Name: Assaying Expressão de Receptores de superfície chemosensory em células heterólogas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Aprenda a detectar receptores quimiossensoriais de superfície em células HEK293T usando coloração em células vivas e microscopia de imunofluorescência. Este método permite visualizar a localização de receptores em sistemas heterólogos.

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Agradecemos aos membros da Matsunami laboratório para leitura crítica deste manuscrito.

1. Procedimento: O procedimento é composto de três partes concluídas ao longo de um tempo total de três dias: as células de transferência, transfecção e imunocitoquímica, um passo realizadas por dia. Transferência e transfecção de células ao longo dos dois primeiros dias devem ser realizados em condições estéreis em câmara de fluxo laminar. Dia 1: Transferência de células HEK293T para ensaio de expressão de superfície. <ol><li> Transferência média (M10): Mix meio essencial mínimo suplementado com 10% (em volume) de soro fetal bovino em condições estéreis. </li><li> Cultivar células a uma confluência desejada em uma placa de cultura 100mm, dependendo do número de placas necessárias para configurar. É importante para determinar a fracção de células a serem transferidos para evitar as células overgrown ou esparsa: por exemplo, de um prato de 100 mm% confluentes 100, pode-se transferir cerca de 3% a um prato de 35 mm para obter cerca de 30% na confluência último. </li><li> Antes da transferência de células, na câmara de fluxo laminar estéril, casaco 22 X 22 milímetros de vidro com lamínulas estéreis poli D lisina (1mg / mL) e coloque uma em cada 35 milímetros placa de cultura de células, lado revestido-se de células de revestimento (Figura 1 ). Permitir que a solução para secar por 5-10 minutos. Durante este intervalo, a fonte de UV na câmara laminar pode ser ligado para esterilizar o lamínulas, se desejar. Poly D lisina ajuda as células heterólogas manter o lamínulas. </li><li> A transferência de células, aspirar a mídia existentes no prato 100mm, lavar-se cuidadosamente a adição de 8 mL PBS estéril, aspirar PBS e trypsinize as células usando 3 mL 0,05% de tripsina-EDTA, quando as células retirar do prato, o bloco mais reação enzimática por adição de 5 mL M10. Triturar as células e transferência de volume requisito para um tubo cônico estéril; centrifugar a 200g por 5 minutos para sedimentar as células. Aspirar fora sobrenadante contendo tripsina-EDTA, deixando o pellet de células intactas. Para transferir as células a 35 pratos mm, adicionar 1 mL M10 para cada prato e triturar a dissociar as células. Adicionar 1 mL das células em suspensão para cada prato. Células incubar durante a 37 ° C, 5% de CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Brasão 22 X 22 milímetros lamínulas de vidro com poli D lisina e colocar um lado revestido em cada prato 35 mm. </li></ol> Dia 2: Transfecção de células HEK293T. <ol><li> 18-24 horas após a transferência, as células estão prontos para a transfecção de receptor a ser testada. Use receptor e RTP1S mamíferos clonados em vetor de expressão PCI, preparados a partir de culturas bacterianas usando Qiagen Miniprep protocolo Kit seguir descrito anteriormente 4. Use receptores que são N terminal marcado com 20 aminoácidos longo rodopsina epítopo para facilitar a imunocoloração. </li><li> Use 1000ng de construir receptor, 250 ng de RTP1S construir e 50 ng de proteína de fluorescência verde cada transfecção. Executar transfecção usando Lipofectamine 2000, conforme manual de fabricantes. </li></ol> Dia 3: Imunocitoquímica para visualizar receptores de células manchadas superfície. <ol><li> Antes de começar, prepare coloração e lavagem soluções e resfriá-los a 4 ° C. Coloração meio: Meio Essencial Mínimo, 45 mL; soro fetal bovino, 5 mL; HEPES (1M), 500 mL (final de concentração 10 mM); Azida de sódio (1,5 M), 500 (concentração final 15mM) mL. Lavar solução: HBSS, 500 mL; HEPES (1M), 5 mL (final de concentração 10 mM); Azida de sódio (1,5 M), 5 mL (concentração final 15mM). Ambas as soluções podem ser armazenadas a 4 ° C para reutilização. Preparar soluções de anticorpos através da diluição de anticorpos necessários no médio coloração vezes 100. </li><li> Iniciar imunoquímica para a coloração de superfície para receptores olfativos cerca de 24 horas após a transfecção. Da realização da coloração de células vivas, a montagem experimental deve ser resfriado a 4 ° C: preencher uma grande contidos com gelo e pat a superfície de gelo para torná-lo o mais uniforme possível, coloque uma bandeja sobre o gelo e pulverizá-lo com 70% etanol. Corte um pedaço de parafilme (menor que o comprimento do tabuleiro) e afixá-lo na bandeja de etanol pulverizado, para obter uma superfície lisa. Transferir a tampa de vidro desliza contendo células transfectadas na parafilme, um de cada vez, lado célula para cima, usando uma pinça. Cada camada tampa de deslizamento com 100 mL de solução de coloração fria primário, extrusão com cuidado a partir de um canto do deslizamento (Figura 2). Depois de todas as camadas lamínulas com solução de anticorpo, tampa da bandeja para evitar a secagem da solução até no ar. Realizar primeira incubação de 45-60 minutos. </li><li> Após a incubação primária, transferir rapidamente lamínulas ao original placas de cultura de 35 mm, que contém a mídia. Aspirar a mídia e adicionar 2 mL de solução de lavagem refrigerados suavemente a partir da borda do prato para evitar a perda de células da lamínula. Aspirar a solução de lavagem e repetir por duas vezes para completar três lavagens. No final da terceira lavagem, não aspire a solução de lavagem para fora. </li><li> Prepare anticorpo secundário solutina mídia coloração e transferir as lamínulas a partir da solução de lavagem a uma camada parafilme recém-afixada na mesma bandeja. Mais uma vez gentilmente extrude 100 mL de solução anticorpo à camada de cada lamínula, a partir do canto como a primeira incubação. Realização de incubação médio de 30-45 minutos e transferência de volta para a solução de lavagem no original 35 pratos mm. Mais uma vez, lave a tampa desliza três vezes como descrito. </li><li> Aspirar solução de lavagem da última lavagem, e adicionar 2 mL de paraformaldeído 1% refrigerados. Fix células em solução de paraformaldeído refrigerados 1%, em gelo por 15 minutos. </li><li> Monte o lamínulas de vidro em microscópio limpa slides usando Mowiol reagente de montagem, com o lado da célula para baixo e cautelosamente excluir todas as bolhas de ar (Figura 3). Seca do ar, uma vez Mowiol, lave delicadamente lamínulas por adição de água destilada sobre a superfície e aspiração imediatamente. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Camada de cada lamela com 100 mL de solução de coloração fria primária. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Mount as lamelas com o lado da célula para baixo em microscópio de vidro limpo slides usando o reagente de montagem Mowiol. </li></ol> 2. Resultados representativos: Coloração de células vivas permite que se visualize as proteínas na superfície das células, na transfecção de receptores com acompanhantes (neste caso Olfr62 receptor de odorante, com RTP1S Receptor de transporte da proteína) (Figura 4). Coloração da superfície celular dos receptores é caracterizada pelo padrão de coloração ponteada (Figura 4B, inset). Coloração realizada de forma inadequada pode levar a maior ruído, tornando difícil para o observador para distinguir a coloração da superfície real a partir de ruído. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Transfection de receptores com chaperones permite a visualização de proteínas na superfície das células, usando coloração de células vivas. Transfecção do receptor de odorante Olfr62 sozinho (A) e transfecção de Olfr62 com RTP1S chaperone (B). Níveis de expressão GFP servir como controle de transfecção (A 'e B').

<ol><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65, 175-187 (1991).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96, 713-723 (1999).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119, 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Cada etapa deve ser realizada com cuidado para garantir manchas na superfície proeminente e distintivo. O processo de coloração inteira deve ser realizado em frio (no gelo), ea bandeja na qual são colocadas lamínulas deve ser resfriado antes de ser utilizado para garantir células permanecer vivo. Além disso fixação é feito no final do processo de manchas na superfície. Isto está em nítido contraste com a coloração interna, onde a fixação precede coloração para permeabilizar a membrana celular dos anticorpos primário e s...

<table><tbody><tr><td>Lâmina de cobertura 22 X 22 mm (#1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>72200-11</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Meio mínimo essencial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td>Com L-glutamato, sal de Earle&amp;rsquo;s e bicarbonato</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>EMS</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Balanceada de Hanks (HBSS) 1X</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14025</td><td>Com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio</td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>Sem cálcio e magnésio</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina hidrobrometo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0299-1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura celular 35 X 10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25300</td><td>0,05%</td></tr></tbody></table>

assaying expressão de receptores de superfície chemosensory em células heterólogas

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

O mundo vívido de odores é reconhecida pelo senso de olfato. Olfato em ratos é mediada por um repertório de cerca de 1.200 receptores de proteína G acoplada (GPCRs) 1, que são postulados para ligar moléculas de odores voláteis e converter o sinal extracelular em um sinal intracelular por acoplamento com a proteína G Gαolf. Vinculativa da odorants aos receptores é pensado para seguir uma regra combinatória, isto é, um odorante pode ligar vários receptores e um receptor pode ligar vários odores, em diferentes graus 2. Sinalização, bioquímicos e estudos de ligação ligante foram convenientemente realizados para a maioria dos GPCRs usando células heterólogas. Contudo, o uso de células heterólogas para estudo de receptores olfativos, foi impedido por um longo tempo desde a transfecção eles falharam a exportar para a superfície. Saito et al demonstraram Receptor única passagem de transporte da proteína de membrana (RTP) chaperones família mostram maior expressão nos neurônios sensoriais olfativos e atuam como chaperones aos receptores olfativos do tráfego para a superfície em células heterólogas, quando co transfectadas juntos 3. Para realizar ensaios bioquímicos para os receptores usando células heterólogas, é preciso primeiro determinar se o receptor mostra a expressão na superfície robusta na linhagem celular. Isto pode ser analisada pela superexpressão de receptores com o RTP1S chaperone seguido por células vivas coloração fluorescente para rotular o domínio extracelular ou um tag no domínio extracelular exclusivamente. Aqui demonstramos um protocolo para realizar a coloração de células vivas que podem ser usados ​​para detectar receptores olfativos na superfície de células HEK293T convenientemente. Além disso, ele também pode ser usado para ensaio para a expressão de outros receptores de superfície chemosensory ou GPCRs.

Aqui demonstramos um protocolo para realizar a coloração de células vivas que podem ser usados ​​para detectar receptores olfativos na superfície de células HEK293T convenientemente. Além disso, ele também pode ser usado para ensaio para a expressão de outros receptores de superfície chemosensory ou GPCRs.

Assaying Expressão de Receptores de superfície chemosensory em células heterólogas

O mundo vívido dos odores é reconhecido pelo sentido da olfação. A olfação em camundongos é mediada por um repertório de cerca de 1200 receptores acoplados à proteína G...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como a expressão superficial de receptores quimiossensoriais pode ser detectada por meio de marcação em células vivas em células HEK 293T, o que é realizado primeiramente semeando as células em lamínulas revestidas com poli-D-lisina em placas de cultura. O segundo passo do procedimento é transfectar o DNA em células HEK 293T. O terceiro passo do procedimento é realizar a marcação em células vivas utilizando anticorpos primários e secundários conjugados com fluoróforo.O passo final do procedimento é fixar as células coradas e montar lamínulas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a localização de receptores na superfície das células por meio de microscopia de imunofluorescência. Este método permite detectar receptores quimiossensoriais exportados para a superfície celular de células heterólogas, como as HK 2 93 T. Uma demonstração visual deste método vai indicar os passos-chave que precisam ser seguidos rigorosamente para manter as células vivas durante a auto-coloração celular.Indivíduos novos neste método podem achar etapas como transferência, manipulação e montagem da lamínula difíceis. No entanto, com algumas práticas, a técnica torna-se fácil. Com um protocolo modificado que utiliza uma coluna cgen, purifique o DNA plasmático do receptor e do receptor. O transporte da proteína RT TP um s clonado em um vetor de expressão PCI garante que, para imunomarcação, o receptor revestido seja marcado na extremidade C com um epítopo de 20 aminoácidos de comprimento para facilitar a aderência das células.Codifique lamínulas de vidro com um miligrama por mililitro. Após a polilisina, coloque as lamínulas em placas de cultura celular de 35 milímetros com o lado revestido voltado para cima, para secar ao ar dentro da câmara de fluxo laminar estéril. Plaque células HT K 2 9 3 T até aproximadamente 30% de densidade em um mililitro de meio M 10, certificando-se de que nenhuma bolha de ar fique aprisionada entre a lamínula e a placa de cultura celular. Incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 18 a 24 horas. Para cada transfeção, prepare uma mistura de DNA contendo 1000 nanogramas do construto do receptor, 250 nanogramas do construto RTP um s e 50 nanogramas do construto GFP.De acordo com as instruções do fabricante, transfecte as células com lipofectamina 2000. Prepare o meio de coloração adicionando azida sódica e hipóxido ao M 10. Este pode ser armazenado a quatro graus Celsius por vários meses.Em seguida, prepare o tampão de lavagem contendo azida de sódio 15 milimolar e heis 10 milimolar. Em HBSS frio, o tampão de lavagem pode ser armazenado a quatro graus Celsius por vários meses. Para realizar a coloração em condição fria, coloque uma bandeja com parfum sobre gelo durante cinco minutos.Com o lado das células voltado para cima, transfira as lamínulas de vidro contendo as células transfectadas para o paraformal a partir do canto da lamínula. Adicione cuidadosamente 100 microlitros do anticorpo primário frio diluído no meio de coloração. Incube por 60 minutos à temperatura ambiente. Agora, lave as células nas placas de cultura originais de 35 milímetros alternando a adição e a aspiração da solução de lavagem fria.Repita duas vezes. Da mesma forma, incube o anticorpo secundário conjugado SI três por 30 minutos. Realize as lavagens três vezes em placas de 35 milímetros.Por fim, fixe as células com solução fria de paraformaldeído a 1%, tomando cuidado para excluir todas as bolhas de ar. Monte as lamínulas com o lado das células voltado para baixo sobre lâminas de microscopia usando mole, enxaguando a superfície das lamínulas com água destilada para remover depósitos de sal.Normalmente, como com o OL FFR 62 e os RTPs, a marcação de receptores na superfície celular é caracterizada pela aparência pontilhada do sinal fluorescente proveniente do anticorpo conjugado. Uma vez dominada, esta técnica pode ser usada para marcar de 32 a 40 lamínulas em apenas duas horas e meia a três horas. Ao realizar este procedimento com múltiplas lamínulas, é importante transferir e iniciar a incubação com o anticorpo uma lamínula por vez para evitar que as células sequem.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: de March, C. A. et. al., Monitoramento in vitro em tempo real da ativação do receptor de odor por um odorante na fase de vapor. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o método para monitorar a ativação em tempo real de receptores de odor em células recombinantes de mamíferos usando medição de luminescência. A ligação ao odorante desencadeia a ativação da proteína G e a produção de cAMP, ativando proteínas glosensor que emitem luminescência após a ligação ao substrato, fornecendo uma...

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