareça, retorne o tubo ao banho-maria por mais 10 minutos com agitação intermitente. Novamente, limpe completamente o tubo com etanol 70% e leve-o de volta à capela de cultura de tecidos.Pipete o tecido cortical para cima e para baixo. Desta vez, como antes, com uma pipeta de cinco mililitros, adicione 15 mililitros de meio glial aquecido e centrifugue a 1000 RPM por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em pellet em 20 mililitros de meio glial fresco.Utilize um hemocitômetro para contar as células. Em seguida, plaque de cinco a 7,5 milhões de células em 15 mililitros de meio glial por frasco de 75 centímetros quadrados. Coloque as células no incubador a 37 graus Celsius e, após um dia e a cada dois ou três dias subsequentes em cultura, desprenda quaisquer células soltas batendo o frasco contra a superfície da cabine de segurança.Remova o meio juntamente com quaisquer células destacadas e substitua por 15 mililitros de meio glial fresco. O meio glial pode ser colhido após uma a duas semanas de crescimento nos frascos, quando estiverem prestes a atingir 100% de confluência. Para preparar lamínulas individuais revestidas com glia, comece colocando seis lamínulas limpas com ácido nítrico e esterilizadas.Lâminas de cobertura redondas de 25 milímetros em uma placa de 10 centímetros e, usando um pincel pequeno, coloque três pontos da mistura três para um de parafina com vaselina. Em cada lâmina de cobertura, disponha os pontos em um padrão triangular. Coloque dois pontos nas bordas da lâmina de cobertura para fixá-la à placa.Trate as placas abertas com luz UV por 30 minutos. Revestir as lamínulas com poli-D-lisina por uma hora. Em seguida, lave abundantemente três a cinco vezes com água desionizada estéril filtrada e deixe secar, removendo as células gliais do incubador.Descarte o meio e lave com cinco mililitros de tripsina pré-aquecida. Adicione três mililitros de tripsina ao frasco e incube por um minuto a 37 graus Celsius. Assim que as células se desprendem, adicione cinco mililitros de meio glial para interromper a ação da tripsina.Remova o GL do frasco pipetando para cima e para baixo de 10 a 15 vezes. Em seguida, transfira o meio para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 1000 RPM durante oito minutos. Após a centrifugação, ressuspenda as células em 10 mililitros de meio glial.Em seguida, após a contagem celular, plaque cinco vezes 10 à quinta células em 12,5 mililitros de meio glial por placa de 10 centímetros contendo lamínulas. Troque o meio por meio glial fresco, previamente aquecido, a cada dois ou três dias, no dia anterior à dissecação neuronal. Remova o meio glial e substitua por meio sem soro.Utilize posteriormente este meio livre de soro condicionado por gliócitos. Ao inundar culturas corticais ou hipocampais, adiciona-se um C a uma concentração final de cinco micromolares. A fim de prevenir a proliferação de gliócitos, utilize os reagentes de nucleofecção por transfeção conforme indicado nas instruções do fabricante e, em seguida, aqueça a solução até a temperatura ambiente.Coloque uma placa contendo cérebros de camundongo E 15,5 em meio de dissecção frio. Sob microscópio estereoscópico, use uma agulha de tungstênio curvada para remover ambas as neocortes. Em seguida, utilizando pinças finas, remova as meninges e coloque as cortes em uma nova placa com meio de dissecção frio.O hipocampo e o córtex são visíveis ao longo do lado medial do hemisfério cerebral com tesoura de íris pequena. Remova cuidadosamente o hipocampo. Em seguida, remova o córtex restante.Repita a dissecação em cérebros de toda a ninhada. Coloque os córtices do hipocampo em tubos microcentrífugos separados de 1,5 mililitro contendo um mililitro de meio de dissecação frio. Coloque os tubos no gelo após dissecar todos os córtices nos hipocampos.Adicione 110 microlitros de tripsina a 2,5% aos tubos microfuga contendo o tecido e coloque os tubos em um incubador a 37 graus Celsius por 20 minutos. Usando uma pipeta P1000, remova o máximo de fluido possível do tubo. Em seguida, adicione um mililitro de meio de plaqueamento a cada tubo e lave o tecido invertendo suavemente o tubo microfuga.Repita a lavagem duas vezes. Após a última lavagem, adicione um mililitro de meio de plaqueamento. Utilize uma pipeta P1000 para triturar os fragmentos 15 vezes. Em seguida, transfira o sobrenadante e as células para um novo tubo cônico de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio de plaqueamento, deixando quaisquer fragmentos remanescentes no tubo microcêntrifugo.Centrifugue o tubo de 15 mililitros a 350 RPM durante sete minutos com a frenagem desativada após a centrifugação, descarte o sobrenadante e adicione 100 microlitros da solução de afetação nuclear pré-misturada em temperatura ambiente. Pipete para cima e para baixo cinco vezes para misturar. Em seguida, transfira 100 microlitros da solução de afetação nuclear e da mistura celular para cada novo tubo microcêntrifuga contendo uma quantidade apropriada de DNA — um a dois microgramas de DNA por transfeção — para culturas de longo prazo, o que rotulará menos de 10% dos neurônios na cultura.Embora cinco a dez microgramas de DNA por transfeção resultem em uma eficiência de transfeção mais alta para o cultivo, adicione a suspensão celular e a mistura de DNA a um vete de eletroporação. Em seguida, coloque o vete no eletro. Para neurônios do SNC de camundongo, configure o programa do nucleo efetor para oh 0 0 5; trabalhando rapidamente, adicione 500 microlitros do meio de plating pré-aquecido e equilibrado ao qve e transfira a solução celular para um novo tubo microfuge de 1,5 mililitro.Adicione quantidade suficiente de meio de plaqueamento para levar o volume de cada transfeção a um mililitro. Após a contagem das células, plaque de três a cinco vezes 10 à terceira células por centímetro quadrado para culturas jovens, ou de cinco a dez vezes 10 à terceira células por centímetro quadrado para culturas de longo prazo, geralmente cinco vezes 10 à quinta ou uma vez 10 à sexta. As células são usadas por transfeção para preparar culturas de curto prazo.Uma hora após a semeadura, alague as placas de cultura de 35 milímetros com dois mililitros de meio livre de soro, equilibrado com dióxido de carbono e aquecido. As câmaras de imagem resultam em um teor muito baixo de soro, inferior a 0,5%. Culturas de curto prazo não precisam ser cultivadas com uma camada de apoio de gliócitos e não precisam ser resemadas. Para preparar culturas de longo prazo, adicione um mililitro de condição glial ao meio livre de soro.Remova uma lamínula com cobertura de GL contendo três gotas de vaselina parafínica e inverta-a sobre o orifício de 15 milímetros na placa de 35 mm. Em seguida, adicione mais um mililitro de meio para alimentar os cultivos de longo prazo. Substitua um terço do meio sem soro a cada dois ou três dias.Após cinco a sete dias em cultura, citosina arábica IDE ou AEE é adicionada a uma concentração final de cinco micromolar para prevenir a proliferação glial. As imagens pareadas a seguir de neurônios hipocampais vivos representativos mostram tanto uma imagem de contraste de interferência diferencial quanto uma micrografia fluorescente correspondente. Cada uma dessas células foi transfectada com EGFP, tubulina e DS Red dois em vetores PA.Na fase um, os neurônios inicialmente se fixarão e, ao longo de um período de aproximadamente um dia, emitirão lâminas semelhantes a lamelopódios e prolongamentos digitiformes semelhantes a filopódios ao redor da periferia do corpo celular. Na fase dois, as protrusões iniciais se diferenciarão em vários neuritos que se originam do corpo celular, permanecendo geralmente com cerca de 30 a 50 micrômetros de comprimento. Na fase três, estocasticamente, um dos neuritos começa a se alongar rapidamente para tornar-se o axônio.Os outros neuritos permanecem curtos e são denominados processos menores. A maioria dos neurônios do hipocampo e do córtex progride para a fase três entre dois e três dias em cultura. Durante a fase quatro, que ocorre na semana ou nas duas semanas seguintes, os processos menores espessam, alongam e ramificam-se para se tornarem as dendrites, mostradas aqui em verde. Enquanto isso, o axônio afinase à medida que continua a crescer e ramificar entre duas e três semanas. Em cultura, os dendritos se diferenciam formando espinhos dendríticos, pequenas protuberâncias ao longo dos dendritos. Neurônios na fase cinco variarão em forma e tamanho, mas a maioria deverá passar por essa série de estágios de desenvolvimento. Neurônios transfectados podem não progredir por essas fases se a superexpressão de proteínas interromper o desenvolvimento neuronal.Além disso, os neurônios podem não progredir por todas as fases do desenvolvimento. Se as lamínulas não forem limpas adequadamente ou se a politlisina não aderir corretamente, as glias também podem proliferar extensivamente, especialmente se um C não for utilizado. Esta é uma imagem de contraste de fase de um cultivo com duas semanas de idade no qual as glias tomaram conta do cultivo em culturas de longo prazo.Alterar o meio com muita frequência ou com pouca frequência também pode comprometer a viabilidade dos neurônios. Esta é uma imagem de contraste de fase de uma cultura na qual a maioria dos neurônios morreu e os neurônios remanescentes apresentam corpos celulares encolhidos e prolongamentos com aspecto em conta. Para comparação, esta é uma imagem de contraste de fase de neurônios hipocampais saudáveis após duas semanas em cultura. Observe os corpos celulares maiores e a ausência de espessamentos em forma de conta nos prolongamentos.Além disso, nesta fase, os processos dendríticos já se tornaram mais espessos e há uma extensa rede de processos axonais. Uma vez dominados, o isolamento de embriões, o dissecção cortical, a transfeção e o plaqueamento de toda uma ninhada de fetos podem ser realizados em duas horas, se executados corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os neurônios hipocampais e corticais são muito sensíveis à perturbação mecânica.Além disso, é importante manter as soluções o mais frias possível durante o isolamento de neurônios para manter a atividade metabólica baixa. Após este procedimento, outros métodos, como imagem de células vivas e gravação fisiológica da atividade, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma como proteínas de fusão fluorescentes de interesse se segregam para diferentes regiões do neurônio. Se a localização proteica está associada a alterações na atividade sináptica, ou como as funções dessas proteínas são afetadas por diferentes tratamentos farmacológicos.

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Research

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Neuroscience

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