Name: A estimulação mecânica de Células-Tronco Usando Strain Uniaxial Cíclico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 12 s
Description: Aprenda a estimulação mecânica de células-tronco usando strain uniaxial cíclico com bioreator customizado. Este método permite investigar a biologia mecânica celular para aplicações em engenharia de tecidos e medicina regenerativa cardiovascular.

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Dia 0 - Esterilização antes do dia de experimento <ol><li> Colocar materiais em tubo de plástico e esterilizar com álcool 70% durante 2 horas: <ul><li> Chambers </li><li> Tampas </li><li> Quadros (todos os 3 peças) </li><li> Parafusos </li><li> Juntas de borracha </li><li> Fórceps </li><li> Tesoura </li><li> Chaves Hex </li></ul></li><li> Membranas limpo com Aquet sabão e água destilada. </li><li> Sonicate membranas em álcool 70% por 10 minutos. </li><li> Coloque as membranas limpa em plástico pratos quadrados. Se utilizando membranas padronizada, garantir que o lado padronizada é a face para cima (álcool de spray em um lado da membrana e prestar atenção para o líquido para executar as ranhuras). </li><li> Deixe membranas cobertas em álcool 70% por 2 horas. </li><li> Luvas de pacote em folha de alumínio para autoclave amanhã de manhã. </li><li> Faça 2% (peso / volume) de solução de gelatina (2g/100mL) em água destilada para autoclave amanhã. </li><li> Após a esterilização duas horas em álcool 70%, coloque todos os materiais de polímeros e membranas (não autoclavável materiais) na capa de UV durante a noite: <ul><li> Chambers </li><li> Tampas </li><li> Quadros (todos os 3 peças) </li><li> Membranas </li></ul></li><li> Pacote de materiais remanescentes na bolsa autoclavável: <ul><li> Parafusos </li><li> Juntas de borracha </li><li> Fórceps </li><li> Tesoura </li><li> Chaves Hex </li></ul></li></ol> Dia 1 - Montagem das câmaras de estiramento <ol><li> Forceps autoclave, tesouras, chaves hex, parafusos, juntas, luvas, e gelatina utilizando autoclave pequena a 240 ° F durante 20 minutos no total </li><li> Remova as membranas de UV e tratar com O 2 plasma (lado modelado para cima) para ~ 1 minuto. </li><li> TC na capa, capa área padronizada de membranas de plasma tratado com gelatina. Casaco de 30 para minutos sob UV. </li><li> Lavar cada membrana com PBS 2X. Após a lavagem 2, deixar alguns PBS nas membranas para mantê-los escorregadios, para facilitar a montagem para as câmaras. (Deve também usar este PBS para lubrificar as juntas para facilitar a montagem). </li><li> Montar membranas em câmaras (usar luvas autoclavado durante a montagem) <ol><li> Ligar as duas principais peças do quadro usando um único parafuso. </li><li> Virar o quadro e coloque uma membrana na parte superior de modo que as faces de gelatina revestido lateral em direção à estrutura (área padrão deve estar no centro). </li><li> Assegurar a membrana para o quadro usando uma junta em cada lado. </li><li> Pressione a juntas de, usando gentil, mesmo pressão, para não rasgar a membrana. </li></ol></li><li> Anexar quadro montado para T-bar. </li><li> Virar o quadro e colocar em câmara de cabeça para baixo. Verso da moldura UV e membrana por 30 minutos </li><li> Vire a moldura novamente, e parafuso em câmaras (sem mudança para câmara de controle, mas para câmara de estiramento, precisa usar dois parafusos para fixar a peça final do quadro para o fundo da câmara, e precisa remover o único parafuso que é segurando as duas peças do quadro juntos). Frente UV por 30 min. Certifique-se que as membranas estejam completamente secas antes de prosseguir para a próxima etapa, ou então a solução da célula pode escapar durante a semeadura. </li><li> Células da semente. Área de 1 = Área da placa de 3 membranas, portanto, use 1 / 3 de uma placa confluentes por membrana. Use 1 mL de solução por célula de membrana. Mais do que 1,5 ml será difícil manter em solução. Coloque solução única célula na área de estampados, e usar a ponta da pipeta para espalhar a solução ao redor. Cubra e deixe câmaras anexar células por 30 minutos RT no capô. </li><li> Mover câmaras para incubadora e vamos anexar células por mais 1 hora. Ter muito cuidado movendo as câmaras de evitar que solução da célula escorregar! As células em que câmara será arruinado se a solução cai neste momento. </li><li> Retorno câmara para capô e adicionar 20 mL de mídia. </li><li> Câmaras lugar em álcool limpo banheira que é coberto com folha de alumínio (também pulverizadas com álcool). Mover câmaras para esticar incubadora (10% CO 2). </li><li> Câmaras de seguro para uma máquina de estiramento. Vamos anexar células mais durante a noite, e começar a esticar no dia seguinte. (Nota: quando colocar câmaras em máquina de esticar, lembre-se de bloquear a máquina na posição &quot;zero&quot; antes de colocar câmaras, e então aperte o elástico em volta das engrenagens Não se esqueça de desbloquear as engrenagens antes de iniciar a máquina.). </li></ol>

<ol><li>Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vacuum-operated+stress-providing+instrument+that+applies+static+or+variable+duration+cyclic+tension+or+compression+to+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro.</a> J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).</li>
<li>Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+equiaxial+and+uniaxial+strain+on+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).</li>
<li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+mechanosensing+by+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).</li>
</ol>

Banes et al. relatada pela primeira vez o uso de um sistema de estimulação mecânica das células in vitro, utilizando um substrato flexível elastomérica para entregar a força mecânica para as células 1. Desde então, muitas variações sobre este projeto ter sido concebido e utilizado. Vários sistemas de estiramento mecânico estão disponíveis comercialmente sob o nome &quot;Flexercell&quot; (FlexCell International Corp), enquanto que alguns laboratórios usam custom-built dispositivos. Neste protocolo de vídeo que descrevemos a config...

Notas sobre a mídia: Estes experimentos estiramento uniaxial são propensos à contaminação devido à complexidade de configuração de biorreatores. Para combater isso, tentamos várias combinações de antibióticos e antifúngicos. O Fungizone 1% normalmente necessário, juntamente com uma combinação de antibióticos. Ou use uma combinação Pen / Strep, ou usar uma combinação de canamicina e gentamicina (mas não tente usar uma combinação / cocktail de três ou mais antibióticos em conjunto, como pode levar a bactérias resistentes a mutante, e também pode ser prejudicial para as células) .

a estimulação mecânica de células-tronco usando strain uniaxial cíclico

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

O papel das forças mecânicas no desenvolvimento e manutenção dos tecidos biológicos é bem documentado, incluindo vários fenômenos mecanicamente regulamentadas, tais como remodelação óssea, hipertrofia muscular, e da plasticidade das células musculares lisas. No entanto, as forças envolvidas são extremamente complexas e difíceis de monitorar e controlar in vivo. Para melhor investigar os efeitos de forças mecânicas sobre as células, nós desenvolvemos um método in vitro para a aplicação de deformação de tração uniaxial cíclicos de células aderentes cultivadas em membranas elásticas. Este método utiliza um biorreator personalizados com um sistema motorizado cam-rotor para aplicar a força desejada. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo passo-a-passo demonstrando como montar os vários componentes de cada &quot;câmara de estiramento&quot;, incluindo, neste caso, uma membrana de silicone com micropatterned topografia para orientar as células com a direção da tensão. Descrevemos também procedimentos para a esterilização das câmaras, a semeadura em células da membrana, trancando a câmara para o biorreator, e ajustando os parâmetros mecânicos (ou seja, magnitude e taxa de deformação). Os procedimentos descritos neste protocolo particular, são específicos para a semeadura de células-tronco mesenquimais em membrana de silicone com 10 mM canais amplo orientado paralelamente à direção de tensão. No entanto, os métodos e materiais apresentados neste sistema são flexíveis o suficiente para acomodar uma série de variações sobre este tema: taxa de deformação, magnitude, duração, tipo de célula, topografia de membrana, revestimento de membrana, etc podem ser adaptados para a aplicação desejada ou resultado. Este é um método robusto para investigar os efeitos da deformação de tração uniaxial aplicada às células in vitro.

É amplamente entendido que forças mecânicas no corpo pode influenciar a diferenciação e proliferação celular. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo demonstrando o uso de um biorreator custom-built para a entrega de deformação de tração uniaxial cíclicos às células-tronco cultivadas em substratos flexíveis micropatterned.

A estimulação mecânica de Células-Tronco Usando Strain Uniaxial Cíclico

O papel das forças mecânicas no desenvolvimento e na manutenção de tecidos biológicos está bem documentado, incluindo diversos processos regulados mecanicamente...

Olá, sou Song Li. Sou professor associado do Departamento de Bioengenharia da UC, Berkeley. E eu sou Kyle Kapinsky. Sou candidato a doutorado também em bioengenharia na UC, Berkeley.E hoje vamos apresentar um protocolo para estimulação mecânica de células-tronco utilizando deformação cíclica UNI axial. A pesquisa em nosso laboratório concentra-se na engenharia de células e tecidos, especialmente no sistema cardiovascular. Estamos interessados na biologia mecânica das células-tronco porque existem algumas aplicações potenciais.Um deles é que desejamos compreender o efeito de fatores mecânicos no desenvolvimento, por exemplo, no desenvolvimento embrionário. E dois, estamos interessados em controlar a diferenciação de células-tronco in vitro ou em reator intestinal. E, em terceiro lugar, nos interessa como as células-tronco respondem aos fatores mecânicos cardiovasculares in vivo, por exemplo, após transplante.Para investigar todas essas coisas, dispomos de um biorreator especialmente projetado no qual podemos semear células em membranas elásticas e, em seguida, esticar essas membranas axialmente por um período definido, com uma deformação específica e uma taxa de deformação determina

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A biossíntese da matriz extracelular cartilaginosa por condrócitos podem ser afectadas pela aplicação de estímulos mecânicos. Este método descreve a técnica de aplicação de dinâmicas tensões compressivas para condrócitos encapsulados em construções em 3D e de avaliação de alterações induzidas no metabolismo dos condrócitos.

A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis

Este manuscrito apresenta uma técnica de aplicar ou libertar forças em células aderentes ou tecidos usando alongamento unidirecional.

Alongamento Células micropatterned num PDMS Membrana

Apresentamos neste artigo uma novela que se estende plataforma que pode ser usada para investigar as respostas das células individuais a complexa deformação mecânica biaxial anisotrópica e quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos.

Uma plataforma Novel Alongamento para Aplicações em Celular e Tecidual mechanobiology

Um novo protocolo de imagem foi desenvolvido usando um atuador mecânico acionado por motor personalizado para permitir a medição de respostas em tempo real à tensão mecânica em células vivas. Relevante para a mecanobiologia, o sistema pode aplicar deformações de até 20%, permitindo imagens quase em tempo real com microscopia de força confocal ou atômica.

Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

Este artigo apresenta uma abordagem simples para fornecer não-contínuo gradientes cepas estáticas em um hidrogel de célula-carregado concêntrico para regular o alinhamento da célula para a engenharia de tecidos.

Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

Aqui nós apresentamos um protocolo para a formação de uma população celular usando estímulos elétricos e mecânicos, emulando a fisiologia cardíaca. Esta estimulação eletromecânica aumenta o potencial de cardiomyogenic das células tratadas e é uma estratégia promissora para mais terapia celular, modelagem de doença e despistagem de drogas.

Estimulação simultânea de elétrica e mecânica para aumentar o potencial de Cardiomyogenic das células

Um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional é um bioreator ideal para diferenciação tenogênica específica de células-tronco derivadas do tendão e formação de neo-tendões.

Aplicando um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional para induzir a diferenciação tenogênica de células-tronco derivadas do tendão

Este artigo descreve um procedimento para produzir iTenócitos gerando células estromais mesenquimais derivadas de iPSC com superexpressão combinada de Scleraxis usando um vetor lentiviral e estiramento uniaxial através de um biorreator 2D.

Geração de itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos via superexpressão combinada de escleraxis e tensão uniaxial 2D

Aqui, apresentamos um dispositivo inovador que aplica formas de onda de deformação isotrópicas e uniaxiais às células, enquanto apoia o cultivo em substratos com rigidez sintonizável e matrizes proteicas personalizáveis. Essa plataforma simples e econômica permite que pesquisadores investiguem como pistas mecânicas regulam a função celular tanto em estudos fundamentais quanto em contextos relevantes para doenças.

Uma plataforma inovadora para alongamento celular in vitro e imagem

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

Aprenda a estimulação mecânica de células-tronco usando strain uniaxial cíclico com bioreator customizado. Este método permite investigar a biologia mecânica celular para aplicações em engenharia de tecidos e medicina regenerativa cardiovascular.

A estimulação mecânica de Células-Tronco Usando Strain Uniaxial Cíclico

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