Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Os neurônios hipocampais e corticais têm sido usados extensivamente para estudar a polarização neuronal do sistema nervoso central, o crescimento dos dendritos axônicos e a formação e função das sinapses, e a vantagem de cultivar esses neurônios é que eles polarizam prontamente formando axônios e dendritos distintos em um substrato bidimensional em densidades muito baixas. Este vídeo demonstra uma técnica para dissecar neurônios de cultura e transfecção, embrionários, hipocampo de camundongo e corticais por meio de afecção de núcleo, o que permite a expressão de proteínas de fusão marcadas com fluorescência no início do desenvolvimento, aproximadamente quatro a oito horas após a expressão de plaqueamento das proteínas marcadas com fluorescência é mantida durante toda a vida útil do neurônio por mais de dois meses em cultura. Isso permite o estudo da função da proteína durante eventos iniciais de desenvolvimento, como o crescimento do axônio e eventos posteriores, como sinaptogênese e plasticidade sináptica.

As primeiras células gliais são isoladas dos hemisférios corticais do pós-natal. Do primeiro a três dias de mouse estala e é colocado em frascos. Depois de atingir 70 a 100% de fluência, as células gliais são então revestidas em lamínulas de vidro.

Em seguida, os neurônios hipocampais ou corticais são isolados de camundongos E 15.5 e transfectados via afecção de núcleo com plasmídeos que codificam proteínas de fusão fluorescentes, como a proteína fluorescente vermelha. Os neurônios transfectados são então plaqueados em câmaras de imagem para estudos de curto prazo. Para culturas de longo prazo, as células gliais em lamínulas de vidro são invertidas sobre culturas hipocampais ou corticais Para fornecer suporte trófico, neurônios individuais podem ser visualizados para mostrar a localização dinâmica de proteínas de fusão em axônios ou dendritos de neurônios.

Olá, sou Eric Dent, professor assistente de anatomia na Universidade de Wisconsin Madison. Hoje, três de meus alunos de graduação, Chris Wezelman, Jason Bwe e Derek Lombard, vão demonstrar um procedimento para isolar o revestimento e manter culturas de neurônios corticais e hipocampais para cultura de curto e longo prazo. Essas culturas podem ser usadas para estudar a dinâmica das proteínas de fusão fluorescentes ao longo do desenvolvimento neuronal, desde o crescimento inicial dos neuritos até o desenvolvimento de axônios e dendritos e a sinaptogênese.

Para preparar as câmaras para a imagem, neurônios embrionários, hipocampal de camundongo e corticais. Comece com placas de Petri de 35 milímetros com furos de 15 milímetros perfurados no fundo e todas as brocas removidas. Derrete uma mistura de vaselina de parafina de três para um em um tubo cônico, colocando-a em banho-maria fervente.

Em seguida, use um pincel pequeno para cobrir a parte inferior do prato ao redor do buraco. Certifique-se de mexer a mistura de vaselina de parafina entre as câmaras, pois ela se separará. Coloque a lamínula sobre o orifício.

Depois que todos os pratos estiverem preparados, coloque-os em um forno a 80 graus Celsius até que a mistura de parafina derreta. Isso deve levar cerca de 10 minutos. Em seguida, retire a louça sobre uma superfície plana e deixe a mistura de parafina endurecer por pelo menos um minuto.

Vire a louça e coloque-a sob um capô. Ligue a luz ultravioleta por 30 minutos para esterilizar o interior das tampas e o fundo das câmaras. Próxima camada.

A tampa da câmara desliza com licina poli D por uma hora. Em seguida, enxágue bem as lamínulas revestidas três a cinco vezes com água deionizada com filtro estéril para remover todos os vestígios de tampão de furo Após o enxágue final, use um aspirador para secar as câmaras. Estes podem ser usados imediatamente ou armazenados em uma sala de cultura de tecidos para mais tarde. Usar.

As câmaras revestidas devem ser usadas dentro de uma semana após a preparação, se culturas de longo prazo forem preparadas. As camadas alimentadoras glicais corticais precisarão ser iniciadas duas a três semanas antes de continuar com as dissecções corticais ou hipocampais. Coloque os cérebros de quatro P um a P três estalos de camundongo em um prato contendo meio de dissecação a frio e coloque-o sob o escopo de dissecação.

Remova os bulbos olfatórios, os dois hemisférios cerebrais e as meninges. Transfira os hemisférios para um novo prato sem mídia. Usando uma lâmina de barbear limpa e estéril, pique os córtices o mais fino possível.

Em seguida, com uma pipeta de plástico, transfira o tecido picado para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 12 mililitros de dissecção a frio. Média. Adicione tripsina e DNAs às concentrações finais de 0,25% e 0,1%, respectivamente. Incube em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos com redemoinho intermitente.

Após a incubação, remova o tubo do banho-maria e limpe-o completamente com etanol 70% antes de trazê-lo para o tecido. Capuz de cultura. Pipete o tecido cortical para cima e para baixo.

Com uma pipeta de 10 mililitros aproximadamente 10 a 15 vezes ou até que a maioria dos pedaços desapareça, retorne o tubo ao banho-maria por mais 10 minutos com agitação intermitente. Novamente, limpe completamente o tubo com etanol 70% e traga-o de volta ao tecido. Capuz de cultura.

Pipete o tecido cortical para cima e para baixo. Como antes desta vez com uma pipeta de cinco mililitros, adicione 15 mililitros de glial quente, médio e centrifugue a 1000 RPM por 10 minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 20 mililitros de meio glial fresco.

Use um hemocitômetro para contar as células. Em seguida, coloque de cinco a 7,5 milhões de células em 15 mililitros de meio glial por frasco quadrado de 75 centímetros. Coloque as células na incubadora de 37 graus Celsius após um dia e a cada dois ou três dias subsequentes em cultura, desaloje todas as células soltas batendo o frasco contra a superfície do capuz.

Remova o meio junto com quaisquer células desalojadas e substitua-o por 15 mililitros de glial fresco. A glia média pode ser colhida após uma a duas semanas de crescimento nos frascos quando eles estão prestes a 100% confluentes. Para preparar lamínulas individuais revestidas com glia, comece colocando seis ácido nítrico limpo e esterilizado.

Lamínulas redondas de 25 milímetros em um prato de 10 centímetros e, usando um pincel pequeno, coloque três pontos da mistura de três para um de vaselina de parafina. Em cada lamínula em um padrão triangular. Coloque dois pontos nas bordas da lamínula para ancorar no prato.

Trate os pratos abertos com luz ultravioleta por 30 minutos. Cubra as lamínulas com poli D lisina por uma hora. Em seguida, lave extensivamente três a cinco vezes com água deionizada com filtro estéril e deixe secar e remova as células gliais da incubadora.

Descarte o meio e lave com cinco mililitros de tripsina pré-quente. Adicione três mililitros de tripsina ao frasco e incube por um minuto a 37 graus Celsius. Uma vez que as células estejam separadas, adicione cinco mililitros de meio glial para parar o tropeço.

Remover o GL do balão pipetando 10 a 15 vezes para cima e para baixo. Em seguida, transfira o meio para uma centrífuga de tubo cônico de 15 mililitros a 1000 RPM por oito minutos. Após a centrifugação reus, suspenda as células em 10 mililitros de meio glial.

Então, depois de contar as células cinco vezes 10 elevado à quinta célula em 12,5 mililitros de meio glial por prato de 10 centímetros contendo as lamínulas. Troque o meio por meio glial fresco pré-aquecido a cada dois ou três dias no dia anterior à dissecção do neurônio. Remova o meio glial e substitua por meio livre de soro.

Use este meio livre de soro de condição glial mais tarde. Ao inundar, culturas corticais ou hipocampais, um C é adicionado a uma concentração final de cinco micromolares. Para evitar a proliferação glial dos reagentes de afecção do núcleo por transfecção, conforme indicado nas instruções do fabricante, aqueça a solução à temperatura ambiente.

Colocar uma placa contendo cérebros de ratinhos E 15.5 em meio de dissecação a frio. Sob o microscópio de dissecação, use uma agulha de tungstênio dobrada para remover os dois neocórtices. Em seguida, usando uma micropinça, remova as meninges e coloque as córtices em um novo prato de meio de dissecção a frio.

O hipocampo e o córtex são visíveis ao longo do lado medial do hemisfério cerebral com uma pequena tesoura de íris. Remova cuidadosamente o hipocampo. Em seguida, remova o córtex restante.

Repita a dissecção em cérebros de toda a ninhada. Coloque o hipopótamo Camp Cortices em microtubos separados de 1,5 mililitro cheios de um mililitro de dissecção a frio. Média. Coloque os tubos no gelo Depois de dissecar todos os córtices nos campos de hipopótamo.

Adicione 110 microlitros de 2,5% de tripsina aos tubos de micro fuga contendo o tecido e coloque os tubos em uma incubadora de 37 graus Celsius por 20 minutos. Usando uma pipeta P 1000, remova o máximo de fluido possível do tubo. Em seguida, adicione um mililitro de meio de revestimento a cada tubo e lave o tecido invertendo suavemente o tubo de micro fuga.

Repita a lavagem duas vezes Após a lavagem final, adicione um mililitro de meio de revestimento. Use uma pipeta P 1000 para tri Classifique os pedaços 15 vezes. Em seguida, transfira o sobrenadante e as células para um novo tubo cônico de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio de revestimento, deixando os pedaços que permanecerem em um tubo de microfuga.

Girar o tubo de 15 mililitros a 350 RPM por sete minutos com a interrupção após a centrifugação, descartar o sobrenadante e adicionar 100 microlitros de temperatura ambiente pré-misturada. Solução de afeto de núcleo para cada pipeta de transfecção para cima e para baixo cinco vezes para misturar a próxima transferência. 100 microlitros da solução de afecção nuclear e mistura celular para cada novo tubo de microfuga contendo uma quantidade apropriada de DNA de um a dois microgramas de DNA por transfecção para culturas de longo prazo marcarão menos de 10% dos neurônios na cultura.

Embora cinco a 10 microgramas de DNA por transfecção resultem em uma maior eficiência de transfecção para cultura, adicione a suspensão celular e a mistura de DNA a um exame de eletroporação. Em seguida, coloque o vete no eletro. Para neurônios do SNC de camundongos, defina o programa efetor do núcleo para oh 0 0 5 funcionando rapidamente, adicione 500 microlitros do meio de revestimento pré-guerra e equilibrado ao qve e transfira a solução celular para um novo tubo de micro fuge de 1,5 mililitro.

Adicione meio de revestimento suficiente para trazer o volume de cada transfecção para um mililitro. Depois de contar as células, três a cinco vezes 10 elevado ao centímetro quadrado das células terceiras para culturas jovens, ou cinco a 10 vezes 10 elevado às terceiras células, porcentagem do metro quadrado para culturas de longo prazo, geralmente cinco vezes 10 elevado à quinta ou uma vez 10 elevado à sexta. As células são usadas por transfecção para preparar culturas de curto prazo.

Uma hora após a inundação do plaqueamento, as placas de cultura de 35 milímetros com dois mililitros de dióxido de carbono quente equilibrado, inundação de meio livre de soro. As câmaras de imagem resultam em um teor sérico muito baixo, inferior a 0,5% As culturas de curto prazo não precisam ser cultivadas com uma camada alimentadora glial e não precisam ser reed. Para preparar culturas de longo prazo, adicione um mililitro de condição glial ao meio livre de soro.

Remova uma lamínula coberta com GL contendo três pontos de vaselina de parafina e inverta-a sobre o orifício de 15 milímetros no prato 35. Em seguida, adicione mais um mililitro de meio para alimentar as culturas de longo prazo. Substitua um terço do meio livre de soro a cada dois ou três dias.

Após cinco a sete dias em cultura, a citosina Arab IDE ou aee é adicionada a uma concentração final de cinco micromolares para evitar a proliferação glial. As seguintes imagens emparelhadas de neurônios representativos do hipocampo vivo mostram uma imagem de contraste de interferência diferencial e uma micrografia fluorescente correspondente. Cada uma dessas células foi transfectada com EGFP, tubulina e DS red two em vetores PA.

Durante o estágio um, os neurônios se ligam inicialmente e, durante um período de um dia ou mais, projetam-se em forma de folha la melo podia e Filip podia em forma de dedo ao redor da periferia do corpo celular. Durante o estágio dois, as saliências iniciais se diferenciarão em vários neuritos que emanam do corpo celular, geralmente permanecendo com cerca de 30 a 50 mícrons de comprimento. Durante o estágio três, estocasticamente, um dos neuritos começa a se estender rapidamente para se tornar o axônio.

Os outros neuritos permanecem curtos e são chamados de processos menores. A maioria dos neurônios hipocampais e corticais progrediu para o estágio três por dois a três dias em cultura durante o estágio quatro, que ocorre na próxima semana ou em dois processos menores, engrossam, alongam e se ramificam para se tornarem os dendritos aqui, estes são mostrados em verde. Enquanto isso, o axônio diminui à medida que continua a crescer e se ramificar em duas a três semanas.

Na cultura, os dendritos se diferenciam formando espinhos dendríticos, pequenas protuberâncias ao longo dos dendritos. Os neurônios do estágio cinco variam em sua forma e tamanho, mas a maioria deve passar por essa série de estágios de desenvolvimento. Os neurônios transfectados podem não progredir por esses estágios se a superexpressão de proteínas interromper o desenvolvimento neuronal.

Além disso, os neurônios podem não progredir em todos os estágios de desenvolvimento. Se as lamínulas não forem limpas adequadamente ou a polilisina não aderir adequadamente, a glia também pode proliferar extensivamente, especialmente se um C não for usado. Esta é uma imagem de contraste de fase de uma cultura de duas semanas em que a glia cresceu demais na cultura nas culturas de longo prazo.

Mudar a mídia com muita frequência ou com pouca frequência também pode comprometer a viabilidade dos neurônios. Esta é uma imagem de contraste de fase de uma cultura em que a maioria dos neurônios morreu e os neurônios restantes encolheram corpos celulares e processos frisados Para comparação, esta é uma imagem de contraste de fase de neurônios saudáveis do hipocampo em duas semanas em cultura. Observe os corpos celulares maiores e a falta de batimento nos processos.

Além disso, nesta fase, os processos dendríticos engrossaram e há uma extensa filigrana de processos axonais. Uma vez dominado, embrionário, cortical e dissecação, transfecção e plaqueamento de toda a ninhada de fetos pode ser feito em duas horas se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os neurônios hipocampais e corticais são muito sensíveis à interrupção mecânica.

Além disso, é importante manter as soluções o mais frias possível durante o isolamento dos neurônios para manter a atividade metabólica baixa. Após esse procedimento, outros métodos, como imagens de células vivas e registro fisiológico da atividade, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como as proteínas de fusão fluorescentes de interesse se segregam em diferentes regiões do neurônio. Se a localização da proteína está associada a alterações na atividade sináptica, ou como as funções dessas proteínas são afetadas por diferentes tratamentos farmacológicos.