Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa
19 de julho de 2007
Introdução de um gene de interesse em uma célula é um método poderoso para elucidar a sua função in vivo. Este protocolo descreve um método eficiente de uma cultura de transfecting-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), utilizando o aparelho de eletroporação Nucleofector feita por Amaxa.
Olá, eu sou o Steve. Trabalho no laboratório da Dra. Flanagan no Departamento de Patologia da uc, Irvine. Hoje vou mostrar como transfectar células precursoras neurais humanas utilizando um fator nuclear maxis.
Primeiramente, para começar, você precisará de muitas células. Eu diria pelo menos um frasco T25 confluente, pois este protocolo exige uma densidade celular muito alta, portanto você precisará de pelo menos um milhão de células. Primeiro, vou começar removendo as células da superfície usando o tampão de dissociação celular e, em seguida, contando-as.
E para esse procedimento, consulte o meu protocolo de embalagem. A razão pela qual prefiro a Amaxa para os meus experimentos de transfeção é porque a Amaxa desenvolve protocolos de transfeção personalizados para tipos celulares específicos, e no meu caso, para células-tronco neurais. E funciona muito bem.
Oferece uma eficiência de transfeção muito alta e uma viabilidade celular muito elevada. E vamos começar. Agora estou pronto para realizar uma transfeção.
Então, em preparação para esta transfeção, já recobri meu recipiente de cultura celular com fibrina durante a noite. E após isso, adicionei algum meio de crescimento. Neste momento, ele está dentro do incubador aguardando o recebimento das células.
Além disso, preparei todos os meus reagentes, meu vetor de DNA e a solução de transfeção. Então, eles estão todos aqui esperando em gelo. E estou pronto para iniciar a transfeção.
Então, este é o fator nuclear M max e, antes de colocá-lo na cabine de fluxo laminar, vou desinfetá-lo com etanol a 70%, e depois vou limpá-lo com um papel toalha. Acabei de fazer a contagem celular, obtendo um total de 4 milhões de células, e as semeei. Agora estou pronto para iniciar a transfecção.
Primeiro, vou remover o meio em que estão. Tenho aqui o meu pellet celular e vou aspirar o meio em que estavam. Vou tentar remover o máximo de meio possível, porque não quero que haja proteínas ou substâncias semelhantes no meio de transfeção, pois isso poderia afetar o protocolo de transfeção.
Então, removi praticamente todo o meio e agora vou ressuspender este pellet celular em cem microlitros da solução específica de fator nuclear para células-tronco neurais de camundongo. A Mxa produz uma solução de transfeção para transfectar células-tronco neurais de camundongo, mas não possui uma versão para células-tronco neurais humanas; descobrimos, no entanto, que a solução para células de camundongo funciona muito bem. Assim, vou pipetar cem microlitros dessa solução de fator nuclear para células-tronco neurais de camundongo.
E vou ressuspender bem o meu pellet celular nele, de modo que não haja aglomerados de células remanescentes. Assim, basicamente, terei uma suspensão celular homogênea. Portanto, vou pipetar para cima e para baixo cerca de 10 vezes.
Então, acho que agora tenho uma mistura bastante homogênea, e vou transferi-la agora para um tubo aberto de 1,5 ml. Estou usando uma pipeta P1000 e vou me certificar de que peguei toda essa solução. Agora tenho minhas 4 milhões de células ressuspendidas em solução de transfeção para camundongo, nova solução para camundongo, e agora vou adicionar cinco microlitros do meu vetor.
Então, eu o mantive o tempo todo em gelo até agora. E então vou, primeiro, quadruplicar cinco microlitros. Agora vou adicioná-lo à suspensão celular.
Agora vou usar uma pipeta P200 ajustada em cerca de 50 microlitros e vou misturar bem as células com o vetor, realmente muito bem. Então, vou pipetar para cima e para baixo 10 vezes. Ok, isso está pronto.
E eu, eu estou pronto para transfectar. Então vou abrir um novo tubo. E também vou pegar uma pipeta especial fornecida pela amaxa.
Então, vou remover a tampa e vou puxar suavemente esta mistura para cima. E vou inserir a pipeta completamente dentro do vete e pressionar suavemente para expelir a solução. Então, vou ligar o fator nuclear máximo e vou ajustar para 33 0 3 3 e pressionar enter.
Então vou colocar o vete no suporte para vete e, em seguida, vou girar a roda; agora estou pronto para realizar a transfeção. Mas antes disso, vou verificar se tenho meio aquecido preparado para ser adicionado imediatamente às células transfectadas. Isso ajuda a aumentar a viabilidade celular se eu adicionar meio aquecido ao, ao vete logo após a transfeção.
Então, vou preparar um P1000. E também vou pegar o meio pré-aquecido que está no incubador no momento, para que eu possa transferir as células para o meio imediatamente. Agora vou pressionar enter novamente e está pronto.
E a transfeção bem-sucedida, como você pode ver, apresenta aqui uma camada bem espessa de bolhas que indica transfeção bem-sucedida. Então, vou adicionar 500 microlitros de meio pré-aquecido no vete. Estou adicionando mais meio que as células desejam desesperadamente, e vou usar a mesma pipeta MX para retirar as células do vete.
Então eles estão muito estressados neste momento. Vou colocá-los diretamente em meio quente, mais meio quente. E finalmente, o último passo: vou lavar o Q vete com um pouco mais de meio pré-aquecido para garantir que obtenha todas essas células, e vou colocá-lo no mesmo poço L e colocar a placa imediatamente no incubador.
Nesta imagem, observamos células precursoras neurais humanas que foram transfectadas com um fator nuclear de acesso e semeadas em lamínulas com grade. Assim, já dois dias após a transfeção, temos cerca de 50% de eficiência de transfeção, que podemos observar pela expressão de GFP. Hoje mostrei a vocês como transfectar células precursoras neurais humanas utilizando o fator nuclear Xis.
Boa sorte com sua transfeção.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método eficiente para transfectar células-tronco/precursoras neurais humanas (hNSPCs) utilizando o aparelho de eletroporação Nucleofector. O processo é crucial para o estudo da função gênica in vivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Análise da Função Gênica
Contexto
- A transfeção é uma técnica fundamental para o estudo de genes.
- As células precursoras neurais humanas são essenciais para a pesquisa em neurociência.
- A tecnologia Nucleofector aumenta a eficiência da transfeção.
- Compreender a função dos genes pode levar a avanços no conhecimento da neurobiologia.
Objetivo do Estudo
- Introduzir um gene de interesse em hNSPCs.
- Elucidar a função de genes em um contexto neural.
- Fornecer um protocolo confiável para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Dissociação celular utilizando um tampão.
- Contagem de células para garantir alta densidade.
- Uso do aparelho Nucleofector para eletroporação.
- Transfecção de células precursoras neurais humanas.
Resultados Principais
- Transfecção bem-sucedida de hNSPCs.
- Alta densidade celular é crucial para uma transfeção eficaz.
- O protocolo demonstra reprodutibilidade nos resultados.
- Facilita estudos posteriores sobre a função gênica.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para transfeção gênica em hNSPCs.
- Fornece uma base para pesquisas futuras em neurociência.
- Amplia a compreensão dos papéis dos genes no desenvolvimento neural.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A transfeção de células-tronco/neurais precursoras humanas (hNSPCs) permanece um gargalo na validação de alvos em neurociência devido à baixa eficiência e viabilidade com métodos convencionais. O protocolo de eletroporação com Nucleofector descrito permite entrega gênica confiável com eficiência de transfeção inicial de ~35% e estável de ~70%, apoiando a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Esta abordagem melhora a confiança preditiva para investigação de vias e validação funcional de alvos em modelos de doenças neurodegenerativas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação funcional de alvos terapêuticos em um sistema neural humano fisiologicamente relevante.
- Valor Operacional: Alcança alta eficiência de transfeção sem os prazos de produção de vetores virais ou preocupações de biossegurança.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos do alvo ao associar a modulação gênica a fenótipos neurais em um formato escalonável.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantitativamente mensuráveis (por exemplo, expressão de GFP) para triagem de dose-resposta e fenotípica.
- Valor Operacional: Utiliza parâmetros padronizados de eletroporação e tampão otimizado para resultados reprodutíveis entre experimentos.
- Prontidão do Ensaio: Produz células estavelmente transfectadas adequadas para o desenvolvimento de ensaios de longo prazo e estudos de engajamento de alvo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Utiliza células neurais humanas primárias, aumentando a relevância para os mecanismos de doenças humanas em comparação com linhagens imortalizadas.
- Modelagem Pré-clínica: Permite a criação de modelos neurais isogênicos para validação de alvos e estudos de mecanismo de ação.
- Avanço Ajustado ao Risco: Facilita a avaliação precoce dos efeitos da modulação de alvos antes de se comprometer com modelos in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método de transfeção Nucleofector insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a validação de alvos até a identificação de compostos promissores, ao permitir a modulação gênica confiável em células neurais humanas relevantes para doenças.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio da superexpressão gênica ou silenciamento eficiente em cNPCs humanos.
- Triagem: Fornece células prontas para ensaios com métricas de transfeção quantificáveis para triagem de compostos e validação de alvos.
- Análises: Permite leituras baseadas em fluorescência (por exemplo, GFP) para quantificar a eficiência de transfeção e correlacioná-la com desfechos fenotípicos.
- Pesquisa Translacional: Utiliza células humanas primárias para melhorar a fidelidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e reutilizável de transfeção para múltiplos alvos e programas na descoberta em neurociência.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos por meio de entrega gênica eficiente e reprodutível em células neurais humanas primárias.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de produção de vetores virais, reduzindo prazos e exigências de biossegurança.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos ao permitir a avaliação funcional precoce de alvos em um sistema relevante para humanos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao reduzir a ambiguidade biológica no mecanismo do alvo.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células primárias e otimização de eletroporação.
- Depende do acesso ao dispositivo Nucleofector e a soluções de transfeção específicas para o tipo celular.
- Necessita padronização da densidade celular e da concentração de DNA entre diferentes usuários e laboratórios.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a outros tipos celulares primários, neurais ou não neurais.
- Limitado pela necessidade de alta quantidade inicial de células e manipulação imediata pós-transfeção para manter a viabilidade.
