Dispositivo microfluídicos para Recriando um microambiente do tumor In Vitro

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a fabricação e operação de um dispositivo microfluídico que recria microambientes tumorais in vitro e pode ser usado para testar drogas quimioterápicas. Este é o dispositivo microfluídico. Este dispositivo pode ser útil nas seguintes áreas, fácil teste de drogas quimioterápicas in vitro.

Ele fornece resultados consistentes e precisos para testar o tecido tumoral tridimensional, e este dispositivo fornece uma representação muito precisa do tumor in vivo. Microambientes Os tumores existem em microambientes 3D e a capacidade de testar em um é significativa. A primeira etapa do procedimento é montar o dispositivo, que envolve a fabricação de chip microfluídico usando litografia suave, perfurando furos nas entradas e saídas, colando a uma lâmina de vidro e conectando a tubulação para entrada e saída de fluxo.

Em seguida, os esteróides tumorais multicelulares uniformes são gerados para uso no dispositivo usando o método de gota suspensa. Os esferoides são então introduzidos no dispositivo, seguidos de apoptose, agentes detectores e drogas quimioterápicas. Por fim, é realizada microscopia de lapso de tempo, seguida de estimativa matemática dos coeficientes de difusividade do fármaco para quantificar a capacidade de penetração do agente quimioterápico.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o crescimento do tecido na formação do dispositivo de microambientes heterogêneos dentro do tecido e a difusão do medicamento no tecido por meio do uso de microscopia de fluorescência de lapso de tempo. A penetração limitada de medicamentos contra o câncer em tumores sólidos é uma causa importante de seu fracasso. A maioria dos modelos atuais de teste de drogas contra o câncer não imita a natureza tridimensional dos tumores sólidos.

Desenvolvemos um dispositivo microfluídico que consiste em tecidos tumorais tridimensionais continuamente perfundidos. Este modelo representa com mais precisão a entrega de medicamentos a tumores sólidos e sua depuração sistêmica. Os esteróides tumorais multicelulares são um modelo bem estabelecido de tecidos tumorais tridimensionais.

Neste procedimento, o método de gota suspensa é usado para criar esteróides para uso no dispositivo microfluídico. Este método permite a formação de esteróides consistentes em um curto período de tempo. O teste de drogas quimioterápicas in vitro em tecido tridimensional pode ajudar a rastrear drogas de maneira mais eficiente em comparação com as monocamadas de células.

Misture o PDMS e o agente de cura do elastômero de silício em uma proporção de peso de nove para um. Em seguida, despeje esta mistura sobre o mestre para formar um brilho de quatro milímetros de espessura Degas. Para remover bolhas de ar, cure a 60 graus Celsius por cinco horas.

Descasque o PDMS curado do molde para obter um selo de características de fluxo no elastômero. Em seguida, usando um punção de biópsia de um milímetro e meio montado em uma broca, pressione os orifícios para entradas e saídas. Retire todos os detritos.

Sujeite o lado característico do carimbo e uma lâmina de vidro limpa ao plasma de oxigênio por oito minutos. Em um gravador de plasma de oxigênio, coloque as superfícies tratadas em contato imediatamente para formar uma ligação entre elas. Mantenha o conjunto a 60 graus Celsius em um aquecedor de lâminas por pelo menos cinco horas.

Para fortalecer a ligação, conecte a tubulação de PTFE de 0,032 polegadas de diâmetro interno às entradas e saídas do dispositivo microfluídico. Usando uma interface de conectores de trava de isca macho anexados a conectores de trava de isca fêmea farpada, esses conectores específicos são usados para permitir passar facilmente por eles sem quebrar. Por fim, configure o conjunto de fluxo usando válvulas de corte e um conector Y, monte o dispositivo no microscópio Depois de montar o dispositivo, conecte a tubulação às entradas e saídas apropriadas para concluir a configuração do fluxo.

Conforme mostrado nesta figura, essa configuração permite a facilidade e a versatilidade de empacotar um esferóide no dispositivo ou criar um fluxo de meio através do dispositivo para empacotar. Abra a válvula de entrada de gaxeta VPN e a válvula de saída de gaxeta VP para fora de um tumor. O OID pode então passar pela entrada e fluir para a câmara de cultura, onde o pino nesta câmara manterá o tumor no lugar para o meio de fluxo.

Feche as válvulas de gaxeta e abra a válvula de entrada de fluxo VF para dentro e a válvula de saída de fluxo VF para fora para iniciar a formação de PHE uniforme. Usando o método de gota suspensa, células de gelo de tripsina sob uma capa de cultura. Pegue as células de tripsina resultantes da centrífuga.

Diluir a solução-mãe até à concentração desejada, consultando o quadro um. Em seguida, remova a tampa de uma placa de 48 poços e coloque-a de cabeça para baixo. Em um capuz esterilizado, encha cada poço do prato com um mililitro de água esterilizada.

Para manter a umidade, coloque uma gota de 20 microlitros de solução celular diluída em cada região circular da tampa. Usando uma micropipeta, inverta cuidadosamente a tampa e coloque-a sobre a placa, certificando-se de que as gotas não toquem nas bordas dos poços. Incube a placa a 37 graus Celsius.

Consulte a tabela um para a duração da incubação com base na célula específica usada, um esteróide se formará em cada gota suspensa. Comece esterilizando o dispositivo lavando-o com etanol 70% através da entrada de fluxo. Em seguida, lave cada um dos PBS e, em seguida, o meio de cultura de células tamponado HEPE.

Deixe a seringa média e conecte-a ao tubo. Em seguida, desenhe dois a três esteróides na seringa. Para remover bolhas de ar, coloque a seringa na entrada da embalagem do dispositivo.

Abra a válvula de entrada VPN e feche o VFN, abra a válvula de saída VP e feche o VF fora. Segure a seringa de embalagem na vertical com a agulha apontando para baixo. Observe como o esteróide se acomoda no fundo da seringa no conector de trava de isca da agulha.

Empurre o êmbolo na seringa de gaxeta e observe o PHE entrar na tubulação e fluir para o dispositivo porque apenas a válvula de saída da gaxeta está aberta. Um esteróide entrará na câmara do dispositivo e será retido por postes na parte de trás. Uma vez dentro da câmara, o esferóide S se adapta à forma da câmara e adquire uma geometria retangular.

Feche a válvula de entrada VPN e a válvula de saída VP para fora, monte a seringa de fluxo SF na bomba da seringa. Esta bomba é operada por um computador usando a válvula de entrada aberta VFN da bomba de seringa pro e a válvula de saída VF out. Inicie o fluxo do meio para o dispositivo a três microlitros por minuto.

A incubação do esferóide por 24 horas é seguida pela introdução de agentes detectores de apoptose. Antes de introduzir a apoptose, detecção ou agentes terapêuticos, permita o equilíbrio do esferóide por até 24 horas para estabelecer gradientes de nutrientes e microambientes. Em seguida, desligue a válvula VFN.

Pare a bomba de seringa. Remova a seringa da bomba e substitua-a pela seringa contendo meio com 0.25 microlitros por mil de CASP vermelho brilhante ativo Caspase três marcador. Lave o dispositivo com a solução lavando manualmente 0,7 mililitros através do dispositivo.

Em seguida, monte a seringa na bomba. Reinicie o fluxo e abra a válvula VFN. Durante um período de cinco a oito horas, a fase três do cph ativo vermelho da luva de barril se difundirá no tecido e fluorescerá mais brilhante nas regiões apoptóticas, o agente de detecção de apoptose nessa concentração é mantido em todas as soluções de fluxo subsequentes.

A doxorrubicina é introduzida cinco a oito horas após a introdução dos agentes detectores de apoptose. Este tratamento é eliminado do sistema por lavagem. Para adicionar agentes quimioterápicos, siga o procedimento de detecção de apoptose para introduzir cloridrato de doxorrubicina 10 micromolar.

Em seguida, substitua a seringa de tratamento pela seringa com 0,7 mililitros de meio. Continue o fluxo do agente terapêutico por um período fixo de tempo. Em seguida, desligue a válvula VFN e desligue a bomba de seringa.

Remova a seringa de tratamento da bomba da seringa e substitua pela seringa com 0,7 mililitros de meio. Deixe o fluxo de meio fresco por 24 a 36 horas enquanto monitora continuamente o tecido ao microscópio. Todo o processo de aquisição para microscopia de lapso de tempo foi automatizado usando um script personalizado no laboratório IP, adquirir imagens de luz transmitida e fluorescência do PAX Foid com ampliação de 10 x a cada 30 minutos Para estimativa matemática dos coeficientes de difusividade de drogas, o primeiro passo é gerar perfis de intensidade linear média de fluorescência de docs usando a imagem J. Selecione uma região retangular de interesse, ou ROI abrangendo o tecido na câmara.

Use o comando plot profile para gerar um perfil de intensidades médias em função da distância do canal de fluxo. Repita por até três pontos de tempo diferentes. Em seguida, subtraia a intensidade média de fluorescência de fundo dos perfis de intensidade obtidos e normalize cada perfil usando a intensidade máxima correspondente para obter C em função de X e T. Onde C é a concentração normalizada de doxorrubicina, o valor de C varia entre zero a um.

O próximo passo é avaliar o coeficiente de difusão efetivo de docs dentro de docs de tecido tumoral. A difusão pode ser representada pela seguinte equação onde ERFC é a função de erro complementar. X é a distância do canal para o tecido e T é o tempo após a introdução da doxorrubicina.

Use o esquema iterativo a seguir em cada ponto de tempo considerado. Adivinhe um valor para D.Calcule o lado direito da equação em cada local. X.Calcule a soma dos erros quadrados entre os dois lados, modifique D para minimizar a média residual.

Os valores ótimos de D obtidos em cada momento apontam para estimar o coeficiente de difusão efetivo médio da doxorrubicina no tecido. Os dispositivos microfluídicos forneceram câmaras de cultura opticamente acessíveis de um milímetro por 0,3 milímetro por 0,15 milímetro para o crescimento de tecido tumoral tridimensional. O método de gota suspensa permitiu a rápida formação de PHE tumoral de tamanho e forma consistentes a partir de várias linhagens celulares.

Os PHE foram cultivados com sucesso no dispositivo por até três dias. O crescimento nas câmaras foi associado à modificação reprodutível dos microambientes. Dentro do phe, a apoptose ocorreu menos nas células próximas ao canal de fluxo e mais alto e mais profundo no tecido.

O aparelho foi utilizado para estimar o coeficiente de difusão da doxorrubicina e do tecido tumoral. O valor experimentalmente contaminado concordou com o valor relatado anteriormente no câncer de mama humano ao tentar este procedimento. É importante ser extremamente cauteloso ao manter a esterilidade ao fluir PHE para o dispositivo, pois isso deve ser realizado fora da cultura de células.

Capuz pulveriza seringas e extremidades de tubos com etanol generosamente para garantir a esterilidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve entender o papel da penetração limitada de drogas em tumores. Demonstramos uma técnica para mimetizar a entrega e depuração sistêmica de drogas em tecidos tumorais tridimensionais e quantificar sua penetração.

A eliminação de medicamentos pouco penetrantes simplificará significativamente o processo de desenvolvimento de medicamentos contra o câncer.