Name: Superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprenda a criar superfícies micropadronizadas com ácido hialurônico para estudar adesão e migração de células de câncer. Este método utiliza fotolitografia padrão e química de carbodiimida para visualizar interações celulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores reconhecem o uso do laboratório de análise de superfície na Universidade Johns Hopkins, financiado, como parte da Pesquisa em Ciências Materiais e Centro de Engenharia através da National Science Foundation. LED é um estagiário e um IGERT National Science Foundation Graduate Fellow. Esta pesquisa foi parcialmente financiado pelo NIH conceder U54CA143868.

1. Fotolitos padrão para micropatterned Fabricação Stamp <ol><li> Enxágüe um wafer de silício novo com etanol e seco com fluxo de ar. Use uma pinça para manusear wafer e prevenir defeitos de superfície durante todo o processo. </li><li> Transferência de wafer para girar aplicador e tampa superfície do wafer com SU-2025 fotorresiste negativo. Cobrir pelo menos 80% de wafer com fotorresiste. Casaco giro por 10 segundos a 600rpm, seguido por 30 segundos a 3000rpm. Devido à fotossensibilidade do fotorresiste, desligar luzes da sala a partir deste ponto em diante. </li><li> Transferência de fotorresiste wafer de silício revestido de chapa quente para "soft-assar" a 95 ° C por 3 minutos. Remover da placa quente e permitir que um minuto para esfriar. </li><li> Coloque uma máscara pré-fabricado com o padrão desejado na parte superior do wafer de silício coberta de fotorresiste e expor à radiação ultravioleta (UV) irradiação (350-450 nm) por 20 segundos. </li><li> Transferência de wafer de silício para a chapa quente para "hard-bake" a 110 ° C por 6 minutos. </li><li> Ligue as luzes e remover wafer de chapa quente. Padrões distintos devem ser visíveis neste momento. </li><li> Lavar cuidadosamente wafer de silício com SU-8 desenvolvedor fotorresiste. Após 3 lavagens com solução de desenvolvedor, lavar com etanol. Se algum resíduo branco está presente, repita enxaguar com solução desenvolvedor fotorresiste, ou simplesmente submergir o wafer em solução desenvolvedor por 2 minutos e proceda novamente com o etanol enxaguar. Lavar com água e ar seco. </li><li> Mix PDMS (polidimetilsiloxano) solução de elastômero e agente de cura em uma proporção de peso de 10:1. Centrifugar a 900rpm por 5 minutos para remover bolhas de ar. </li><li> Lugar padronizados wafer em placa de Petri e despeje sobre PDMS wafer de silício. Se houver bolhas presente, lugar em desicator e vácuo por alguns minutos até que as bolhas desaparecem. </li><li> Cura de noite à temperatura ambiente (RT) para formar um selo elastomérico complementares. Se PDMS não está completamente curada depois de 12 horas, coloque no forno a 60 ° C por 30 minutos. </li><li> Remova cuidadosamente PDMS de wafer de silício. Use um fio da navalha para cortar selo para tamanho desejado. Sonicado em etanol por 15 minutos. Wafers pode ser utilizado várias vezes para criar selos elastoméricos novo. </li></ol> 2. Micropatterning HA <ol><li> Plasma vidro limpo slides por 5 minutos. Coloque todos os slides na câmara de vácuo e por 5 minutos. Em seguida, permitir baixo fluxo de oxigênio para entrar na câmara. Por sua vez limpa plasma por 5 minutos. Retire do limpador de plasma e coloque em um prato de Petri usando uma pinça. </li><li> Durante a limpeza de plasma, sonicate selos PDMS em etanol por 15 minutos. </li><li> Prepare uma nova solução de 3% v / v de 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) em 95% etanol v / v em um tubo de centrífuga de 15 mL. Deixar reagir por 5 minutos em temperatura ambiente para formar um silanol. </li><li> Coloque selo padrão de PDMS-up na rotação coater chuck e cubra a superfície com solução padronizada APTMS. Spincoat a 3500rpm por 30 segundos. Não toque na superfície de selo, somente os lados do carimbo de PDMS. </li><li> Transferir a solução para o plasma APTMS limpas as superfícies de vidro: conjunto de selo voltado para baixo em uma extremidade do lado estampados e desliza delicadamente pressionando PDMS por isso é completamente em contato com a superfície do vidro por 1 minuto. </li><li> Remover PDMS selo suavemente, e permitir lâmina de vidro decorado para incubar no RT por 30 minutos. Enxaguar superfícies com padrões com etanol e ar seco. Sonicate PDMS selo por 15 minutos para remover o excesso APTMS. </li><li> Superfícies de calor no forno ou na chapa quente por 1 hora a 115 ° C. Lavar com álcool etílico e secar com o ar. </li><li> Prepare polietileno glicol fresco (PEG)-silano solução de 20% v / v 2 - [metoxi (polyethyleneoxy) propil] trimetoxissilano em tolueno. Isto irá servir como uma região não-adesiva em torno de padrões. </li><li> Transferência de lâmina de vidro decorado para um prato de vidro Petri e incubar em PEG-silano solução por 45 minutos a 75 ° C em uma chapa quente. Enxágüe com tolueno, água e seca com o ar. </li><li> Esterilizar por 1 hora utilizando irradiação germicida ultravioleta em uma câmara de segurança biológica. Proceder em cabine de segurança biológica a partir deste ponto para a frente para manter a esterilidade. </li><li> Preparar a solução aquosa estéril HA. 10mM de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) 5mM de N-hydroxysuccinimide 50μg / mL fluoresceína marcado HA </li><li> Aplicar a solução para o HA substratos de vidro modelado em condições estéreis, protegidas da luz. Padronizada substratos devem ser perturbado durante 16-24 horas. </li><li> Aspirar off solução HA, lavar com tampão fosfato (PBS), e cobrir a superfície com 1% de albumina bovina sérica (BSA) em PBS por 1 hora. A superfície está pronta para cultura de células. </li></ol> 3. Cultura de células em HA micropatterned Superfícies <ol><li> Expandir MDA-MB-231 células de câncer de mama humano e células LS174T carcinoma colorretal, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Suspensões única semente de células cancerígenas com densidades entre 0,4 e 1x10 2 de superfície de vidro e em HA imobilizado superfícies. Incubar em incubadora umidificada (37 ° C) em atmosferas mantido com 5% de CO 2. Adesão celular deve ocorrer dentro de 24 horas e pode ser observado através do microscópio de luz invertida </li><li> Superfícies de cultura de células pode ser mantida até 5 dias em condições-padrão incubadora. Mudança de mídia todos os dias. Morfologia das células eo crescimento pode ser observado usando microscópio de luz invertida. Ensaios adicionais celular pode ser aplicado para analisar as respostas à superfície HA. </li></ol> 4. Resultados representativos: A química carbodiimida utilizada para imobilizar covalentemente HA para lâminas de vidro APTMS padronizada é mostrado na Figura 1A. EDC é um agente de reticulação de comprimento zero que reage com grupos carboxila HA para formar aminas reativas intermediários. Como este intermediário é suscetível à hidrólise, NHS é adicionado para aumentar a eficiência da reação carbodiimida. Como solução HA interage com APTMS micropadrões, uma forma amida estável vínculo entre HA intermediários e amina primária de ATPMS. Um exemplo de HA superfície modelada visualizada usando um microscópio de fluorescência e uma análise de intensidade de fluorescência ImageJ demonstrar a imobilização de HA padronizadas são mostradas (Figura 1B-C). As superfícies HA micropatterned permitir o estudo das interações das células de câncer com HA expgenous. Ambos MDA-MB-231 de mama humano e do cólon humano LS174t linhas celulares de cancro preferencialmente aderem às regiões micropatterned HA (Figura 2). Imagens de alta resolução usando microscopia eletrônica de varredura pode ser usado para analisar as interações das células em cultura com superfícies HA imobilizada (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 HA superfícies micropatterned (A) Esquema descrevendo o desenvolvimento de superfícies funcionais HA, (B) imagem da fluorescência da fluoresceína (verde) com etiqueta HA superfície micropatterned. (C) mapa de distribuição de pixels 3D usando software ImageJ demonstrando os padrões HA discreta. Barra de escala = 100μm. Modificado a partir do 9 com permissão da Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Adesão celular em superfícies Cancer HA micropatterned. Ambos os dois pontos (A) e mama (B) carcinoma preferencialmente aderiu em manchas HA com 24 horas de cultura. Modificado a partir do 9 com permissão da Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Interação das células cancerosas com HA. (A) de digitalização de imagens de microscopia eletrônica de células de câncer de cólon (A) cultivadas em superfícies HA mostrado em baixa ampliação (esquerda) e alta ampliação (à direita; de quadrados à esquerda) e de células de câncer de mama (B) cultivadas em superfícies HA mostrado na baixa ampliação (esquerda) e alta ampliação (à direita; de quadrados à esquerda).

<ol><li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li>
<li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+%28CD168%29+Form+Complexes+with+ERK1%2C2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li>
<li>Götte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparanase%2C+Hyaluronan%2C+and+CD44+in+Cancers%3A+A+Breast+Carcinoma+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li>
<li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li>
<li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Gazz.+Chim.+Ital%22%5BJournal%5D)">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li>
<li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li>
<li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li>
<li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+%28HA%29+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li>
<li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li>
<li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li>
<li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease%3A+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li>
</ol>

Figura esquemática de vídeo reproduzido com permissão; Direitos Autorais Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. Reconstruindo o nicho de diferenciação das células-tronco embrionárias usando biomateriais. Macromol. Biosci. 2010; 21 de outubro. [Epub ahead of print].

O método apresentado micropatterning HA permite o estudo das interações celulares com HA exógeno. HA é conhecida por desempenhar um papel fundamental na progressão do câncer 1 no entanto tem havido estudos limitados a investigar a interação de células de câncer em duas dimensões superfícies HA padronizadas. Um estudo controlado sobre micropadrões exógenos HA permite a visualização de alta resolução de adesão de células cancerosas, crescimento e migração e pode elucidar ainda mais os fundamentos de câncer. </p...

<table><tbody><tr><td>Fotolito SU-2025</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Desenvolvedor SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropiltrimetoxissilano (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2-[metoxi(polietilenoxi)propil]trimetoxissilano (Peg-silano)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxissuccinimida (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido hialurônico marcado com fluoresceína (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>Reconstituir com 10 ml de água desionizada</td></tr><tr><td>Células de carcinoma de mama MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Células de carcinoma de cólon LS174t</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Invasão e progressão do câncer envolve um fenótipo de células móveis, que está sob regulamentação complexa por fatores de crescimento / citocinas e da matriz extracelular (ECM) componentes dentro do microambiente do tumor. Ácido hialurônico (AH) é um componente ECM estroma que é conhecido para facilitar a progressão do tumor pela invasão melhoria, crescimento e angiogênese 1. Interação da HA com o seu celular CD44 receptor de superfície induz sinalização eventos que promovem o crescimento de células tumorais, sobrevivência e migração, aumentando assim a propagação metastática 2-3. HA é um glicosaminoglicano, aniônicos nonsulfated composto por unidades repetitivas de ácido D-glucurônico e DN-acetilglucosamina. Devido à presença de grupos carboxila e hidroxila em unidades de dissacarídeo repetindo, HA nativa é em grande parte hidrofílica e passíveis de modificações químicas que introduzem grupos sulfato para imobilização photoreative 4-5. Estudos anteriores envolvendo a imobilização de HA em superfícies utilizam o comportamento bioresistant da HA e seu derivado sulfatado para controlar a adesão celular em superfícies 6-7. Nestes estudos de adesão celular ocorre preferencialmente em regiões não-HA padronizadas. Para analisar as interacções celulares com HA exógeno, desenvolvemos padrões superfícies funcionalizadas que permitam um estudo controlado e de alta resolução de visualização das interações de células cancerosas com HA. Utilizamos a impressão microcontact (UCP) para definir padrões discretos regiões de HA em superfícies de vidro. A &quot;tethering&quot; abordagem que se aplica a química carbodiimida ligando para imobilizar o AH foi utilizado 8. Superfícies de vidro foram microcontact impressos com uma aminosilane e reagiu com uma solução de HA de rácios otimizada de EDC e NHS para habilitar imobilização HA em matrizes padronizadas. Incorporando a química carbodiimida com MCP permitiu a imobilização de HA para regiões definidas, criando superfícies adequadas para aplicações em vitro. Ambas as células de câncer de cólon e células de câncer de mama implicitamente interagiram com as superfícies HA micropatterned. Adesão célula cancerosa ocorreu dentro de 24 horas com a proliferação por 48 horas. Utilizando superfícies HA micropatterned, demonstramos que a adesão de células cancerosas ocorre através do receptor CD44 HA. Além disso, as superfícies HA padronizadas eram compatíveis com microscopia eletrônica de varredura (MEV) e resolução de imagem permitiu elevado de câncer de saliências adesivas celular e espalhar sobre os padrões de HA para analisar a motilidade de células cancerosas em HA exógeno.

Uma nova abordagem que permite a resolução de alta análise das interações de células de câncer com ácido hialurônico exógeno (HA) é descrita. Superfícies padronizadas são fabricados através da combinação química carbodiimida e impressão microcontact.

Superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer

A invasão e a progressão do câncer envolvem um fenótipo celular móvel, que está sob regulação complexa por fatores de crescimento/citocinas e matriz extracelular...

A invasão e a progressão do câncer envolvem um fenótipo celular modal, regulado de forma complexa por fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular presentes no microambiente tumoral. O ácido hialurônico ou HA é um componente estromal da matriz extracelular conhecido por facilitar a progressão tumoral, aumentando a invasão, o crescimento e a angiogênese por meio da interação com seu receptor na superfície celular. A ligação do HA ao CD44 induz eventos de sinalização que promovem o crescimento, a sobrevivência e a migração das células tumorais, aumentando assim a disseminação metastática. Este protocolo permite estudar a adesão, a migração e o crescimento de células cancerígenas sobre HA exógeno.A fotolitografia padrão é utilizada para fabricar um carimbo elastomérico com microdesenho, que é então usado para criar uma matriz padronizada de moléculas de aminoselina em substratos de vidro. Em seguida, realiza-se a química de carbodiimida para ligar covalentemente o ácido hialurônico (HA) ao microdesenho de aminoselina. Assim, são criados microdesenhos de HA, sobre os quais células cancerígenas cultivadas podem ser semeadas, permitindo visualizar as interações das células cancerígenas com o ácido hialurônico exógeno por meio de microscopia óptica, técnicas de imagem de alta resolução, como microscopia eletrônica de varredura, ou microscopia por imunofluorescência.O método para criar superfícies de hidroxiapatita com microestrutura apresentado neste artigo em vídeo pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da pesquisa do câncer, como elucidar ainda mais o papel do ácido hialurônico exógeno na progressão do câncer. Para fabricar um carimbo de polimetil metacrilato ou PDMS com microestrutura, que será usado para imprimir lâminas de vidro com HA, comece pegando uma nova pastilha de silício com pinças.Em seguida, sobre a pia do laboratório. Use um frasco lavador para enxaguar a pastilha com etanol e seque com um jato de ar. Desligue as luzes do ambiente.Em seguida, utilizando pin&ccedil;as, transfira a pastilha para um spin coater usando uma pipeta de transfer&ecirc;ncia, cobrindo pelo menos 80% da superf&iacute;cie da pastilha com resist&ecirc;ncia fotogr&aacute;fica negativa SU 2025; fa&ccedil;a o revestimento por centrifuga&ccedil;&atilde;o durante 10 segundos a 600 RPM. Depois, durante 30 segundos a 3000 RPM, transfira a pastilha revestida com a resist&ecirc;ncia fotogr&aacute;fica para uma placa aquecida e realize a pr&eacute;-cura a 95 graus Celsius por tr&ecirc;s minutos. Em seguida, remova-a da placa aquecida e deixe esfriar por um minuto.Coloque uma máscara pré-fabricada com o padrão desejado sobre a pastilha revestida com fotoresina e exponha à radiação UV por 20 segundos. Em seguida, transfira a pastilha para uma placa aquecedora e faça uma cura a quente a 110 graus Celsius por seis minutos.Ligue as luzes e remova a pastilha da placa aquecedora. Neste momento, padrões distintos devem estar visíveis com uma pipeta de transferência. Enxágue cuidadosamente a pastilha com o revelador de fotoresina SU eight após três enxágues com a solução reveladora, depois enxágue com etanol.Se houver qualquer resíduo branco, repita a lavagem com solução reveladora de fotoresina ou simplesmente mergulhe a pastilha na solução reveladora por dois minutos e lave novamente com etanol, enxágue com água e seque com um jato de ar em um barco de soro grande. Misture a solução de elastômero de PDMS e agente de cura na proporção de 10 para um em peso; para a pastilha mostrada aqui, 22 gramas é suficiente. Despeje em um tubo de centrífuga e gire a 900 RPM por cinco minutos.Para remover quaisquer bolhas de ar, coloque a pastilha padronizada em uma placa de Petri de tamanho apropriado. Despeje solução de PDMS suficiente sobre ela para cobrir completamente a pastilha com uma espessura de cerca de um quarto de polegada. Se houver bolhas na superfície da pastilha, coloque-a em um dessecador a vácuo até que desapareçam.Deixe curar durante a noite à temperatura ambiente para formar um carimbo elastomérico complementar. Se o PDMS não estiver completamente curado após 12 horas, coloque a pastilha em uma estufa a 60 graus Celsius por 30 minutos. Remova cuidadosamente o PDMS da pastilha.Em seguida, utilizando uma lâmina, corte o carimbo no tamanho desejado. Coloque o carimbo em um béquer de vidro com etanol, preferencialmente dentro de um suporte plástico, e submeta à sonicação por 15 minutos. As pastilhas podem ser usadas várias vezes para criar novos carimbos elastoméricos destinados a imobilizar covalentemente ha em superfícies de vidro em áreas definidas.Inicie limpando todas as lâminas a serem utilizadas em um limpador de plasma, conforme as instruções no texto acompanhante. Após a limpeza das lâminas de vidro, use pinças para removê-las do limpador de plasma. Coloque as lâminas em uma placa de Petri de plástico e reserve-as para uso posterior.Em seguida, prepare a solução de amino cline para ser aplicada na lâmina de vidro a fim de ligar o ácido hialurônico em um tubo de centrífuga de 15 mililitros de poliestireno. Prepare uma solução fresca de 3% volume por volume de trimetóxi (3-aminopropil) silano ou A-P-T-M-S em etanol 95% volume por volume, perfazendo um volume total de cinco mililitros. Deixe a solução reagir por cinco minutos à temperatura ambiente.Neste período, o A-P-T-M-S é convertido por hidrólise em um ciol. Em seguida, tocando apenas nas laterais, posicione o carimbo de PDMS com o padrão para cima sobre o porta-substrato do spin coater. Utilize uma pipeta de transferência para cobrir a superfície do padrão com A-P-T-M-S.Em seguida, aplique por centrifugação a superfície do carimbo com A-P-T-M-S a 3.500 RPM durante 30 segundos. Após remover o carimbo de PDMS da centrífuga, vire-o de cabeça para baixo de modo que o lado com o padrão fique voltado para baixo, coloque uma extremidade do carimbo de PDMS no centro da lâmina de vidro e pressione suavemente para que todo o carimbo entre em contato com a lâmina de vidro por um minuto. Em seguida, remova cuidadosamente o carimbo de PDMS e deixe a lâmina de vidro com o padrão de A-P-T-M-S repousar à temperatura ambiente.Após 30 minutos, enxágue a superfície com padrão com etanol e seque com um jato de ar. Sonique o carimbo de PDMS por 15 minutos para remover qualquer excesso de A-P-T-M-S. Em seguida, coloque as lâminas sobre uma placa aquecedora por uma hora a 115 graus Celsius para aquecer as superfícies e remover a água em excesso.Lave com etanol e seque com ar utilizando pin&ccedil;as. Transfira a l&acirc;mina com o padr&atilde;o para uma placa de Petri de vidro. Utilize uma pipeta de transfer&ecirc;ncia para cobrir completamente a l&acirc;mina de vidro com uma solu&ccedil;&atilde;o rec&eacute;m-preparada de polietileno glicol ou solu&ccedil;&atilde;o de peg cline, que servir&aacute; como uma regi&atilde;o n&atilde;o adesiva ao redor dos padr&otilde;es.Após uma incubação de 45 minutos a 75 graus Celsius, descarte a solução salina em excesso. Em seguida, segurando a lâmina de vidro com pinças, enxágue a superfície das lâminas de vidro padronizadas com tolueno e, em seguida, novamente com água, secando com um jato de ar. Coloque as lâminas em uma caixa de lâminas umidificada.Em seguida, coloque a caixa em uma cabine de segurança biológica e ligue a lâmpada UV por uma hora para realizar a irradiação germicida. Prossiga dentro da cabine de segurança biológica a partir deste ponto. Para manter a esterilidade fora do exaustor, prepare uma solução aquosa estéril de HA de um mililitro, consistindo de 10 milimolar.Um etil três três dimetil amino propil carbodiimida ou EDC cinco milimolar e hidróxi CIN aide e 50 microgramas por mililitro. O EDC marcado com fluoresceína estéril é um agente de reticulação de comprimento zero que reage com grupos carboxila do HA para formar intermediários reativos a aminas. Como este intermediário é suscetível à hidrólise, o NHS é adicionado para aumentar a eficiência da reação do carbodiimida.Em seguida, aplique alíquotas de 200 microlitros de solução estéril de HA sobre o vidro padronizado até que a área padronizada esteja coberta. Feche a caixa de lâminas para proteger as lâminas da luz. Os substratos padronizados devem permanecer sob a câmara de fluxo sem perturbação por 16 a 24 horas, enquanto a solução de HA interage com o padrão microestruturado de A-P-T-M-S-A, formando uma ligação MI estável entre o intermediário de HA e a amina primária do A-P-T-M-S.No dia seguinte, utilize uma pipeta de ruptura APA para aspirar a solução de HA. Lave as lâminas com PBS, depois cubra a superfície com BSA 1% em PBS durante uma hora. A superfície está agora pronta para o cultivo celular.Coloque as superfícies com micropadrões de HA em uma placa de Petri estéril para o cultivo sobre superfícies com micropadrões de HA. Semee suspensões celulares únicas de células cancerígenas com densidades entre 0,4 e uma vez 10 à sexta potência de células cancerígenas por 18,75 centímetros quadrados de superfície de vidro em um mililitro de meio celular, cobrindo cuidadosamente a superfície da lâmina de vidro. Coloque as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, tomando cuidado para que o meio não transborde. A adesão celular deve ocorrer dentro de 24 horas e pode ser observada utilizando um microscópio óptico invertido.As superfícies de cultivo celular podem ser mantidas por até cinco dias. Em condições padrão de incubadora, troque o meio a cada dois dias. A morfologia e o crescimento celular podem ser observados utilizando um microscópio óptico invertido.Ensaios celulares adicionais podem então ser aplicados para analisar as respostas à superfície de HA no exemplo mostrado aqui. Superfície com padrão de HA visualizada usando microscópio fluorescente e imagem. A análise da intensidade de fluorescência demonstra a desmobilização do padrão de HA.As superfícies com padrão micro de HA permitem o estudo das interações de células cancerígenas com HA exógeno. A adesão de células cancerígenas em superfícies com padrão micro de HA é mostrada aqui. Tanto células de carcinoma colorretal quanto de mama aderiram preferencialmente aos fragmentos de HA após 24 horas de cultivo. A imagem de alta resolução utilizando microscopia eletrônica de varredura pode ser usada para analisar as interações de células cultivadas com superfícies imobilizadas com HA.Neste micrografia eletrônica de varredura, pode-se observar a interação de células de câncer de cólon com HA; uma ampliação maior é mostrada à direita. Células de câncer de mama cultivadas em superfícies de HA são mostradas aqui novamente, com maior ampliação à direita. Esta análise demonstra claramente a presença de protrusões adesivas que aumentam a disseminação das células cancerígenas em microestruturas de HA.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar superfícies microestruturadas de HA e aplicá-las para estudar a resposta de células cancerígenas.

micropatterned-surfaces-to-study-hyaluronic-acid-interactions-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Micropadrões adesivo que normalize arquitetura celular pode ser usado para aumentar a sensibilidade na detecção de efeitos de drogas, melhorar a reprodutibilidade e simplificar a aquisição de imagem e análise automatizada. Essa tecnologia irá beneficiar os ensaios de drogas / siRNA triagem, realizada em apoia a cultura convencional de células e, conseqüentemente, sofrendo de variabilidade célula a célula-excessiva.

Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned

Apresenta-se um protocolo para funcionalizar vidro com manchas proteicas nanométricas rodeado por uma bicamada lipídica fluida. Estes substratos são compatíveis com microscopia óptica avançado e espera-se para servir como plataforma para estudos de adesão celular e de migração.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

Um método para obter a nanopatterns baseada em dendrímeros irregulares que permitem o controle de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico ácido (RGD) densidade de superfície é descrito e aplicado para o estudo da diferenciação celular de adesão e chondrogenic.

Baseado em dendrímeros Nanopatterns desigual de adesividade de superfície de controle localmente: um método para direcionar Chondrogenic diferenciação

Este estudo demonstra a utilidade e a facilidade de medição de extensão quantitativa da membrana celular e sua correlação com capacidade adesiva de células. Como um exemplo representativo, mostramos aqui essa proteína relacionada ao Dickkopf 3 (DKK3) promove aumento lobopodia formação e aderência de célula em carcinoma adrenocortical em vitrode células.

Caracterização de extensões da membrana celular e estudando seus papéis na dinâmica de adesão celular câncer

Aqui nós apresentamos um protocolo para área ampla varredura sonda Nanolitografia habilitado pelo alinhamento iterativo de matrizes de sonda, bem como a utilização de padrões de litografia para estudos de interação da pilha-superfície.

Grande área varredura sonda Nanolitografia facilitada pelo alinhamento automatizado e sua aplicação para fabricação de substrato para estudos de cultura celular

Aqui, apresentamos um protocolo para cultura tridimensional de células de glioblastoma paciente-derivado dentro ortogonalmente sintonizáveis biomateriais projetados para imitar a matriz do cérebro. Essa abordagem fornece uma em vitro, plataforma experimental que mantém muitas características de na vivo glioblastoma células tipicamente perdidas na cultura.

Ácido hialurônico baseado hidrogel para 3-Dimensional cultura de células de Glioblastoma derivado de paciente

Uma placa de imagem baseada em HMCA é apresentada para o desempenho do ensaio de invasão. Este prato facilita a formação de esferoides tridimensional (3D) tumor e a medição da invasão de células de câncer na matriz extracelular (ECM). A quantificação de ensaio de invasão é conseguida análise semiautomático.

Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas

O componente complementar de-de-de-a é uma molécula pró-inflamatória altamente expressa no microambiente tecidual que pode interagir com a matriz extracelular. Aqui, nós descrevemos um método para testar como o-de-de-ácido hialurônico afeta a adesão celular.

Avaliação da interação entre o complemento protéico-de-n-n e ácido hialurônico na promoção da adesão celular

A litografia quase UV e a microscopia de força de tração são combinadas para medir forças celulares em hidrogéis micropatterados. A liberação induzida por luz direcionada de células únicas permite um alto número de medições na mesma amostra.

Controle da adesão celular usando técnicas de padronização de hidrogel para aplicações em microscopia de força de tração

Descrevemos melhorias em um método padrão para medir forças de tração celular, baseado na impressão de microcontatos com uma única etapa de padronização subtrativa de matrizes de pontos de proteínas de matriz extracelular em hidrogéis macios. Este método permite uma fabricação mais simples e consistente dos padrões da ilha, essenciais para controlar a forma do aglomerado celular.

Geração de Padrões para Microscopia de Tração de Micropattern

Apresentamos um método para replicar o microambiente tumoral de glioma na frente invasiva que incorpora fluxo de fluido intersticial. Este modelo é um hidrogel de hialuronano-colágeno I em um inserto de cultura de tecidos onde uma cabeça de pressão de fluido pode ser aplicada. A invasão pode ser quantificada e as células podem ser isoladas ou lisadas.

Um modelo fotopolimerizável de ácido hialurônico-colágeno do microambiente de glioma invasivo com fluxo intersticial

Aprenda a criar superfícies micropadronizadas com ácido hialurônico para estudar adesão e migração de células de câncer. Este método utiliza fotolitografia padrão e química de carbodiimida para visualizar interações celulares.

Superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer

Explorar mais vídeos