In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

Olá, sou William Tis do Laboratório Krete. Hoje, eu e outros vamos mostrar a vocês injeções intrauterinas em embriões de camundongo E 15. Olá, meu nome é Laura Elias.

Hoje vou mostrar como preparar as pipetas de microinjeção e carregá-las para as injeções intraventriculares e eletroporação que realizaremos. Meu nome é David Castaneda e hoje estarei auxiliando nas injeções in vivo in utero de embriões de camundongos. Injetaremos DNA plasmidial nos ventrículos laterais de embriões de camundongos em desenvolvimento.

Nós visamos o córtex CE desses embriões para obter a expressão de diferentes moléculas por células gliais, que posteriormente se tornarão neurônios durante o desenvolvimento. Ao realizar essas injeções intrauterinas, há algumas ferramentas importantes que você precisará usar, e eu as mostrarei agora. Utilizamos um freer e um par de pinças de adin.

Um, um par serrilhado e outro par com um pequeno dente na extremidade. Utilizamos um par de hemostatos. Este é um par de tesouras.

Em seguida, utilizamos esses dois grampeadores. Este é o maior, que usamos para ratos. Este é o menor, que usamos para camundongos.

Utiliza grampos de tamanho sete, e este utiliza grampos de tamanho nove, sendo ambos com mola. Algumas das ferramentas que usamos aqui para auxiliar nas cirurgias incluem uma fonte de luz fibra óptica simples com cabeça dupla. Utilizamos também um tapete aquecido que circula água morna por dentro para manter o calor.

A superfície de trabalho, utilizamos este sistema de eletroporação fabricado pela BTX. Temos alguns tamanhos diferentes de eletrodos que usamos com base no tamanho dos embriões. O lado azul é o lado positivo.

Ok, então, para os camundongos utilizamos um vaporizador de isoflurano. Descobrimos que isso aumenta nossa taxa de sobrevivência da mãe e dos embriões. Também permite que coloquemos o animal dentro e fora da consciência de forma muito rápida e extremamente controlada.

Por essa razão, consideramos isso muito útil. Muito bem, agora vamos afiar nossas pipetas de injeção. Isso é muito importante para que a pipeta tenha uma abertura suficientemente ampla para que você possa carregar seu DNA, mas também para que ela seja bem, bem afiada, de modo a não danificar o embrião durante a injeção.

E se você danificar o embrião durante a injeção, terá uma taxa muito mais alta de mortalidade. E isso não é bom. Portanto, este é na verdade um processo muito importante nessa cirurgia.

E primeiro vamos colocar um pouco de água nesta pedra de afiar que está girando aqui. Em seguida, vamos pegar, vejamos aqui, apenas um pedaço de bastão. E vamos fixar nossa pipeta, que acabamos de puxar, neste bastão com um pouco de fita adesiva.

E vamos usar um desses micromanipuladores para segurar a pipeta na face biselada e permitir que ela seja biselada aqui. Então, basta colocar isso e usamos o microscópio para visualizar a ponta da pipeta. E vamos apenas colocá-la diretamente na água, sobre o bisel, de modo que haja uma pequena pressão.

E você pode ver a ponta pressionando contra, a pedra aqui. E deixe-a afiar por algum tempo, por pelo menos, você sabe, 15 minutos. Gosto de deixá-las, você sabe, até por uma hora.

Às vezes, eles ficam realmente, muito afiados, mas definitivamente depende da pessoa o tempo que demoram para biselar suas pipetas. Muito bem, então aqui temos, você pode ver na parte superior uma pipeta que foi puxada, mas ainda não foi biselada. Embora esteja afiada, não possui nenhuma abertura pela qual você possa carregar seu DNA.

Agora a pipeta inferior foi biselada e você pode ver essa abertura angulada bem definida. Isso permitirá que você carregue seu DNA, mas ainda possui uma ponta afiada, de modo que seja possível injetar sem causar danos. Muito bem, agora vamos encher nossas pipetas de injeção com DNA. É importante que você prepare seu DNA de maneira livre de endotoxinas, para que não injete lipopolissacarídeos junto com o seu DNA.

Então vamos pegar nosso DNA e, na verdade, preparar nosso parafilm. Você vai fazer seu parafilm aqui e vai querer coletar seu DNA e simplesmente colocá-lo como um pequeno ponto nesse filme de parafina. Em seguida, vamos pegar, normalmente pego, para cada 10 microlitros do meu DNA, que geralmente uso na concentração de cerca de 1,5 a 1,7 microgramas por microlitro.

Vou usar cerca de um microlitro deste corante verde rápido. Isso serve apenas para nos ajudar a localizar nossa injeção e garantir que injetamos com sucesso no ventrículo. Então, vou misturar este corante verde rápido com o meu DNA.

Em seguida, pegue seu eletrodo de injeção e vamos encher a pipeta puxando o êmbolo para trás. E você pode ver aqui que, se a pipeta estiver corretamente biselada e tiver uma abertura suficientemente grande, o DNI deverá ser carregado com bastante facilidade. Às vezes, é necessário mover o êmbolo para frente e para trás para ajudar no carregamento adequado.

E então você pode carregar a pipeta assim. Agora temos o DNA totalmente carregado nesta pipeta e está pronto para a injeção. Ok, então agora vou lavar o animal com álcool e iodo, mas primeiro, é claro, quero fazer uma compressão no dedo do pé para garantir que o animal está completamente anestesiado, e parece estar bom.

Então posso prosseguir e começar. E começo, assim como nos ratos, com uma série de três, iniciando com o etanol. Ok, iodo.

Para minimizar o risco de infecção, observe que, quando William abre as luvas, ele limpa o animal com a parte que não foi tocada pelos dedos. Assim, maximiza-se a limpeza da área. Em segundo lugar, ele realiza apenas uma única passada para evitar a distribuição de germes pela superfície abdominal.

Ok, ótimo. Agora vou limpar um pouco e colocar umas luvas cirúrgicas. Ok. Ok. Ok. Agora vou abrir o camundongo e retirar os cornos uterinos, começando com uma pequena preensão da pele.

Vou fazer outra pressão no dedo do pé aqui só para ter certeza de que ela está completamente anestesiada, e está bom. Então vou pinçar a pele e fazer uma pequena prega que fique elevada, o que facilita o corte. E novamente, queremos fazer a incisão exatamente ao longo da linha média do animal para evitar quaisquer vasos sanguíneos.

Normalmente corto a pele dessa maneira, separo-a e exponho o músculo. E uma vez feito isso, é possível visualizar facilmente a linha média no músculo. Ela é muito bem definida.

Vou pegar um pouco do músculo aqui, cortar, e esse é um bom tamanho de incisão. Eu realmente não gostaria de fazer uma incisão maior que essa. Em seguida, uso este dissector apenas para levantar o músculo e a pele, puxando-os para o lado, e então faço uma manipulação muito suave aqui, tentando posicionar o dissector entre os dois embriões, entre dois embriões, para que eu possa puxá-los suavemente, sem danificá-los de forma alguma.

Às vezes é mais fácil do que em outros momentos. Pronto. Então, basta puxar suavemente e, assim que conseguir passar, posso apenas empurrá-los para fora.

É importante nunca pinçar os embriões em momento algum, mas apenas guiá-los, apenas empurrá-los suavemente. E, uma vez que você os retirar, quero ter certeza de mantê-los sempre muito úmidos. Você não deve permitir que eles sequem.

E vamos ver, vou usar meu freer novamente aqui, sondando ao redor. Pronto. Isso é ótimo.

E por isso eu sempre quero garantir que as tenha removido todas, porque é fácil deixar uma para trás se você não verificar a presença dos ovários. Então, eu sempre as retiro novamente com muita delicadeza, mas observando e procurando pelos ovários no final, que estão bem ali. E eles parecem apenas uma pequena massa de tecido vermelho neste animal.

E então vire-os, volte e verifique o outro lado e posso vê-los ali. Portanto, certifique-se de mantê-los hidratados e estamos prontos para começar. Algo que gostaria de destacar é que você não deve, deve pegar os embriões com muita delicadeza e pegar apenas os embriões.

Não segure onde estão os vasos sanguíneos, pois eles podem se danificar facilmente e o animal poderá sofrer uma hemorragia, o que reduzirá drasticamente a taxa de sobrevivência. Portanto, a primeira coisa que queremos determinar é onde está a cabeça no embrião que desejamos injetar com o DNA. Fazemos isso girando suavemente o animal e observando cada parte ventral.

Então, neste exemplo específico, temos que a cabeça está à minha direita e a cauda está próxima à minha esquerda. A linha média está nesta posição e William vai proceder para posicionar o embrião de maneira apropriada para que eu possa injetá-lo, assim como nos ratos. Eu sempre os posiciono com a cabeça voltada para cima, com o lado direito da mãe voltado para mim.

E então vou começar isso agora. Ok, então você pode ver o polo do assoalho esquerdo ali, mova-se um pouco e você certamente pode ver a linha média bem ali. Vou tentar girar um pouco para que fique em uma boa posição para David.

Ok, e agora vou prosseguir com a injeção no ventrículo esquerdo. Podemos observar aqui que o ventrículo esquerdo está totalmente e completamente preenchido com DNA. Podemos ver que parte do corante se espalhou para o ventrículo direito e também para os terceiro e quarto ventrículos aqui.

Isso é um bom indicador de uma boa injeção. Agora vamos proceder com a eletroporação do DNA nas células. A consideração importante aqui é saber qual eletrodo é o lado positivo.

Sabemos que o eletrodo com o cabo azul é o positivo e esse lado deve ser posicionado no lado que desejamos que seja eletroporado com o DNA. Como injetamos a maior parte do DNA no ventrículo esquerdo, posicionarei o eletrodo positivo no lado esquerdo, assim, e então aplicaremos cinco pulsos — e é isso. É importante manter os eletrodos completamente umedecidos em PBS para garantir um bom contato entre os eletrodos e o útero, e para que a transmissão dos pulsos elétricos seja adequada.

Ok, agora que a exploração está completa, vou prosseguir colocando os chifres de volta para dentro. Para fazer isso, movo os chifres suavemente para um dos lados, alcanço aqui embaixo, pego o músculo e a pele e, com cuidado, vou empurrando-os de volta para dentro. Tudo bem, ótimo.

Tenha cuidado com a bexiga. Posso fazer o outro lado. E então o que fazemos é apenas sacudir um pouco para ajudar a acomodá-los lá dentro.

Pode-se usar o freer um pouco para achatá-los suavemente. E então o que vou fazer é lavar com três mililitros de antibiótico antimicótico. Vamos fazer uma compressão no dedo do pé para garantir que ela está completamente anestesiada antes de iniciar a sutura.

E isso parece bom. Vou usar Henry Shine. Número seis, sutura cirúrgica.

Eu prefiro fazer pontos corridos. Acho que eles resistem melhor. E vamos começar apenas passando a agulha por ali, puxando-a, enrolando três vezes, segurando a ponta e puxando-a para dentro.

1, 2, 3, corte o excesso. Portanto, você deseja continuar descendo pela linha com espaçamento uniforme e puxar firmemente. E você deve ir um pouco além do ponto onde a incisão termina e amarrar novamente.

E estou fazendo isso agora. Puxe o tecido ou a pele um pouco para trás. Há um pouco de sangramento nesse local.

Deve ser seguro. Mantemos um cautério por perto caso ocorra sangramento, o que acontece ocasionalmente. E o cautério funciona bem para interromper isso.

Então, certo, já ultrapassei a incisão. Vou parar aqui. Puxe para passar, faça um laço, gire três vezes, pegue o laço e puxe-o para baixo.

Gire três vezes, pegue a laçada, puxe-a para dentro e corte o excesso. Coloque a agulha no recipiente para objetos perfurocortantes. Em seguida, vamos usar um grampeador.

Vamos utilizar grampos tamanho sete neste animal. Usamos o tamanho sete para camundongos e nove para ratos.

Segure apenas a pele, levante-a um pouco e comece a cortar. Pegue o clipe novamente. Queremos espaçamento uniforme ao longo de toda a extensão, indo um pouco além da incisão, e isso está bom.

Prossiga com a limpeza da área inteira usando um lenço com álcool. Em seguida, vamos administrar uma injeção de buprenorfina nela, apenas para garantir que ela não sinta qualquer dor. E continuaremos a monitorá-la ao longo dos próximos dias para assegurar que ela permaneça saudável e sem qualquer tipo de dor.

Ok, agora que aplicamos uma injeção de buprenorfina nela, vamos colocá-la de volta na sua gaiola original para que ela se sinta confortável ao acordar, colocaremos a gaiola dentro do incubador e a deixaremos lá por cerca de 20 minutos, até que ela acorde completamente e esteja seca. Vamos mostrar como realizar a eletroporação *in vivo in utero* de DNA plasmidial. Podemos injetar qualquer molécula.

Pode ser o plaid D ou pode ser drogas. Os fatores de crescimento morrem. Se você precisar que essas moléculas sejam entregues nas células e elas não atravessarem por difusão passiva, você precisará de eletroporação e, para isso, as moléculas terão que estar carregadas.

Mas basicamente, as possibilidades são ilimitadas. Um exemplo de um vetor alternativo para a entrega de genes nas células são os vírus.

E no passado, utilizamos retrovírus para marcar as células gliais com DNA e demonstrar como elas se dividem e se tornam neurônios, migrando eventualmente para o córtex após a marcação das células com um vírus ou por meio de eletroporação, ou após a injeção de medicamentos ou outras moléculas para afetar o desenvolvimento do cérebro. Você pode estudar isso por várias técnicas. Uma delas é realizar o registro temporal, no qual você fará culturas de fatias organotípicas.

Em seguida, você acompanhará o destino das células utilizando um microscópio. Como é possível observar aqui, tempo 0,0. Começamos com um aglomerado de células que estão muito próximas ao ventrículo lateral.

E, com o passar do tempo, podemos observar que as células começam a migrar para fora da zona ventricular e em direção à placa cortical. Além disso, fixamos os embriões e realizamos imunohistoquímica para estudar, você sabe, a distribuição de diferentes moléculas ou para determinar o destino dessas diferentes células. Outra possibilidade é realizar eletrofisiologia.

Identificamos as células marcadas e, em seguida, estudamos suas propriedades elétricas. Bem, obrigado por acompanhar a gente hoje. Esperamos que você goste das nossas demonstrações e que tenha sucesso ao realizar seus experimentos.

Se você tiver alguma dúvida, sinta-se à vontade para entrar em contato conosco. Você sabe, boa sorte.