A estimulação mecânica de Células-Tronco Usando Strain Uniaxial Cíclico

Olá, sou Song Li. Sou professor associado do Departamento de Bioengenharia da UC, Berkeley. E eu sou Kyle Kapinsky. Sou candidato a doutorado também em bioengenharia na UC, Berkeley.

E hoje vamos apresentar um protocolo para estimulação mecânica de células-tronco utilizando deformação cíclica UNI axial. A pesquisa em nosso laboratório concentra-se na engenharia de células e tecidos, especialmente no sistema cardiovascular. Estamos interessados na biologia mecânica das células-tronco porque existem algumas aplicações potenciais.

Um deles é que desejamos compreender o efeito de fatores mecânicos no desenvolvimento, por exemplo, no desenvolvimento embrionário. E dois, estamos interessados em controlar a diferenciação de células-tronco in vitro ou em reator intestinal. E, em terceiro lugar, nos interessa como as células-tronco respondem aos fatores mecânicos cardiovasculares in vivo, por exemplo, após transplante.

Para investigar todas essas coisas, dispomos de um biorreator especialmente projetado no qual podemos semear células em membranas elásticas e, em seguida, esticar essas membranas axialmente por um período definido, com uma deformação específica e uma taxa de deformação determinada. Agora vamos guiá-lo por todos os processos necessários para montar este protocolo. Usando um sabão laboratorial, qualquer detergente serve, aplique sabão em ambos os lados da membrana e esfregue bem, de modo a remover qualquer resíduo ou partícula presente na membrana. Tudo aquilo que possa interferir nas células deve ser removido.

E eu faço isso manualmente. Depois que sinto que ambos os lados foram bem limpos, enxáguo com água mais uma vez. E a partir daí quero garantir que esteja realmente estéril e que removi quaisquer micropartículas.

Então, vou pegar esta membrana e colocá-la em um béquer com álcool a 70%. E apenas deixe isso entrar completamente. A partir daí, você pode pegar o béquer inteiro e colocá-lo em um banho ultrassônico, deixando-o sob sonicação por 10 minutos.

Agora que temos a membrana com micropadrão em um recipiente quadrado, queremos verificar para garantir que o lado com o padrão esteja realmente voltado para nós. Então, vou pegar um frasco com álcool e borrifar levemente o lado superior desta membrana. E você pode ver agora que o líquido está escorrendo e você observa essas ranhuras.

Isso confirma que o lado do padrão está voltado para cima e que está na orientação correta. Agora concluímos o passo de UV noturno e é possível observar todas as câmaras, todas as estruturas das câmaras e as próprias membranas dentro da câmara de fluxo laminar, onde permaneceram sob exposição à radiação UV durante a noite. Este é nosso passo final de esterilização.

Agora, o que eu quero fazer é tratar com plasma todas as membranas e vou retirar uma ou duas membranas por vez, mantendo-as em suas placas estéreis e transportando-as para a máquina de plasma. Agora que a pressão de vácuo foi liberada, posso remover a câmara. E novamente, isso não é completamente estéril, mas vou utilizá-la novamente mais tarde.

Então, trabalhe relativamente rápido para que o plasma permaneça sobre ele, você deve usar pinça. E novamente, isso é muito crítico. Certifique-se de não deixar cair a membrana nem alterar sua orientação.

Então, neste momento, apenas a superfície superior foi tratada com plasma e vou colocá-la de volta na minha placa relativamente estéril com a face tratada com plasma voltada para cima, recolocar a tampa e, em seguida, transportá-la para a câmara de fluxo laminar. Agora que a membrana foi tratada com plasma, vou colocá-la de volta na câmara de fluxo laminar e tratá-la com gelatina a 2%. E isso é peso por volume.

Pode-se observar que a solução ainda se espalha em linha com o padrão. Além disso, é muito hidrofílica, já que foi tratada com plasma. Assim, a solução se espalha ao invés de formar gotículas; se você acidentalmente virar a membrana ao contrário, a solução será absorvida imediatamente e você saberá que está trabalhando no lado errado.

Portanto, certifique-se de que a solução se espalhe uniformemente. Depois de fazer isso com todas as suas membranas, basta fechar a câmara e ligar a radiação UV por 30 minutos. Neste momento, a membrana esteve sob luz UV com gelatina sobre a superfície por meia hora, tempo suficiente para que a gelatina seja absorvida pela superfície.

Neste momento, quero lavar a membrana duas vezes com PBS estéril, e normalmente coloco cerca de 10 mL em um recipiente quadrado, lavando suavemente com a mão, tomando cuidado para evitar tocar a superfície da membrana, e depois aspirar o PBS. Vou repetir esse procedimento mais uma vez, e após a segunda lavagem vou deixar a membrana em PBS, o que ajuda a lubrificá-la, facilitando sua montagem na câmara. Se você deixar a membrana seca, há maior probabilidade de que ela rasgue ou se rompa de alguma forma.

Então, esta é a segunda lavagem. Novamente, aspire uma vez para garantir que toda a gelatina tenha sido removida da membrana. Em seguida, deixe sua membrana em cerca de 10 mililitros de PBS estéril.

E se você estiver trabalhando com mais de uma membrana, repita este processo para cada uma delas. Depois disso, você estará pronto para a montagem. Pegue um dos quadros, que na verdade é composto por duas peças, mas geralmente já vem pré-montado.

Então, uma peça é a peça em T aqui, e a outra peça é parte da estrutura, que vai segurar a própria membrana. Há, portanto, uma segunda peça da estrutura que tem esta aparência. E você pode ver que ela possui um entalhe.

É aí que a junta será inserida para manter a membrana no lugar. A segunda peça possui um segundo entalhe para outra junta, de modo que ela prenda ambos os lados da membrana. Pegue esta peça, coloque-a sobre a estrutura assim, vire a estrutura e pegue um dos parafusos para autoclave.

Insira o parafuso na parte superior; você pode apertá-lo um pouco com a mão primeiro e, em seguida, use uma das chaves Allen para apertá-lo completamente. Neste momento, tenho um quadro montado e a membrana será colocada na parte inferior desta maneira, como se minha mão fosse a membrana. E isso significa que quero o lado que está ou padronizado ou tratado com plasma e tratado com gelatina.

Quero que fique virado para cima dessa maneira. Então, se eu acidentalmente virar ao contrário e o lado da gelatina estiver agora voltado para baixo, isso será um grande problema para o experimento. Portanto, ao montar, quero que o lado com o padrão fique voltado para cima, mas vou montar de cabeça para baixo.

Então, quando eu retirar a membrana, certifique-se de que o lado com o padrão fique voltado para baixo. Pegando uma membrana, lembrando que, neste momento, o lado com o padrão está voltado para cima. Retiro-a do PBS e a coloco sobre a armação assim.

Portanto, ambos os lados estão praticamente iguais neste momento. É aceitável tocar as bordas da membrana com os dedos, mas evite tocar o lado oposto. Agora que a virei deste jeito, o lado com o padrão está voltado para baixo, o que desejo para facilitar a montagem; pegue duas juntas e coloque-as no PBS.

Normalmente, eu movo para frente e para trás. Assim, umedereço toda a junta, o que lubrifica a junta da mesma forma que lubrifiquei a membrana em PBS. Se você usar juntas secas em uma membrana seca, é muito mais provável que algo deslize.

Então, a maneira como começo é puxar um dos lados um pouco mais do que o outro, porque, ao inserir a junta, se eu colocar a junta neste lado, ela vai puxar a membrana nessa direção, fazendo com que o outro lado fique um pouco mais curto. Por isso, comece com uma extremidade um tanto encurtada aqui. Pegue uma junta e coloque-a transversalmente, de modo que fique bem alinhada em ambos os lados.

E aplicando pressão uniforme, pressione para baixo, use seus polegares ou as pontas dos seus polegares, mas não use as unhas neste momento, pois você poderá acidentalmente cortar a membrana e rasgá-la. Assim que inserir, na verdade uso a parte traseira da minha pinça para pressionar para baixo. E novamente, tenha cuidado para não pressionar com muita força ou escorregar e tocar a membrana, pois você poderá acidentalmente cortá-la ou rasgá-la neste momento, e terá que obter uma nova membrana e recomeçar.

Agora um lado já está inserido, mas o outro lado ainda está solto. Vire o conjunto, pegue a outra junta, certifique-se de que está molhada e coloque-a por cima, exatamente como antes. Em seguida, normalmente uso a pinça para segurar a membrana e esticá-la um pouco, pois, se estiver muito frouxa, haverá muita folga na membrana e será impossível visualizar as células.

Então você quer que fique firme, mas não excessivamente esticado, de modo que a membrana não fique alongada. Se houver pré-esticamento, isso afetará o experimento, pois a própria membrana já estará tensionada e você poderá rasgá-la; haverá um leve aumento de tensão ao pressionar a junta para baixo. Neste ponto, a aparência é bem firme.

Está talvez um pouco solto em um lado, mas eu conserto isso em um instante. E novamente, usando uma pressão bem uniforme, simplesmente pressione com as pontas dos polegares ou das pontas dos dedos. E neste momento você pode ver que um lado está bem firme.

É reto por todo o caminho até o outro lado. Há um pouco de folga na membrana bem ali, e ela meio que enrola para cima. Então o que vou fazer é empurrar este lado completamente para dentro, exatamente como antes, fazendo lentamente e de forma uniforme por toda a extensão da junta.

E você pode ver que isso removeu a maior parte da folga. Acabamos de concluir os 30 minutos de UV nas faces traseiras das estruturas e das membranas, e agora queremos virar todas as membranas para que possam ser expostas à UV no lado frontal, de modo que tudo fique completamente estéril. Neste momento, também vamos designar certas câmaras como de estiramento ou controle.

Como você pode ver, eu já identifiquei minhas câmaras, indicando controle, estiramento, controle, estiramento. E as câmaras de estiramento exigem um parafuso adicional. Por isso, coloquei o parafuso extra para a câmara de estiramento em cima da parte inferior da tampa aqui.

Então, basta pegar o suporte e virá-lo. E se for uma câmara de estiramento, isso significa que preciso trocar alguns dos parafusos. Se for uma câmara controle, tudo permanece igual.

E quando esta barra se move para frente e para trás, a própria membrana não é esticada, ela apenas se move junto com a barra. Se eu quiser que a membrana se estique, preciso fixar a segunda parte da estrutura nesta extremidade no fundo da câmara, de modo que fique estacionária. E então, quando a barra se mover apenas nesta parte da estrutura, ela se moverá para frente e para trás.

Para fazer isso, pegue o parafuso adicional e coloque-o no orifício para parafuso nesta parte da estrutura. Use a chave Allen e aperte o parafuso. Não aperte em excesso, porque essas câmaras de poli su uma são um pouco frágeis, então você não quer rachar uma câmara; aperte apenas o suficiente para que essa parte da estrutura não se mova.

Então, uma vez que você fixou o primeiro parafuso, pode desatarraxar este parafuso, que estava mantendo as duas peças do quadro unidas, e tenha cuidado para não deixar o parafuso cair sobre a membrana, pois isso poderia danificar parte da gelatina que você semeou ali. Assim que o parafuso estiver bem solto, retire a chave Allen, segure o parafuso com a pinça e coloque-o no segundo orifício. Em seguida, use novamente a chave Allen para apertar o segundo parafuso.

Assim, uma vez que essa parte da estrutura esteja fixada com os dois parafusos, agora tenho uma câmara montada para estiramento. Quando esta barra se mover para frente e para trás na máquina de estiramento, é possível observar que a própria membrana será esticada. Gosto de realizar esse movimento algumas vezes para garantir que não haja nenhum problema com a minha membrana.

Se por algum motivo houver uma rachadura e então a membrana se romper, agora saberei disso antes do início do experimento e poderei colocar uma membrana diferente. Então, você afasta isso para o lado, pega a próxima e, neste caso, está identificada como uma câmara controle. Portanto, tudo o que preciso fazer com a câmara controle é virá-la.

Agora, quando for colocado na máquina, ele se moverá para frente e para trás sem se esticar. Em seguida, repita o processo para quantas câmaras e membranas você tiver. Cada uma delas é controle de estiramento; depois, feche a tampa e exponha os lados superiores das membranas à radiação UV por 30 minutos.

Então, acabamos de expor todas as câmaras e as faces superiores das estruturas nas membranas à radiação UV por 30 minutos. Agora, tudo está esterilizado e montado, e estamos prontos para semear as células. Neste caso, estou semeando células-tronco mesenquimais e as estou coletando de placas de 10 centímetros.

Portanto, para cada membrana, especialmente se estou usando uma membrana com padrão como neste caso, você pode semear aproximadamente a área quadrada onde está o padrão. Quero semear apenas naquela área padronizada. Se você estiver usando uma membrana sem padrão, ainda assim é desejável semear numa área aproximadamente igual, para não deixar o fluido muito próximo das bordas.

Se o fluido estiver muito próximo das bordas, ele pode derramar e suas células morrerão antes que você consiga realmente semeá-las. E na área em que você está realizando a semeadura, é importante colocar a quantidade apropriada de células. Assim, quando eu realizo o experimento, quero que essa área fique bastante confluente.

Portanto, se eu usar uma placa de 10 centímetros, quero cerca de um terço de uma placa confluente nessa área. E, neste caso, para células-tronco mesenquimais, isso equivale a cerca de 250.000 células. Isso vai variar dependendo do tipo celular utilizado.

Então, já retirei minhas células da placa e as re-suspendi no volume apropriado. E quero colocar um mililitro da solução celular em cada membrana. Neste caso, tenho cerca de 250.000 células-tronco mesenquimais por mililitro de solução.

Então, uso uma pipeta P1000, certificando-me de que a solução esteja adequada. Pipeto para cima e para baixo algumas vezes e retiro um mililitro para a pipeta, e quero garantir que a semeadura ocorra apenas nessa área. Portanto, realizo a semeadura lentamente, utilizando pequenas gotas sobre a área padronizada.

E você pode realmente ver que, como este é um padrão, ele forma pequenas elipses nesta direção, porque está realmente detectando essas ranhuras. Por isso, não são círculos completos. Neste caso, têm formato mais elíptico.

Em seguida, observo toda esta área ao redor, mas sem me aproximar muito das bordas ainda. Não quero ir muito longe e acabar removendo toda a solução da minha pipeta. Depois, uso a pipeta para espalhar a solução ao longo das bordas, tentando não ultrapassá-las.

Não quero nenhuma célula na área não perpassada, e é um pouco difícil alcançar a borda mais próxima a você. Portanto, normalmente giro cuidadosamente este recipiente ao redor e alcanço aquela última borda. E isso deve espalhar as células de maneira bastante uniforme.

E agora todos estão sentados. Mas você quer ter cuidado para não derramar nenhuma das células. Portanto, tenha cuidado para não passar a mão por cima e também para não movê-la muito rapidamente.

Em seguida, eu o retiro do caminho. E quero cobrir isso e apenas levantar as células semeadas na parte superior. Para cobrir, você usa esta tampa, que possui na verdade dois orifícios diferentes.

Há um orifício mais profundo neste lado e um mais raso neste outro lado que permite a entrada de gases. Você deve garantir que o orifício mais profundo esteja alinhado com esta parte em T aqui. Caso contrário, ficará muito apertado se você usar o orifício raso.

Portanto, colocando-o desta forma, isso cobrirá toda a câmara. Em seguida, você deve repetir o processo com todas as câmaras restantes e deixar esse conjunto na câmara de fluxo laminar por 30 minutos, para que as células possam sedimentar no fundo e começar a aderir às membranas. Depois disso, vamos fixar todas as câmaras com fita e transferi-las para a câmara de fluxo laminar ou para o incubador, para que permaneçam por mais uma hora e se fixem completamente nas membranas.

Ok, acabamos de deixar as células em repouso sobre as membranas por meia hora. Agora, quero expor as células a 37 graus e 5% de CO₂, condições que são mantidas dentro do incubador. Portanto, preciso transferir as amostras da cabine para o incubador.

E para fazer isso, você precisa ter certeza de que está sendo extremamente cuidadoso e de que não está inclinando as câmaras em nenhuma direção, caso contrário a solução celular pode escorregar. E basicamente você terá que começar tudo novamente. Agora que as células permaneceram na câmara no incubador por uma hora, as células estão firmemente aderidas à superfície.

Neste momento, retirei a câmara do incubador e a coloquei cuidadosamente de volta na câmara de fluxo laminar, transportando-a com muita cautela, exatamente como antes. Assim, você não derrama nenhum meio do membrana neste ponto. É necessário adicionar 20 mL de meio à câmara de alongamento.

E neste caso, utilizo uma combinação especial de meio porque é ligeiramente suscetível à contaminação; ele foi perfeitamente formulado para impedir a entrada de contaminantes. Estou usando DM mais 10% de FBS mais 1% de penicilina, estreptomicina e, adicionalmente, mais 1% de fungizona apenas para evitar fungos. Pegando 20 mL de meio, vou adicioná-los cuidadosamente à câmara de alongamento.

Pode-se observar que o meio não saiu da própria membrana e foi adicionado à extremidade da câmara aqui, de modo que o meio passe primeiro sob a membrana e depois por cima dela. E faça isso lentamente para não perturbar completamente as células. Em seguida, recoloque a tampa e posicione-a firmemente no lugar.

E neste ponto, você não precisa mais se preocupar em perturbar as células ou deixá-las se soltarem da membrana. Portanto, você pode manipulá-la com um pouco menos de cuidado. Você precisa escolher a quantidade apropriada de tensão.

E o funcionamento dessa máquina se dá por meio de uma roda giratória à qual está preso um braço, e esse braço pode alterar seu comprimento dependendo do encaixe da peça pré-fabricada que você coloca no centro da roda. Assim, quando gira, o braço se move para frente e para trás, o que faz com que esta plataforma também se mova para frente e para trás. E as câmaras estão ligadas a ela.

Então eles também se movem para frente e para trás. Portanto, se eu quiser aplicar uma deformação de 5%, tenho uma peça pré-fabricada com o número cinco, que possui um comprimento pré-calculado específico para posicionar corretamente este braço. Insiro essa peça no centro da roda, conecto o braço, verifico se está firmemente posicionado e aperto utilizando a chave Allen para garantir o fechamento final.

Então, uma vez que tudo esteja devidamente posicionado, na posição zero, tudo estará travado. Agora estamos prontos para colocar as câmaras. Essas são as câmaras que acabei de transportar.

Eles têm as células na parte superior, coloque-as cuidadosamente em uma única posição e certifique-se de que a barra travará no lugar. Você deve garantir que ela seja empurrada nesta direção para que fique travada na posição zero. Não empurre completamente para trás, ou você poderá pré-tensionar a membrana.

Em seguida, fixe-o no lugar com este prendedor aqui para que não se mova. Depois, acione a chave para colocá-lo em funcionamento. Pode-se observar um pequeno salto no início.

Às vezes isso acontece, fica preso, mas normalmente começa a funcionar bastante bem depois disso. E todas as barras estão agora se movendo para frente e para trás a 60 ciclos por segundo. Então, aqui embaixo indica 600.

Na verdade, isso deveria ser 60,0. E você pode alterar a frequência, se desejar. Assim que as células forem realmente submetidas a estresse mecânico em seu sistema, normalmente fazemos isso por cerca de dois a cinco dias, mas você pode fazê-lo por um período mais curto ou mais longo, se quiser.

Uma vez concluído o procedimento e obtido algum tipo de ponto final definido, é possível retirar as câmaras e então utilizar as células presentes nessas membranas para investigar diferentes aspectos. Assim, o que normalmente fazemos é empregar uma variedade de técnicas, incluindo eletroforese em gel 2D e microarranjos. Também analisamos a expressão gênica por meio de PCR ou a expressão proteica por meio de western blotting.

Além de simplesmente lisar as células, você também pode marcá-las diretamente na membrana, buscando talvez a imunofluorescência de proteínas específicas, ou pode inclusive liberar as células da membrana, marcá-las e passá-las por uma máquina de fax. Assim, há muitas coisas diferentes que você pode fazer, muitas coisas diferentes que pode procurar. E, é claro, também existem diferentes variações da máquina, caso deseje usar tipos diferentes de membranas com microdesenhos ou apenas materiais diferentes, revestimentos diferentes, todos os tipos de coisas que você pode fazer para modificar este método.