Dispositivo microfluídicos para Recriando um microambiente do tumor In Vitro

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a fabricação e o funcionamento de um dispositivo microfluídico que recria microambientes tumorais in vitro e pode ser utilizado para testar medicamentos quimioterápicos. Este é o dispositivo microfluídico. Esse dispositivo pode ser útil nas seguintes áreas: testes simples de medicamentos quimioterápicos in vitro.

Ele fornece resultados consistentes e precisos para testar tecido tumoral tridimensional, e este dispositivo oferece uma representação muito precisa de tumor in vivo. Microambientes tumorais existem em microambientes 3D e a capacidade de testar em um deles é significativa. O primeiro passo do procedimento é montar o dispositivo, o que envolve a fabricação de um chip microfluídico utilizando litografia macia, perfuração de orifícios nas entradas e saídas, ligação a uma lâmina de vidro e conexão de tubos para entrada e saída de fluxo.

Em seguida, os esferoides tumorais multicelulares uniformes são gerados para uso no dispositivo utilizando o método da gota suspensa. Os esferoides são então introduzidos no dispositivo, seguidos por agentes detectores de apoptose e drogas quimioterápicas. Por fim, é realizada microscopia de tempo-lapse, seguida pela estimativa matemática dos coeficientes de difusividade da droga para quantificar a capacidade de penetração do agente quimioterápico.

Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram o crescimento tecidual na formação de microambientes heterogêneos dentro do tecido e a difusão de fármacos no tecido por meio da microscopia de fluorescência com lapso de tempo. A penetração limitada de fármacos anticancerígenos em tumores sólidos é uma causa importante de seu fracasso. A maioria dos modelos atuais de testes de fármacos anticancerígenos não imita a natureza tridimensional dos tumores sólidos.

Desenvolvemos um dispositivo microfluídico composto por tecidos tumorais tridimensionais perfundidos continuamente. Este modelo representa com maior precisão a entrega de fármacos a tumores sólidos e sua eliminação sistêmica. Os esteroides tumorais multicelulares são um modelo bem estabelecido de tecidos tumorais tridimensionais.

Neste procedimento, o método da gota suspensa é utilizado para criar esferoides para uso no dispositivo microfluídico. Este método permite a formação de esferoides consistentes em um curto período de tempo. O teste de fármacos quimioterápicos in vitro em tecidos tridimensionais pode ajudar na triagem de fármacos de maneira mais eficiente em comparação com monocamadas de células.

Misture a PDMS e o agente de cura do elastômero de silício em uma proporção de nove para um em peso. Em seguida, despeje essa mistura sobre o molde para formar uma camada de quatro milímetros de espessura. Para remover bolhas de ar, cure a 60 graus Celsius por cinco horas.

Retire o PDMS curado do molde para obter um carimbo com as características de fluxo no elastômero. Em seguida, utilizando um furador de biópsia de um milímetro e meio acoplado a uma broca, pressione para fazer furos para as entradas e saídas. Remova qualquer resíduo.

Submeta o lado com a estrutura do carimbo e uma lâmina de vidro limpa ao plasma de oxigênio por oito minutos. Em um atacador de plasma de oxigênio, coloque as superfícies tratadas em contato imediato para formar uma ligação entre elas. Mantenha o conjunto a 60 graus Celsius em um aquecedor de lâminas por pelo menos cinco horas.

Para reforçar a ligação, conecte tubos de PTFE com diâmetro interno de 0,032 polegadas às entradas e saídas do dispositivo microfluídico. Utilizando uma interface de conectores macho tipo luva rosqueável acoplados a conectores fêmea com bico, esses conectores específicos permitem a passagem fácil sem rompimento. Por fim, monte a montagem de fluxo utilizando válvulas de fechamento e um conector em Y, fixando o dispositivo no microscópio. Após a fixação do dispositivo, conecte os tubos às entradas e saídas apropriadas para completar a configuração de fluxo.

Como mostrado nesta figura, essa configuração permite a facilidade e versatilidade de acomodar um esferoide no dispositivo ou criar um fluxo de meio através do dispositivo para acomodação. Abra a válvula de entrada de acomodação VPN e a válvula de saída de acomodação VP para fora do tumor. O meio pode então passar pela entrada e fluir para a câmara de cultura, onde o pino nesta câmara manterá o tumor no lugar para permitir a passagem do meio.

Feche as válvulas de empacotamento e abra a válvula de entrada de fluxo VF in e a válvula de saída de fluxo VF out para iniciar a formação de PHE uniforme. Usando o método da gota suspensa, trypsinice as células sob uma capela de cultura. Retire as células de tripsina resultantes do centrífugo.

Dilua a solução estoque até a concentração desejada, consultando a tabela um. Em seguida, remova a tampa de uma placa de 48 poços e coloque-a de cabeça para baixo. Em uma cabine esterilizada, preencha cada poço da placa com um mililitro de água esterilizada.

Para manter a umidade, coloque uma gota de 20 microlitros de solução diluída de células em cada região circular da lamínula. Usando uma micropipeta, inverta cuidadosamente a lamínula e coloque-a sobre a placa, garantindo que as gotas não toquem nas bordas dos poços. Incube a placa a 37 graus Celsius.

Consulte a tabela um para a duração da incubação com base na célula específica utilizada; um esteroide se formará em cada gota suspensa. Comece esterilizando o dispositivo lavando-o com etanol 70% através da entrada de fluxo. Em seguida, realize uma lavagem com PBS e, depois, com meio de cultura celular tamponado com H-E-P-E-S.

Deixe a seringa média, conecte-a ao tubo. Em seguida, aspire dois a três esteroides na torneira da seringa. Para remover bolhas de ar, conecte a seringa à entrada de embalagem do dispositivo.

Abra a válvula de entrada VPN e feche VFN, abra a válvula de saída VP out e feche VF out. Mantenha a seringa de embalagem na posição vertical com a agulha voltada para baixo. Observe enquanto o esteroide se deposita no fundo da seringa, no conector tipo luva do bloqueio da agulha.

Pressione o êmbolo da seringa de empacotamento e observe o PHE entrar no tubo e fluir para o dispositivo, pois somente a válvula de saída de empacotamento está aberta. Um esteroide entrará na câmara do dispositivo e será retido pelos postes na parte traseira. Uma vez dentro da câmara, o esferoide S se adapta ao formato da câmara e assume uma geometria retangular.

Feche a válvula de entrada VPN e a válvula de saída VP, conecte a seringa de fluxo SF à bomba de seringa. Esta bomba é operada por um computador usando o programa Syringe Pump Pro; abra a válvula de entrada VFN e a válvula de saída VF. Inicie o fluxo do meio no dispositivo a três microlitros por minuto.

A incubação do esferoide por 24 horas é seguida pela introdução de agentes detectores de apoptose. Antes de introduzir agentes detectores de apoptose ou agentes terapêuticos, aguarde até 24 horas para permitir o equilíbrio do esferoide, estabelecendo gradientes de nutrientes e microambientes. Em seguida, desligue a válvula VFN.

Interrompa a bomba de seringa. Remova a seringa da bomba e substitua-a pela seringa contendo meio com 0,25 microlitros por mililitro de marcador ativo de Caspase três CASP glow red. Lave o dispositivo com a solução, passando manualmente 0,7 mililitros dela através do dispositivo.

Em seguida, acople a seringa à bomba. Reinicie o fluxo e abra a válvula VFN. Ao longo de um período de cinco a oito horas, a fase ativa CPH do corante vermelho do cask glove difundir-se-á no tecido e fluorescerá mais intensamente em regiões apoptóticas. O agente detectável de apoptose nesta concentração é mantido em todas as soluções de fluxo subsequentes.

A doxorrubicina é introduzida de cinco a oito horas após a introdução dos agentes de detecção de apoptose. Este tratamento é removido do sistema por lavagem. Para adicionar agentes quimioterápicos, siga o procedimento para detecção de apoptose a fim de introduzir 10 micromolar de cloridrato de doxorrubicina.

Em seguida, substitua a seringa do tratamento pela seringa com 0,7 mililitros de meio. Continue o fluxo do agente terapêutico por um período fixo de tempo. Em seguida, feche a válvula VFN e desligue a bomba de seringa.

Remova a seringa de tratamento da bomba de seringa e substitua pela seringa contendo 0,7 mililitros de meio. Permita o fluxo de meio fresco por 24 a 36 horas, monitorando continuamente o tecido sob um microscópio. Todo o processo de aquisição para microscopia com lapso de tempo foi automatizado usando um script personalizado no IP Lab, adquirindo imagens de luz transmitida e de fluorescência do PAX Foid com aumento de 10x a cada 30 minutos. Para a estimativa matemática dos coeficientes de difusividade do fármaco, o primeiro passo é gerar perfis médios de intensidade linear da fluorescência dos docs usando o ImageJ. Selecione uma região retangular de interesse, ou ROI, que englobe o tecido na câmara.

Utilize o comando perfil do gráfico para gerar um perfil das intensidades médias em função da distância do canal de fluxo. Repita para até três pontos de tempo diferentes. Em seguida, subtraia a intensidade média de fluorescência de fundo dos perfis de intensidade obtidos e normalize cada perfil utilizando a intensidade máxima correspondente para obter C como função de X e T. Onde C é a concentração normalizada de doxorrubicina, o valor de C varia entre zero e um.

O próximo passo é avaliar o coeficiente de difusão efetivo de docs no tecido tumoral docs. A difusão pode ser representada pela seguinte equação, em que ERFC é a função de erro complementar. X é a distância no tecido a partir do canal, e T é o tempo após a introdução da doxorrubicina.

Utilize o seguinte esquema iterativo em cada ponto temporal considerado. Estime um valor para D. Calcule o lado direito da equação em cada localização. X. Calcule a soma dos erros quadráticos entre os dois lados e modifique D para minimizar a média dos resíduos.

Os valores ótimos de D obtidos em cada ponto temporal para estimar o coeficiente médio de difusão efetivo da doxorrubicina no tecido. Os dispositivos microfluídicos forneceram câmaras de cultura opticamente acessíveis de um milímetro por 0,3 milímetro por 0,15 milímetro para o crescimento de tecido tumoral tridimensional. O método da gota suspensa permitiu a rápida formação de PEH tumorais de tamanho e forma consistentes a partir de várias linhagens celulares.

PHE foram cultivadas com sucesso no dispositivo por até três dias. O crescimento nas câmaras esteve associado à modificação reprodutível de microambientes. Nas PHE, a apoptose ocorreu menos em células próximas ao canal de fluxo e foi maior e mais profunda no tecido.

O dispositivo foi utilizado para estimar o coeficiente de difusão da doxorubicina e do tecido tumoral. O valor obtido experimentalmente concordou com o valor relatado anteriormente em câncer de mama humano. Ao realizar este procedimento, é importante ter extrema cautela em manter a esterilidade ao fluir PHE no dispositivo, pois o procedimento deve ser realizado fora da cultura celular.

Pulverize generosamente as seringas do capuz e as extremidades dos tubos com etanol para garantir a esterilidade. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender o papel da penetração limitada de fármacos em tumores. Demonstramos uma técnica para simular a administração e a eliminação sistêmica de fármacos em tecidos tumorais tridimensionais e quantificar sua penetração.

Eliminar medicamentos com baixa penetração simplificará significativamente o processo de desenvolvimento de medicamentos contra o câncer.