Name: Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a transfectar células-tronco neurais humanas usando o Nucleofector Amaxa com alta eficiência. Este método permite estudar funções gênicas em contexto neural de forma reprodutível.

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Os autores gostariam de agradecer o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional do Hospital Infantil s, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de culturas hNSPC.

Nota: Consulte o artigo Neural Stem Passaging Humanos Cells ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) ea Human Neural Stem Contando artigo Cells ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262</a> ) para aprender a ressuspender e contar hNSPCs. Preparação <ol><li> Certifique-se que há uma abundância de células disponíveis para transfecção (vários milhões de células para cada DNA a ser transfectadas). </li><li> Revestimento de um prato de cultura de tecidos, no qual as células transfectadas serão distribuídos, com 10 mg / ml fibronectina humana na noite anterior transfecção. Direito antes de iniciar o protocolo de transfecção, remova a fibronectina, lavar o prato com PBS, e media o lugar da cultura no prato. Deixe o prato no 37 ° C a cultura de tecidos incubadora para aquecer a mídia. Além disso, coloque 1 ml de meios de cultura na incubadora para pré-aquecer a 37 ° C. </li><li> Coloque o DNA (s) a ser transfectadas, e solução de transfecção (de Amaxa), sobre o gelo. </li></ol> Transfecção <ol><li> Lavar um número definido de células com PBS (geralmente usamos ~ 5 x 106 células por transfecção). Agregar as células por centrifugação (1000 rpm (~ 200xg) por 5 minutos), retire como PBS tanto quanto possível, e ressuspender o pellet celular em 100 ml da solução de transfecção fornecido com o kit de transfecção. Transferir a suspensão de célula para um tubo eppendorf 1,7 ml. </li><li> Adicionar 5 l do DNA (~ 5-10 mg de DNA por transfecção) para a suspensão de células e misture delicadamente. </li><li> Usando o Amaxa mini-pipeta, transferir a mistura de células-DNA na cuvete transfecção Amaxa. Certifique-se que 1 ml de mídia pré-aquecido a cultura para a próxima etapa. Além disso, remova o prato com meios de cultura de células da incubadora e colocá-la na capa de cultura de tecidos. </li><li> Coloque a cuvete no Nucleofector, gire a roda no sentido horário, e seleccione programa &quot;A-033&quot;. Pressione Enter. </li><li> A transfecção de sucesso é indicada pela presença de uma camada muito densa de bolhas no topo da solução na cuvete. Adicionar 500 mL de mídia quente na cuvete, e usando o Amaxa mini-pipeta, transferir as células transfectadas no prato com pré-aquecido mídia. Lavar a cuvete com a mídia mais morna e adicione a água para o mesmo prato. Coloque o prato com as células do tecido 37 ° C a cultura incubadora. </li></ol>

<ol><li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> Methods. 33, 151-163 (2004).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a> (2007).</li>
</ol>

Este protocolo descreve um procedimento de transfecção relativamente rápida e eficiente para hNSPCs. Usando este procedimento, obtivemos a eficiência de transfecção inicial de ~ 35%. Células transfectadas por este procedimento pode ser usado para estudos de curto prazo (células transfectadas transitoriamente) ou para estudos de longo prazo se um agente de seleção é usado para gerar uma população estável transfectadas. Geramos células transfectadas estavelmente em que ~ 70% das células expressam a proteína exógena. Em hNSPCs transitoriamente...

<table><tbody><tr><td>O Dispositivo Nucleofector</td><td>Ferramenta</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Kit Nucleofector para células-tronco neurais de camundongo</td><td>Reagente</td><td>Amaxa</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr></tbody></table>

transfecting células-tronco neurais com o nucleofector amaxa

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfecção de células primárias de mamíferos neural, tais como tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), comumente usado com os reagentes de transfecção catiônicas lipídicas resultou muitas vezes na viabilidade celular pobres e eficiência de transfecção baixo. Outros métodos mecânicos de introduzir um gene de interesse, como uma arma gene ou microinjeção, também são limitados pela viabilidade celular pobres e baixos números de células transfectadas. A estratégia de usar construções viral para introduzir um gene exógeno em células primárias tem sido condicionada pela quantidade de tempo e trabalho necessário para criar vetores virais e preocupações de segurança em potencial. Descrevemos aqui um protocolo passo a passo para transfecting hNSPCs utilizando dispositivo Nucleofector Amaxa e tecnologia com os parâmetros elétricos atuais e soluções tampão especificamente otimizados para transfecting células-tronco neurais. Usando este protocolo, conseguimos a eficiência de transfecção inicial de ~ 35% e ~ 70% após transfecção estável. O protocolo envolve combinando um elevado número de hNSPCs com o DNA para ser transfectadas no buffer apropriada, seguida de eletroporação com o dispositivo Nucleofector.

Introdução de um gene de interesse em uma célula é um método poderoso para elucidar a sua função in vivo. Este protocolo descreve um método eficiente de uma cultura de transfecting-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), utilizando o aparelho de eletroporação Nucleofector feita por Amaxa.

Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa

Transfecção de células neurais primárias de mamíferos, como células-tronco/precursoras neurais humanas (hNSPCs), com a transfecção por lipídios catiônicos comumente utilizados...

Olá, eu sou o Steve. Trabalho no laboratório da Dra. Flanagan no Departamento de Patologia da uc, Irvine. Hoje vou mostrar como transfectar células precursoras neurais humanas utilizando um fator nuclear maxis.Primeiramente, para começar, você precisará de muitas células. Eu diria pelo menos um frasco T25 confluente, pois este protocolo exige uma densidade celular muito alta, portanto você precisará de pelo menos um milhão de células. Primeiro, vou começar removendo as células da superfície usando o tampão de dissociação celular e, em seguida, contando-as.E para esse procedimento, consulte o meu protocolo de embalagem. A razão pela qual prefiro a Amaxa para os meus experimentos de transfeção é porque a Amaxa desenvolve protocolos de transfeção personalizados para tipos celulares específicos, e no meu caso, para células-tronco neurais. E funciona muito bem.Oferece uma eficiência de transfeção muito alta e uma viabilidade celular muito elevada. E vamos começar. Agora estou pronto para realizar uma transfeção.Então, em preparação para esta transfeção, já recobri meu recipiente de cultura celular com fibrina durante a noite. E após isso, adicionei algum meio de crescimento. Neste momen

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Apesar dos avanços recentes na modificação genética, transfecção de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) continua a ser um processo caprichoso. Para nosso conhecimento, métodos sistemáticos e eficiente para transfectar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) não foram relatados. Aqui, descrevemos protocolos robustos de forma eficiente e transfectar nucleofect iPSCs humanos.

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Este vídeo descreve uma técnica precisa de edição de genoma em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou hiPSCs, usando TALENs para criar quebras de fita dupla em um locus direcionado, induzindo reparo direcionado por homologia para integração de genes de proteínas de fluorescência.

Integração de genes direcionados mediada por TALEN: usando nucleases específicas de sequência projetadas para a inserção precisa do gene da proteína fluorescente em hiPSCs

Este vídeo demonstra a reprogramação direta de células progenitoras hematopoiéticas geneticamente modificadas em células-tronco neuronais. Os fatores de transcrição expressos pelas células progenitoras hematopoiéticas desencadeiam uma cascata de eventos moleculares que facilitam sua transformação. Outros meios específicos são usados para selecionar e cultivar células-tronco neuronais induzidas.

Reprogramação direta de células progenitoras hematopoiéticas em células-tronco neurais

Este vídeo demonstra o processo de indução de células-tronco pluripotentes humanas a se diferenciarem em neurônios, transfectando-as com lentivírus modificados carregando um gene do fator de transcrição neurogênico sob o controle do elemento responsivo à tetraciclina, seguido de tratamento com um derivado de tetraciclina e meio de maturação.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em neurônios usando lentivírus projetados

Linhas celulares Repórter oferecer um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse de populações heterogêneas. No entanto, utilizando a recombinação homóloga convencional em células estaminais embrionárias humanas-alvo do gene é extremamente ineficiente. Relata-se alvo CNS mesencéfalo específico fator de transcrição PITX3 loco com EGFP usando zinc-finger nuclease reforçada recombinação homóloga.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

A edição de genes mediada por TALEN no locus AAVS1 de porto seguro permite a adição de transgenes de alta eficiência em iPSCs humanas. Este protocolo descreve os procedimentos para preparar iPSCs para TALEN e entrega de vetor de doador, transfectar iPSCs e selecionar e isolar clones de iPSC para obter a integração direcionada de um gene GFP para gerar linhagens repórter.

Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

Aqui, descrevemos um sistema de nucleofecção projetado para aumentar a eficiência da entrega de genes em células-tronco neurais expandidas (NSCs) isoladas da zona subventricular murina adulta. Os resultados demonstram que este método melhora significativamente a perturbação gênica em NSCs, superando a eficácia dos protocolos tradicionais de transfecção e aumentando a taxa de sobrevivência celular.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Aqui, descrevemos um protocolo de engenharia de células-tronco quimicamente reprogramadas para obter modulação neuronal precisa, diferenciando essas células em células precursoras dopaminérgicas, transplantando-as em modelos de camundongos da doença de Parkinson e avaliando resultados comportamentais e eletrofisiológicos para confirmar a integração bem-sucedida e a eficácia funcional das células transplantadas.

Regulação quimiogenética em células-tronco precursoras derivadas de células-tronco reprogramadas no tratamento de doenças neurodegenerativas

Aprenda a transfectar células-tronco neurais humanas usando o Nucleofector Amaxa com alta eficiência. Este método permite estudar funções gênicas em contexto neural de forma reprodutível.

Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa

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