Name: Microdissecção de Black Widow Aranha Silk glândulas produtoras de (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a microdissecção de glândulas produtoras de seda em aranhas viúvas-negras para estudos bioquímicos e moleculares. Este método permite isolar sete glândulas distintas para análise de RNAm e proteínas.

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Este trabalho foi financiado por uma doação RUI NSF MCB-0950372 Caracterização Molecular de direito Silks aranha viúva negra.

1. Anestesiar a aranha e isolamento do abdômen <ol><li> Transferência a aranha a partir de um frasco de vidro em uma caixa de papelão forrada com plástico (Figura 1A). Normalmente, coletamos as aranhas de woodpiles, garagens ou arbustos e abrigá-los no laboratório em frascos de vidro. Porque a aranha não pode subir o revestimento de plástico, ela fornece um método eficiente para transferir a aranha a partir de uma jarra de vidro ou lata de café em um pequeno frasco para fins de anestesia. Ao manusear a aranha, neste ponto, você deve estar usando dois pares de luvas de látex ou luvas de jardinagem para fins de segurança. </li><li> Enquanto a aranha está na caixa forrada com plástico, a abordagem da aranha a partir de sua parte traseira e deixar o slide aranha dentro do frasco de cultura de plástico. Após a aranha entra no frasco, coloque imediatamente a ficha sobre a parte superior (Figura 1B). Recomendamos o uso de um frasco que é de aproximadamente 101,6 milímetros x 31,75 milímetros (L x D). Isso minimiza a quantidade de gás dióxido de carbono necessário para a etapa de anestesiar. </li><li> Anestesiar a aranha com a introdução do gás dióxido de carbono em 5-10 libras por polegada quadrada de 10 min (Figura 1C). Esta quantidade de gás só vai bater o spider para fora por cerca de 5 min, então depois de anestesiados você deve imediatamente proceder a passos 1,4-1,5. </li><li> Coloque o spider anestesiados em um prato dissecção pequenas e utilize uma pinça para posicionar a aranha acima do lado dorsal (ampulheta vermelha virada para baixo). </li><li> O clipe (caule estreito que liga o cefalotórax e abdômen) pedicelo para liberar o abdômen do resto da aranha (Figura 1D). Armazenar o cefalotórax no freezer durante a noite em uma placa de Petri e descartar após congelados no dia seguinte. Tenha cuidado ao mover o cefalotórax como as presas da aranha estão presentes neste segmento. </li><li> Aperte o abdômen ao material Sylgard no prato dissecção pequena com um pino único inseto. Insira o pino de insetos através do buraco feito a partir do clipping pedicelo (Figura 1E). Isto pode ser facilmente identificado como o local onde o fluido está surgindo a partir do recorte da pedicelo. Verifique se o fieira (extremo oposto do pedicelo) é orientada em direção ao fundo (mais próximo de você). </li></ol> 2. Remoção do exoesqueleto <ol><li> Fazer a primeira incisão através do exoesqueleto usando um par de microtesoura, começando no buraco do clipping pedicelo. Cortar lateralmente até que o lado dorsal é alcançado em ambos os lados (Figura 1F). Usando um par de fórceps, descascar segmento exoesqueleto anterior e inserir um segundo pino neste local. Após a inserção do segundo pino, vire a bandeja de dissecação caudalmente (ângulo de 90 °) de os cortes iniciais lateral e continue até que a corte fiandeiras são atingidos (Figura 1G). Esta incisão será perpendicular ou vertical para o corte inicial lateral. Não cortar o fieiras quando a incisão vertical é feita (em relação posterior à ampulheta e ele tem uma aparência circular). Deixar de inserir o segundo pino resultará no abdômen girando quando as incisões verticais são realizadas. </li><li> Submergir o abdômen em dissecar solução tampão (0,1 M de cloreto de sódio, citrato de sódio 0,015 M, 0,1% dietílico Pyrocarbonate). </li><li> Descasque as restantes exoesqueleto de volta a partir da incisão inicial, lateral. Quando isso estiver concluído, o tecido adiposo deve ser claramente visível (Figura 1H). </li></ol> 3. Isolamento das glândulas produtoras de seda <ol><li> Forceps usando começam teasing afastado a camada de gordura (Figura 1H). A gordura vai ter um esbranquiçada à aparência amarelada. Continue até que a maioria da gordura é removida e as glândulas de seda são claramente visíveis. A glândula tubuliform consiste em três pares de muito tempo, os tubos cilíndricos que são abundantes na cavidade abdominal. O ampullate principais, que é encontrado em pares, é uma ampola grande crescente, em forma com uma cauda longa complicado distal e proximal de um duto que diminui de largura medida que se aproxima fiandeiras da aranha. O ampullate menores é muito semelhante na morfologia do ampullate grande, mas é significativamente menores. A glândula flagelliform, ocorrendo também em pares, é redondo e multilobular com uma pequena cilíndrica zig-zag duto que se estende em direção ao fiandeiras. A glândula agregado (encontrado em pares) é uma grande glândula, multilobular que tem um duto excretor muito grande que tem grandes lobos irregular nele. As glândulas aciniform ocorrem em grande número e se assemelham a curto, projeções semelhantes a dedos pequenos. A glândula piriforme é a menor da glândula no abdômen e tem muitas compactado, dutos cilíndricos que se assemelham a um ventilador com muitos pequenos ductos excretores que se estendem até o fiandeiras. </li><li> Recomendamos a remoção das glândulas, na seguinte ordem: tubuliform, ampullate principais, flagelliform, ampullate menor, agregado, aciniform, e então o piriforme (Figura 2A-B). </li><li> Começando com o tubuliform, provocar estas glândulas fora do resto do diae glândulas - que deveria estar sentado em cima da outras glândulas (Figura 2A). Há três pares de glândulas tubuliform em uma única aranha. Lhes permitem free float, mas permanecem ligados à sua fiandeiras por seus dutos. </li><li> Em seguida, provocar longe das glândulas ampullate principais. Existem duas glândulas ampullate principais presentes em uma aranha. Durante o procedimento de remoção, certifique-se os dutos permanecer solidários com as glândulas (Figura 2A). </li><li> Continuar a provocar o resto das glândulas longe um do outro, trabalhando com cuidado para evitar qualquer punção das glândulas, especialmente agregado e glândulas flagelliform. Cada glândula deve ser livre flutuação todo o caminho até o seu ponto de saída no exoesqueleto ao fiandeiras. Estas glândulas são encontrados também em pares. Retire cada glândula apertando o duto com uma pinça e cuidadosamente puxando até que rompe com o ponto de saída. O ampullate principais, flagelliform, ampullate menor, e as glândulas agregados são encontrados em pares. As glândulas aciniform piriforme e ocorrem em muitos mais pares. </li><li> Retire cada glândula apertando o duto com uma pinça e cuidadosamente puxando até que rompe com o ponto de saída para baixo pela fieira. Nós normalmente armazenam as glândulas molhada, no entanto, nós não adicionamos buffer adicional. </li><li> Como as glândulas são removidas, coloque-os em estéreis pré-rotulados tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Glândulas individuais são mostrados na Figura 3A-G. Manter essas glândulas no gelo e depois congelá-los de flash em nitrogênio líquido. Após o congelamento de flash em nitrogênio líquido, colocá-los a -80 ° C para armazenamento. </li></ol> 4. Resultados representante Ao remover as glândulas diferentes, extremo cuidado deve ser tomado durante o manuseio do flagelliform e glândulas agregado, uma vez que estas duas estruturas podem ser facilmente perfurado e danificados com a pinça. Além disso, é importante notar que morfologicamente as glândulas flagelliform e agregar muito parecidas antes da sua remoção e são frequentemente interligados uns com os outros. Para evitar a contaminação cruzada destes tecidos após a remoção, o dissector deve provocar cuidadosamente estas estruturas separadas. Além disso, após a exposição inicial das glândulas produtoras de seda, as glândulas aciniform piriforme e será o mais difícil de visualizar imediatamente devido ao seu menor tamanho e localização anatômica. Muitas vezes há a presença de muitos ovos. Além disso, cuidado adicional deve ser tomado durante a remoção da glândula piriforme, como este tecido é extremamente pegajoso e, muitas vezes, aderir ao seu fórceps. Quando este procedimento for feito corretamente, é possível obter todas as sete glândulas produtoras de seda a partir de uma única aranha em uma forma altamente purificada. Tipicamente, pode-se recuperar quantidades micrograma de RNA total e proteínas a partir de uma dissecção única aranha. Um exemplo do uso de RNA total de qPCR para examinar os níveis de mRNA de um gene tubuliform fibroína restrito, TuSp1, é mostrada (Figura 4). Experimentos que envolvem proteínas representante lisados ​​coletados das glândulas por exemplo, em solução de digestão tríptica seguido por MS análise (também poderia ser usado para MS / MS análise) ou uma análise da composição de aminoácidos é mostrada (Figura 5-6, respectivamente). <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Figura 1e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1e"> Figura 1. Handling, anestesiando, e remoção do exoesqueleto do abdômen de uma aranha viúva negra do sexo feminino. A) Transferência da aranha em caixa de papelão forrada com plástico para facilitar a movimentação da aranha em um frasco pequeno de plástico. B) Spider colocado em um frasco de plástico com tampa. C) A anestesia do aranha com gás dióxido de carbono. D) Separação do cefalotórax do abdômen com microtesoura. E) Imobilização do abdômen na bandeja de dissecação utilizando os pinos de insetos. F) Ver depois de uma incisão lateral é feita com a tesoura e uma parte do exoesqueleto é pealed de volta com uma pinça. G) As incisões feitas perpendicular ao corte inicial lateral. H) Remoção do exoesqueleto e exposição da camada de gordura. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Visualização das sete diferentes glândulas produtoras de seda, enquanto intactas no abdômen da aranha, bem como os tecidos circundantes. A) As imagens do tubuliform, ampullate principais, flagelliform, agregar, tecidos ampullate menores com ampliação de 12X. B) Imagem das glândulas aciniform e piriforme com ampliação de 12X. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Figura 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Figura 3e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3e"> Figura 3. Fotografias das sete glândulas produtoras de seda após a sua retirada do abdômen. Todas as imagens foram capturadas em 20X de ampliação com a exceção do aciniform e glândulas piriforme, que foram feitas em 40X. A major)ampullate glândula; B) ampullate maiores e menores (lado direito) para comparação de tamanho; C) tubuliform; D) flagelliform; E) agregado; F) aciniform; G) piriforme. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Os resultados representativos do padrão de expressão do gene de seda, TuSp1, após levantamento da TuSp1 níveis de mRNA em diferentes glândulas produtoras de seda (excepto a glândula piriforme), utilizando quantitativa PCR em tempo real de isolamento (qPCR), seguindo de RNA total de as glândulas. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Exemplo de MS a análise de extratos proteicos obtidos a partir da glândula piriforme seguir em solução de digestão tríptica. Nota: x2 representa duas vezes a ampliação da intensidade do espectro. Massas espectro de íons peptídeo que correspondem às regiões da fibroína PySp1 são mostrados com o símbolo #. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Resultado típico do perfil de composição de aminoácidos das proteínas extraídas da glândula tubuliform. Nota: ASX = Asp e Asn; GLX = Glu e Gln. Coloração azul reflete aminoácidos com grupos de cadeia lateral polar enquanto coloração vermelha representa resíduos de aminoácidos com grupos apolares cadeia lateral.

<ol><li>Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li>
<li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li>
<li>Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li>
<li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li>
<li>Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li>
<li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li>
<li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li>
<li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li>
<li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nossa metodologia para a microdissecção das glândulas produtoras de seda da aranha viúva-negra oferece um meio eficaz para obter altamente purificada de seda glândulas produtoras. Dissecções podem ser concluídas em 1,5 a 3 horas, resultando em um conjunto completo de sete distintas seda glândulas produtoras de cobweavers. Obtenção altamente purificada de seda glândula-amostras permite os investigadores a capacidade de executar uma ampla gama de estudos bioquímicos, incluindo a identificação de seda novo ou proteínas cha...

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>0,1 M em água</td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>0,1% v/v</td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>0,015 M em água</td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Câmera digital para microscópio</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>Tesoura de Vannas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de aço inoxidável</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont nº M5S</td></tr><tr><td>Agulhas para insetos</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>Agulhas para insetos nº 2</td></tr><tr><td>Placas de dissecação pequenas ou grandes</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S ou DD-90-S</td><td>52 mm de diâmetro x 18 mm de altura (profundidade do Sylgard ~6 mm) ou 93 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; tubos de cultura</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>O tamanho é 31,75 mm de diâmetro x 101,6 mm</td></tr></tbody></table>

microdissecção de black widow aranha silk glândulas produtoras de

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Aranhas modernas produzir fibras de alta performance de seda com uma ampla gama de funções biológicas, incluindo locomoção captura de presas e de proteção de desenvolver 1,2 filhos. Aranhas realizar essas tarefas, girando várias tipos de fibras distintas, que têm diferentes propriedades mecânicas. Tal especialização de tipos de fibras ocorreu através da evolução de diferentes glândulas produtoras de seda, que funcionam como biofábricas de pequeno porte. Estes fabricação biofábricas e armazenar grandes quantidades de proteínas da seda para a produção de fibra. Através de uma série complexa de eventos bioquímicos, essas proteínas da seda são convertidos de um líquido em um material sólido em cima de extrusão. Estudos têm demonstrado que a mecânica sedas de aranha são mais fortes que aço de alta resistência 3. Análises para entender a relação entre a estrutura ea função dos fios de seda de aranha têm revelado que a seda da aranha é constituída principalmente de proteínas, ou fibroins, que repete bloco dentro suas seqüências de proteínas 4. Comum assinaturas moleculares que contribuem para a resistência à tração incrível e extensibilidade de sedas de aranha estão sendo desvendados através da análise de cDNAs de seda traduzido. Dadas as propriedades do material extraordinário de aranha sedas, laboratórios de pesquisa em todo o mundo estão correndo para compreender e imitar o processo de fiação para produzir fibras de seda sintética para aplicações comerciais, militares e industriais. Um dos principais desafios a fiação de seda de aranha artificial em laboratório de pesquisa envolve um completo entendimento dos processos bioquímicos que ocorrem durante a extrusão das fibras das glândulas produtoras de seda. Aqui apresentamos um método para o isolamento de sete de produção de seda diferentes glândulas da aranha viúva-negra cobweaving, que inclui as glândulas ampullate maiores e menores [fabrica dragline e andaimes de seda] 5,6, tubuliform [sintetiza seda caso do ovo] 7 , 8, flagelliform [função desconhecida em cob-tecelões], agregada [faz seda cola], aciniform [embrulho presa sintetiza e tópicos caso do ovo] 9 e piriforme [produz apego seda disco] 10. Esta abordagem baseia-se anestesiar a aranha com gás de dióxido de carbono, a separação posterior do cefalotórax do abdômen, e microdissecção do abdômen para obter as glândulas produtoras de seda. Após a separação dos diferentes glândulas produtoras de seda, estes tecidos podem ser usados ​​para recuperar macromoléculas diferentes para distintas análises bioquímicas, incluindo quantitativos PCR em tempo real, no norte e oeste blotting, espectrometria de massa (MS ou MS / MS) analisa a identificar seqüências de seda novas proteínas, pesquisa de proteínas que participam na via montagem de seda, ou usar o tecido para cultura de células intactas ou experiências histológica.

Aqui nós descrevemos uma estratégia eficiente para remover as glândulas produtoras de seda do abdômen da fêmea aranha viúva negra. Este procedimento permite o isolamento rápido da produção de seda sete diferentes glândulas de uma forma altamente purificada, um processo importante para os investigadores a estudar a produção de seda de aranha e montagem de fibra.

Microdissecção de Black Widow Aranha Silk glândulas produtoras de

As aranhas modernas tecem fibras de seda de alto desempenho com uma ampla gama de funções biológicas, incluindo locomoção, captura de presas e proteção de ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar as sete glândulas produtoras de seda distintas do abdômen da aranha e utilizar esses tecidos para estudos moleculares e bioquímicos. Isso é realizado primeiramente anestesiando a aranha. O segundo passo do procedimento é separar a cabeça, o tórax e o abdômen e fixar o abdômen com alfinetes entomológicos em um pequeno recipiente para dissecação.O terceiro passo do procedimento é fazer incisões no exoesqueleto para expor as glândulas produtoras de seda. O passo final do procedimento é a remoção das diferentes glândulas produtoras de seda. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram que as distintas glândulas produtoras de seda expressam diferentes RNAm ou proteínas de seda por meio de abordagens moleculares e bioquímicas, tais como PCR quantitativa em tempo real ou espectrometria de massa, respectivamente.Este método fornecerá uma compreensão importante da pesquisa em biologia de aranhas, revelando proteínas armazenadas nas glândulas produtoras de seda. Essas proteínas têm aplicações que afetam a área militar e médica, além de diversas aplicações comerciais e industriais. Tivemos inicialmente a ideia de realizar este estudo específico quando precisamos saber mais sobre as proteínas armazenadas nas glândulas produtoras de seda.A principal vantagem dessa técnica é que as aranhas viúvas-negras fêmeas possuem abdômen muito grande, o que facilita bastante o isolamento das glândulas produtoras de seda. Indivíduos novos nesse método podem ter dificuldades, pois muitas vezes as glândulas se rompem durante a dissecação. Além disso, existem certas estruturas anatômicas difíceis de isolar.A demonstração visual é essencial para uma boa dissecação. A demonstração do procedimento será realizada por Kobe LaMattina, Tiffany Tootin, Blasingame e Y Shaw antes do início da dissecação. Prepare 500 mililitros de solução tampão para dissecação composta por cloreto de sódio 0,1 molar, citrato de sódio 0,015 molar e bicarbonato de etila 0,1%.Em seguida, prepare uma caixa de papelão com revestimento de plástico para conter a aranha e impedir que ela saia rastejando. Normalmente, obtemos aranhas-viúvas-negras de pilhas de madeira, abrigos ou garagens, e usamos frascos de vidro para mantê-las em laboratório. Após a coleta, transfira a aranha de um frasco de vidro para a caixa, manuseando-a com cuidado.Use dois pares de luvas de látex ou de jardinagem para segurança. Em seguida, com um pequeno frasco plástico de cultura, aproxime-se da aranha por trás e deslize a aranha para dentro do frasco, tampando-o imediatamente. Introduza gás carbônico no frasco a uma pressão de cinco a 10 PSI durante 10 minutos para anestesiar a aranha; a dissecação inicial do abdômen a partir do tórax cefálico deve ser realizada dentro de cinco minutos, enquanto a aranha ainda estiver sob anestesia.Coloque a aranha anestesiada em um pequeno recipiente para dissecação. Corte o pedúnculo, o estreito talo, que conecta o cefalotórax ao abdômen, para liberar o abdômen. O cefalotórax contém as presas da aranha e exige descarte adequado.Remova cuidadosamente o tórax cefálico colocado em uma placa de Petri e congele durante a noite. Antes de descartar, localize o orifício no abdômen da aranha feito pelo corte da célula do pedestal, identificando o local de onde o fluido emerge do abdômen. Usando um único pino de dissecação, insira o pino através do orifício e no interior do abdômen para fixar o abdômen à bandeja de dissecação, orientando a aranha de modo que o pedestal fique mais afastado do dissector e o giro esteja mais próximo do dissector.Usando um par de tesoura microcirúrgica, comece no orifício da célula pedes e corte lateralmente em cada lado através do exoesqueleto até atingir o lado dorsal. Usando pinças, retire o segmento anterior do exoesqueleto e insira um segundo alfinete nesse local. Em seguida, gire a bandeja de dissecação em um ângulo de 90 graus a partir dos cortes laterais iniciais.Continue cortando até alcançar os spints. O corte será perpendicular ou vertical ao corte lateral inicial. Os spints estão localizados abaixo da ampulheta e têm aparência circular.Não corte através dos espinhos quando a incisão vertical for feita. Mergulhe o abdômen na solução tampão de dissecação. Retire o exoesqueleto remanescente puxando-o para trás, começando pela incisão lateral inicial.Quando isso for concluído, o tecido gorduroso, de aparência esbranquiçada a amarelada, deverá estar claramente visível com o uso de pinça. Comece a separar cuidadosamente a camada de gordura até que a maior parte da gordura seja removida e as glândulas de seda fiquem claramente visíveis. Se houver ovos presentes, eles devem ser removidos.Neste ponto, dissecar as glândulas na seguinte ordem: forma tubular, forma com flagelos principais, agregado de forma secundária com assif, forma e, em seguida, a forma piriforme. Descreveremos cada glândula na ordem da dissecação.As glândulas em forma tubular estão localizadas acima de todas as outras glândulas e possuem três pares de tubos cilíndricos muito longos, abundantes na cavidade abdominal. Remova cuidadosamente essas glândulas do restante das glândulas. Deixe-as flutuar livremente, mas ainda presas aos giradores vermelhos por seus ductos.Em seguida, separe cuidadosamente as duas glândulas ampuláceas maiores, também encontradas nas pêras. Essas glândulas são grandes e com formato crescente, possuindo longas caudas distais tortuosas e ductos proximais que diminuem em largura. Ao se aproximar dos espinhos da aranha, remova as glândulas ampuláceas maiores e coloque-as em tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Coloque as glândulas sobre gelo após sua remoção. Em seguida, remova a glândula flagelar da glândula. A glândula flagelar também está presente como uma pêra.É uma estrutura multilobulada com um pequeno ducto cilíndrico em zigue-zague que se estende para baixo em direção aos espinhos após sua remoção, colocando-os sobre gelo. A seguir, observa-se que o alétolo menor é muito semelhante em morfologia ao alétolo maior, mas significativamente menor. A glândula agregada, encontrada aos pares, é grande e multilobulada, e possui um ducto excretor muito grande com lobos irregulares e volumosos.As glândulas sino forma ocorrem em grande número e assemelham-se a projeções curtas e pequenas, semelhantes a dedos. A glândula piriforme é a menor glândula do abdômen e possui muitos ductos cilíndricos compactados que se assemelham a um leque, com muitos ductos excretores pequenos que se estendem até os espinhos. Agora que a glândula tubular forma é a única glândula restante solta, remova-a pinçando o ducto com uma pinça e puxando cuidadosamente até que se desprenda do ponto de saída próximo ao espinho. Após a dissecação, congele rapidamente todas as glândulas dissecadas colocando o tubo em nitrogênio líquido até congelar completamente e armazene a menos 80 graus Celsius para conservação.Alternativamente, as glândulas podem ser congeladas imediatamente após sua remoção independente durante o procedimento de dissecação. Esta figura mostra o isolamento do gene da seda, níveis de mRNA de TUSP um, nas diferentes glândulas produtoras de seda, excluindo a glândula piriforme, mediante análise de PCR quantitativa em tempo real após o isolamento de RNA total das glândulas. As glândulas na forma tubular contêm a maior abundância de mRNA de TUSP um.Esta figura mostra um resultado típico do perfil de composição de aminoácidos das proteínas extraídas da glândula piriforme. A coloração azul reflete aminoácidos com grupos laterais polares, enquanto a coloração vermelha representa resíduos de aminoácidos com grupos laterais não polares. Esta figura exibe a análise por espectrometria de massas de extratos proteicos obtidos a partir da glândula piriforme após tripticinação em solução.A digestão aqui vezes dois representa uma ampliação duas vezes maior da intensidade do espectro. As massas dos íons peptídicos do espectro marcadas com o símbolo # indicam peptídeos derivados da fibroína da seda PYSP1 após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na comunidade de biologia de tecido.Foi utilizada para explorar processos químicos e moleculares envolvidos na produção de fibras de embebição, montagem de fibra de seda e extrusão. Se esta técnica for realizada corretamente, pode ser concluída em uma hora e meia a três horas. Ao tentar este procedimento, é importante usar dois pares de luvas até que as presas da aranha sejam removidas.No final deste método, as glândulas produtoras de seda podem ser utilizadas para extrair RNA e proteína. Esses materiais podem ser empregados em aplicações posteriores, como PCR quantitativa em tempo real, bem como espectrometria de massas. As informações obtidas a partir desses estudos nos ajudarão a compreender melhor a montagem da seda e a via de extrusão da seda.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar as sete glândulas produtoras de seda distintas da aranha viúva-negra fêmea.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Microfluidic seco-fiação e caracterização de fibras regeneradas da fibroína de seda

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação do rato inteiro, intacto, glândulas mamárias para investigar a expressão da matriz extracelular (ECM) e morfologia ductal. Mouse #4 glândulas abdominais foram extraídas dos ratos de 8-10 semanas nulíparas fêmeas, fixados em formalina tamponada neutra, seccionado e manchado usando imuno-histoquímica para proteínas de ECM.

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

Embora muitos insetos da subordem Heteroptera (Insecta: Hemiptera) são venenosa, sua composição de veneno e as funções das suas toxinas de veneno em sua maioria são desconhecidas. Este protocolo descreve métodos para colher heteropteran venenos para mais de caracterização, utilizando a eletroestimulação, assédio e dissecação da glândula.

Colheita de toxinas de veneno de barbeiros e outros insetos Heteropteran

Hipofaringe glândula acinus tamanho é uma medida robusta de nutrição de abelhas de mel de enfermeira. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para dissecar, coloração, imagem e medição ácinos de glândula enfermeira abelha hipofaringe.

Medição de hipofaringe glândula Acinus tamanho em trabalhadores de abelhas (Apis mellifera)

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir soluções de proteína de seda de aranha recombinante solúvel em água e as formas materiais que podem ser formadas a partir dessas soluções.

Formação de Material de Seda de Aranha Recombinante por Solvatação Aquosa Usando Calor e Pressão

A glândula salivar de mosquito adulto (SG) é necessária para a transmissão de todos os patógenos transmitidos por mosquitos para seus hospedeiros humanos, incluindo vírus e parasitas. Este vídeo demonstra o isolamento eficiente das OGs do estágio larval (L4) dos mosquitos Anopheles gambiae e a preparação dos SGs L4 para análise posterior.

Dissecção e Imunostaining de Glândulas Salivares Larvais de Anopheles gambiae Mosquitos

Aprenda a microdissecção de glândulas produtoras de seda em aranhas viúvas-negras para estudos bioquímicos e moleculares. Este método permite isolar sete glândulas distintas para análise de RNAm e proteínas.

Microdissecção de Black Widow Aranha Silk glândulas produtoras de

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