Superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer

A invasão e a progressão do câncer envolvem um fenótipo celular modal, regulado de forma complexa por fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular presentes no microambiente tumoral. O ácido hialurônico ou HA é um componente estromal da matriz extracelular conhecido por facilitar a progressão tumoral, aumentando a invasão, o crescimento e a angiogênese por meio da interação com seu receptor na superfície celular. A ligação do HA ao CD44 induz eventos de sinalização que promovem o crescimento, a sobrevivência e a migração das células tumorais, aumentando assim a disseminação metastática. Este protocolo permite estudar a adesão, a migração e o crescimento de células cancerígenas sobre HA exógeno.

A fotolitografia padrão é utilizada para fabricar um carimbo elastomérico com microdesenho, que é então usado para criar uma matriz padronizada de moléculas de aminoselina em substratos de vidro. Em seguida, realiza-se a química de carbodiimida para ligar covalentemente o ácido hialurônico (HA) ao microdesenho de aminoselina. Assim, são criados microdesenhos de HA, sobre os quais células cancerígenas cultivadas podem ser semeadas, permitindo visualizar as interações das células cancerígenas com o ácido hialurônico exógeno por meio de microscopia óptica, técnicas de imagem de alta resolução, como microscopia eletrônica de varredura, ou microscopia por imunofluorescência.

O método para criar superfícies de hidroxiapatita com microestrutura apresentado neste artigo em vídeo pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da pesquisa do câncer, como elucidar ainda mais o papel do ácido hialurônico exógeno na progressão do câncer. Para fabricar um carimbo de polimetil metacrilato ou PDMS com microestrutura, que será usado para imprimir lâminas de vidro com HA, comece pegando uma nova pastilha de silício com pinças.

Em seguida, sobre a pia do laboratório. Use um frasco lavador para enxaguar a pastilha com etanol e seque com um jato de ar. Desligue as luzes do ambiente.

Em seguida, utilizando pinças, transfira a pastilha para um spin coater usando uma pipeta de transferência, cobrindo pelo menos 80% da superfície da pastilha com resistência fotográfica negativa SU 2025; faça o revestimento por centrifugação durante 10 segundos a 600 RPM. Depois, durante 30 segundos a 3000 RPM, transfira a pastilha revestida com a resistência fotográfica para uma placa aquecida e realize a pré-cura a 95 graus Celsius por três minutos. Em seguida, remova-a da placa aquecida e deixe esfriar por um minuto.

Coloque uma máscara pré-fabricada com o padrão desejado sobre a pastilha revestida com fotoresina e exponha à radiação UV por 20 segundos. Em seguida, transfira a pastilha para uma placa aquecedora e faça uma cura a quente a 110 graus Celsius por seis minutos.

Ligue as luzes e remova a pastilha da placa aquecedora. Neste momento, padrões distintos devem estar visíveis com uma pipeta de transferência. Enxágue cuidadosamente a pastilha com o revelador de fotoresina SU eight após três enxágues com a solução reveladora, depois enxágue com etanol.

Se houver qualquer resíduo branco, repita a lavagem com solução reveladora de fotoresina ou simplesmente mergulhe a pastilha na solução reveladora por dois minutos e lave novamente com etanol, enxágue com água e seque com um jato de ar em um barco de soro grande. Misture a solução de elastômero de PDMS e agente de cura na proporção de 10 para um em peso; para a pastilha mostrada aqui, 22 gramas é suficiente. Despeje em um tubo de centrífuga e gire a 900 RPM por cinco minutos.

Para remover quaisquer bolhas de ar, coloque a pastilha padronizada em uma placa de Petri de tamanho apropriado. Despeje solução de PDMS suficiente sobre ela para cobrir completamente a pastilha com uma espessura de cerca de um quarto de polegada. Se houver bolhas na superfície da pastilha, coloque-a em um dessecador a vácuo até que desapareçam.

Deixe curar durante a noite à temperatura ambiente para formar um carimbo elastomérico complementar. Se o PDMS não estiver completamente curado após 12 horas, coloque a pastilha em uma estufa a 60 graus Celsius por 30 minutos. Remova cuidadosamente o PDMS da pastilha.

Em seguida, utilizando uma lâmina, corte o carimbo no tamanho desejado. Coloque o carimbo em um béquer de vidro com etanol, preferencialmente dentro de um suporte plástico, e submeta à sonicação por 15 minutos. As pastilhas podem ser usadas várias vezes para criar novos carimbos elastoméricos destinados a imobilizar covalentemente ha em superfícies de vidro em áreas definidas.

Inicie limpando todas as lâminas a serem utilizadas em um limpador de plasma, conforme as instruções no texto acompanhante. Após a limpeza das lâminas de vidro, use pinças para removê-las do limpador de plasma. Coloque as lâminas em uma placa de Petri de plástico e reserve-as para uso posterior.

Em seguida, prepare a solução de amino cline para ser aplicada na lâmina de vidro a fim de ligar o ácido hialurônico em um tubo de centrífuga de 15 mililitros de poliestireno. Prepare uma solução fresca de 3% volume por volume de trimetóxi (3-aminopropil) silano ou A-P-T-M-S em etanol 95% volume por volume, perfazendo um volume total de cinco mililitros. Deixe a solução reagir por cinco minutos à temperatura ambiente.

Neste período, o A-P-T-M-S é convertido por hidrólise em um ciol. Em seguida, tocando apenas nas laterais, posicione o carimbo de PDMS com o padrão para cima sobre o porta-substrato do spin coater. Utilize uma pipeta de transferência para cobrir a superfície do padrão com A-P-T-M-S.

Em seguida, aplique por centrifugação a superfície do carimbo com A-P-T-M-S a 3.500 RPM durante 30 segundos. Após remover o carimbo de PDMS da centrífuga, vire-o de cabeça para baixo de modo que o lado com o padrão fique voltado para baixo, coloque uma extremidade do carimbo de PDMS no centro da lâmina de vidro e pressione suavemente para que todo o carimbo entre em contato com a lâmina de vidro por um minuto. Em seguida, remova cuidadosamente o carimbo de PDMS e deixe a lâmina de vidro com o padrão de A-P-T-M-S repousar à temperatura ambiente.

Após 30 minutos, enxágue a superfície com padrão com etanol e seque com um jato de ar. Sonique o carimbo de PDMS por 15 minutos para remover qualquer excesso de A-P-T-M-S. Em seguida, coloque as lâminas sobre uma placa aquecedora por uma hora a 115 graus Celsius para aquecer as superfícies e remover a água em excesso.

Lave com etanol e seque com ar utilizando pinças. Transfira a lâmina com o padrão para uma placa de Petri de vidro. Utilize uma pipeta de transferência para cobrir completamente a lâmina de vidro com uma solução recém-preparada de polietileno glicol ou solução de peg cline, que servirá como uma região não adesiva ao redor dos padrões.

Após uma incubação de 45 minutos a 75 graus Celsius, descarte a solução salina em excesso. Em seguida, segurando a lâmina de vidro com pinças, enxágue a superfície das lâminas de vidro padronizadas com tolueno e, em seguida, novamente com água, secando com um jato de ar. Coloque as lâminas em uma caixa de lâminas umidificada.

Em seguida, coloque a caixa em uma cabine de segurança biológica e ligue a lâmpada UV por uma hora para realizar a irradiação germicida. Prossiga dentro da cabine de segurança biológica a partir deste ponto. Para manter a esterilidade fora do exaustor, prepare uma solução aquosa estéril de HA de um mililitro, consistindo de 10 milimolar.

Um etil três três dimetil amino propil carbodiimida ou EDC cinco milimolar e hidróxi CIN aide e 50 microgramas por mililitro. O EDC marcado com fluoresceína estéril é um agente de reticulação de comprimento zero que reage com grupos carboxila do HA para formar intermediários reativos a aminas. Como este intermediário é suscetível à hidrólise, o NHS é adicionado para aumentar a eficiência da reação do carbodiimida.

Em seguida, aplique alíquotas de 200 microlitros de solução estéril de HA sobre o vidro padronizado até que a área padronizada esteja coberta. Feche a caixa de lâminas para proteger as lâminas da luz. Os substratos padronizados devem permanecer sob a câmara de fluxo sem perturbação por 16 a 24 horas, enquanto a solução de HA interage com o padrão microestruturado de A-P-T-M-S-A, formando uma ligação MI estável entre o intermediário de HA e a amina primária do A-P-T-M-S.

No dia seguinte, utilize uma pipeta de ruptura APA para aspirar a solução de HA. Lave as lâminas com PBS, depois cubra a superfície com BSA 1% em PBS durante uma hora. A superfície está agora pronta para o cultivo celular.

Coloque as superfícies com micropadrões de HA em uma placa de Petri estéril para o cultivo sobre superfícies com micropadrões de HA. Semee suspensões celulares únicas de células cancerígenas com densidades entre 0,4 e uma vez 10 à sexta potência de células cancerígenas por 18,75 centímetros quadrados de superfície de vidro em um mililitro de meio celular, cobrindo cuidadosamente a superfície da lâmina de vidro. Coloque as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, tomando cuidado para que o meio não transborde. A adesão celular deve ocorrer dentro de 24 horas e pode ser observada utilizando um microscópio óptico invertido.

As superfícies de cultivo celular podem ser mantidas por até cinco dias. Em condições padrão de incubadora, troque o meio a cada dois dias. A morfologia e o crescimento celular podem ser observados utilizando um microscópio óptico invertido.

Ensaios celulares adicionais podem então ser aplicados para analisar as respostas à superfície de HA no exemplo mostrado aqui. Superfície com padrão de HA visualizada usando microscópio fluorescente e imagem. A análise da intensidade de fluorescência demonstra a desmobilização do padrão de HA.

As superfícies com padrão micro de HA permitem o estudo das interações de células cancerígenas com HA exógeno. A adesão de células cancerígenas em superfícies com padrão micro de HA é mostrada aqui. Tanto células de carcinoma colorretal quanto de mama aderiram preferencialmente aos fragmentos de HA após 24 horas de cultivo. A imagem de alta resolução utilizando microscopia eletrônica de varredura pode ser usada para analisar as interações de células cultivadas com superfícies imobilizadas com HA.

Neste micrografia eletrônica de varredura, pode-se observar a interação de células de câncer de cólon com HA; uma ampliação maior é mostrada à direita. Células de câncer de mama cultivadas em superfícies de HA são mostradas aqui novamente, com maior ampliação à direita. Esta análise demonstra claramente a presença de protrusões adesivas que aumentam a disseminação das células cancerígenas em microestruturas de HA.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar superfícies microestruturadas de HA e aplicá-las para estudar a resposta de células cancerígenas.