In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

Olá, sou William Tis do Laboratório Krete. Hoje, eu e outros vamos mostrar a vocês injeções intrauterinas de embriões de camundongos E 15. Olá, meu nome é Laura Elias.

Hoje vou mostrar como preparar as pipetas de microinjeção e carregá-las para as injeções intravenosas internas e eletroporação que faremos. Meu nome é David Castaneda e hoje estarei ajudando com injeções in vivo in utero de embriões de camundongos. Estaremos injetando DNA de plasmídeo no ventrículo lateral de embriões de camundongos em desenvolvimento.

Visamos o córtex CE desses embriões para obter a expressão de diferentes moléculas pelas células gliais e que se tornarão neurônios mais tarde no desenvolvimento. Ao fazer essas injeções intrauterinas, existem algumas ferramentas importantes que você precisará usar e eu as mostrarei a você. Agora. Usamos um fórceps mais livre, um par de addin.

Um, um par serrilhado e outro par que tem um pequeno dente na ponta. Usamos um par de hemostáticos. Esta é uma tesoura.

E então usamos esses dois grampeadores. Estes são os maiores que usamos para ratos. Este é o menor que usamos para ratos.

Usa um grampo de tamanho sete, e este usa um grampo de tamanho nove e eles são apenas carregados por mola. Algumas das coisas que usamos aqui para ajudar nas cirurgias, usamos apenas uma fonte de luz de fibra óptica simples com uma cabeça dupla. Usamos uma almofada aquecida que circula água quente por lá para mantê-la aquecida.

A superfície de trabalho, usamos este sistema de eletroporação feito pela BTX. Temos alguns tamanhos diferentes de pás que usamos com base no tamanho e no tamanho dos embriões. O lado azul é o lado positivo.

Ok, então para os camundongos usamos um vaporizador de flúor iso. Descobrimos que aumenta nossa taxa de sobrevivência da mãe e dos embriões. Também nos permite trazer o animal para dentro e para fora da consciência muito rapidamente e de uma maneira muito controlada.

Então, por esse motivo, achamos muito útil. Tudo bem, então agora vamos chanfrar nossas pipetas de injeção. E isso é muito importante para que sua pipeta tenha uma abertura grande o suficiente para que você possa carregar seu DNA, mas também que seja muito, muito afiada para não danificar o embrião quando você injetar.

E se você danificar o embrião ao injetar, você terá uma taxa de mortalidade muito maior. E então isso não é bom. Portanto, este é realmente um processo muito importante como nesta cirurgia.

E primeiro vamos colocar um pouco de água nessa pedra chanfrada que está girando aqui. E então vamos pegar, vamos ver aqui, apenas um, um, um bastão. E vamos colocar nossa pipeta que acabamos de colocar neste bastão com um pouco de fita adesiva.

E vamos usar um desses micromanipuladores para segurar a pipeta no chanfro e permitir que ela chanfre aqui. Então, basta colocar isso e usamos o microscópio para visualizar a ponta da pipeta. E vamos colocá-lo na água em cima do chanfro para que haja um pouco de pressão.

E você pode ver a ponta pressionando contra a pedra aqui. E deixe-o chanfrar por algum tempo por pelo menos, você sabe, 15 minutos. Eu gosto de deixá-los mesmo por, você sabe, uma hora.

Às vezes, eles ficam muito, muito afiados, mas definitivamente depende pessoa por pessoa quanto tempo eles chanfram suas pipetas. Tudo bem, então aqui temos, você pode ver na parte superior que temos uma pipeta que foi puxada e que ainda não foi chanfrada. Então, embora seja afiado, não tem nenhuma abertura através da qual você possa carregar seu DNA.

Agora a pipeta inferior foi chanfrada e você pode ver esta bela abertura angular Agora isso permitirá que você carregue seu DNA, mas ainda tem uma ponta afiada para que você possa injetar sem causar nenhum dano. Tudo bem, então agora vamos encher nossas pipetas de injeção com DNA. Portanto, é importante que você prepare seu DNA de maneira livre de endotoxinas para não injetar nenhum dos lipopolissacarídeos ao injetar seu DNA.

Então, vamos pegar nosso DNA e, na verdade, aqui, preparar nossa paraforma. Então você vai fazer sua paraforma aqui e você vai querer coletar seu DNA e colocá-lo como um pequeno ponto neste filme para. E então vamos pegar, então eu costumo pegar para cada 10 microlitros do meu DNA, que eu costumo usar em cerca de 1,5 a 1,7 microgramas de um microlitro.

Vou usar cerca de um microlitro desse corante verde rápido. E isso é apenas para nos ajudar a localizar nossa injeção e garantir que tenhamos injetado com sucesso no ventrículo. Então, vou misturar esse corante verde rápido com meu DNA.

E então você pega seu eletrodo de injeção e nós enchemos a pipeta puxando o êmbolo para trás. E você pode ver aqui se, se a pipeta estiver chanfrada corretamente e tiver uma abertura grande o suficiente, o DNI deve carregar com bastante facilidade. Às vezes, você precisa apenas mover o êmbolo para frente e para trás para ajudá-lo a carregar corretamente.

E então você pode carregar a pipeta assim. E então temos o DNA totalmente carregado nesta pipeta e está pronto para injeção. Ok, então vou lavar o animal agora com álcool e iodo, mas primeiro, é claro, quero beliscar o dedo do pé para ter certeza de que o animal está totalmente embaixo e com boa aparência.

Então eu posso ir em frente e começar. E eu começo com, assim como nos ratos, fazemos uma série de três deles, começando com o etanol. Ok, iodo.

Para minimizar o risco de infecção, observe que, quando William abriu os lenços, ele limpou o animal com a parte que não foi tocada pelos dedos. Para maximizar que a área esteja limpa. Em segundo lugar, ele faz apenas uma limpeza para evitar a distribuição de germes sobre a superfície abdominal.

Ok, ótimo. Agora vou limpar um pouco e vamos colocar algumas luvas cirúrgicas. Ok.Ok.Ok. Então, agora vou abrir o mouse e tirar os chifres uterinos e vou começar com uma pequena pitada na pele.

Deixe-me beliscar outro dedo do pé aqui só para ter certeza de que ela está totalmente embaixo e isso é bom. Então, vou beliscar a pele e fazer uma pequena ondulação que vai ficar para cima, o que torna mais fácil para mim cortar. E, novamente, queremos fazer a incisão ao longo da linha média do animal para evitar vasos sanguíneos.

Costumo cortar a pele assim e separá-la e expor o músculo. E depois de fazer isso, você pode ver facilmente a linha média lá no músculo. É muito definido.

Vou pegar um pouco de músculo lá, cortar E essa é uma incisão de bom tamanho. Eu realmente não gostaria de ir maior do que isso. E então eu uso esse liberador apenas para levantar o músculo e a pele, puxá-lo para o lado, e então eu faço uma sonda muito suave aqui e tento posicionar o mais livre entre os dois embriões, entre dois embriões para que eu possa puxá-los suavemente sem danificá-los.

Às vezes é mais fácil do que outras. Lá vamos nós. Então, gentilmente, puxe-o e, uma vez que eu consiga, posso simplesmente empurrá-los para fora.

É importante nunca beliscar os embriões, mas você só quer guiá-los, apenas cutucá-los. E depois de tirá-los, quero ter certeza de mantê-los sempre bem molhados. Você não quer permitir que eles sequem.

E vamos ver, eu uso meu mais livre novamente aqui, sonde ao redor. Lá vamos nós. Fantástico.

E então eu sempre quero ter certeza de que tenho todos eles para fora, porque é fácil deixar um lá se você não verificar os ovários. Então, eu sempre os puxo com muito cuidado novamente, mas procurando e olhando para ver os ovários no final, que está bem ali. E parece apenas uma pequena massa de tecido vermelho neste animal.

E então vire-os, volte e verifique o outro lado e eu posso vê-los lá. Portanto, certifique-se de mantê-los hidratados e estamos prontos para ir. Algo que quero salientar é que você não, você deve pegar os embriões com muito cuidado e apenas agarrar os embriões.

Não agarre onde estão os vasos sanguíneos porque eles se tornarão, eles podem ser danificados com muita facilidade e terão, o animal terá uma hemorragia e a taxa de sobrevivência cairá drasticamente. Então, a primeira coisa que queremos determinar é onde está a cabeça no embrião que queremos injetar com o DNA. Fazemos isso girando o animal suavemente e olhando para o ventral, cada parte ventral.

Então, neste exemplo em particular, temos que a cabeça está à minha direita e a cauda está perto da minha esquerda. A linha média está nesta posição e William vai proceder à posição do embrião de maneira apropriada para que eu possa injetá-lo como nos ratos. Eu sempre os posiciono com a cabeça, o lado direito da mãe voltado para mim.

E então vou começar isso agora. Ok, então você pode ver o poste esquerdo do piso lá, mover-se um pouco e você pode definitivamente ver a linha média ali. Vou tentar aumentar um pouco para que esteja em boa posição para David.

Ok, e agora vou prosseguir para injetar o ventrículo esquerdo. Podemos ver aqui que o ventrículo esquerdo está totalmente, completamente preenchido com DNA. Podemos ver que alguns dados se espalharam para o ventrículo direito e também para o terceiro e quatro ventrículos aqui.

Esse é um bom indicador de boa injeção. Então, agora vamos prosseguir com a eletro do DNA nas células. A consideração importante aqui é saber qual eletrodo é o lado positivo.

Sabemos que aquele com a alça azul aqui é o eletrodo positivo e esse lado deve ir para o lado em que queremos ser eletroporados com o DNA. Então, como temos o, injetamos o ventrículo esquerdo com a maior parte do DNAI e posicionamos o eletrodo positivo no lado esquerdo assim, e então aplicamos cinco pulsos e pronto. É importante ter os eletrodos completamente molhados em PBS para que o contato entre os eletrodos e o útero seja bom e a transmissão dos pulsos elétricos seja adequada.

Ok, agora que a exploração está completa, vou colocar os chifres de volta dentro. E como eu vou fazer isso é mover muito suavemente os chifres para um lado, chegar aqui e agarrar o músculo e a pele e meio que suavemente, suavemente mais fácil de volta lá. Tudo bem, legal.

Tenha cuidado com a bexiga. Eu posso fazer o outro lado. E então o que fazemos é apenas dar a ela uma pequena sacudida para acalmá-los lá.

Pode usar um pouco o mais livre para achatá-los suavemente. E então o que vou fazer é lavar com três mils de antibiótico antimicótico. Vamos beliscar o dedo do pé para ter certeza de que ela está completamente fora antes de começar a suturar.

E isso parece bom. Vou usar Henry Shine. Número seis, sutura cirúrgica.

Eu prefiro fazer pontos de bloco. Acho que eles aguentam melhor. E vamos começar apenas colocando a agulha lá, puxando-a, enrolando três vezes, agarrando a ponta, puxando-a.

1, 2, 3, corte o excesso. Então você quer continuar descendo a linha uniformemente e puxar com força. E você quer ir um pouco além de onde a incisão termina e amarrar novamente.

E estou me aproximando disso agora. Puxe o tecido para trás ou a pele um pouco para trás. Há um pouco de sangramento lá.

Deve ficar tudo bem. Mantemos um cauterizador por perto para o caso de sangrarmos, o que acontece ocasionalmente. E seu cauterizador funciona bem para impedir isso.

Então, ok, estou além da incisão. Vou parar por aí. Puxe, faça um laço, gire três vezes, pegue o laço e puxe-o para baixo.

Gire três vezes, pegue o laço, puxe-o e desligue o excesso. Coloque a agulha nos objetos cortantes. E então vamos usar um grampeador.

Vamos usar grampos de tamanho sete neste animal. Usamos sete para ratos. Nove para ratos.

Basta pegar a pele, puxá-la um pouco para cima e começar a cortar. Pegue o clipe novamente. Queremos ir uniformemente espaçados até um pouco além da incisão e isso é bom.

Acompanhe com um lenço umedecido com álcool em toda a área. E então vamos dar a ela uma injeção de buprenorfina apenas para garantir que ela sinta alguma dor. E continuaremos a monitorá-la nos próximos dias para garantir que ela permaneça saudável e não sinta nenhum tipo de dor.

Ok, agora que demos a ela uma injeção de buprenorfina, vamos colocá-la de volta em sua gaiola original para que ela se sinta confortável quando acordar, colocá-la na incubadora e permitir que ela fique lá por 20 minutos ou mais até que ela esteja totalmente acordada e seca. Temos Mostre-lhe como realizar in vivo no útero, eletroporação de plasma, DNA. Podemos injetar qualquer molécula.

Pode ser xadrez D ou podem ser drogas. Os fatores de crescimento morrem. Se você precisar que essas moléculas sejam entregues às células e elas não passarem por difusão passiva, você precisará de eletroporação e, para isso, as moléculas terão que ser carregadas.

Mas, basicamente, as possibilidades são ilimitadas. Um exemplo de vetor alternativo para entregar genes na célula. Nossos vírus.

E no passado usamos retrovírus para rotular gls com DNA e mostrar como eles se dividem e se tornam neurônios, eventualmente migrando para o córtex depois que você rotula as células com um vírus ou usa eletroporação, ou você injeta drogas ou quaisquer outras moléculas para afetar o desenvolvimento do cérebro. Você pode estudar isso por várias técnicas. Uma delas é fazer TimeLapse em que você fará culturas de fatias organotípicas.

E então você seguirá o destino das células usando um microscópio. Como você pode ver aqui, tempo 0.0. Começamos com um aglomerado de células que estão muito próximas do ventrículo lateral.

E com o passar do tempo, podemos ver que as células começam a migrar para fora da zona ventricular e em direção à placa cortical. Além disso, fixamos os embriões e fazemos imuno-histoquímica para estudar, você sabe, diferentes a distribuição de diferentes moléculas, ou para determinar o destino dessas diferentes células. Outra possibilidade é fazer eletrofisiologia.

Identificamos as células marcadoras e depois estudamos suas propriedades elétricas. Bem, obrigado por estar conosco hoje. Esperamos que você goste de nossas demonstrações e que tenha sucesso em fazer seus experimentos.

Se você tiver alguma dúvida, sinta-se, sinta-se à vontade para entrar em contato conosco. Você sabe, boa sorte.