Name: Avaliação fosforilação oxidativa respirométrico em saponina-fibras cardíacas permeabilizadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprenda a preparar fibras cardíacas permeabilizadas com saponina para avaliar a fosforilação oxidativa mitocondrial por respirometria de alta resolução. Este método permite medir com precisão a função mitocondrial in situ em tecido cardíaco.

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Este estudo foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e Canadá Genoma. JS realiza premiação salário apoio da Heritage Foundation Alberta para a investigação médica, Heart and Stroke Foundation of Canada e da Associação de Diabetes do Canadá. O laboratório gostaria de agradecer a assistência técnica de instrumentos Oroboros durante a aquisição da técnica de fibra saponina permeabilizadas.

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
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<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.</li>
<li>Sena, S., Hu, P., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+signaling+accelerates+cardiac+mitochondrial+dysfunction+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).</li>
<li>Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+oxidative+capacity+and+increased+mitochondrial+uncoupling+impair+myocardial+energetics+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity.</a> Circulation. 112, 2686-2695 (2005).</li>
<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+mitochondrial+respiratory+complexes%3A+a+new+understanding+of+an+old+subject%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject.</a> Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
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<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A saponina técnica das fibras cardíacas permeabilizadas oferece um compromisso único entre in vitro e in vivo de avaliação do consumo de oxigênio mitocondrial OXPHOS. Vantagens desta técnica incluem o aumento da relevância fisiológica em comparação com mitocôndrias isoladas como arquitetura celular é preservada. Enquanto a membrana plasmática é degradado, as estruturas de membrana intracelular, incluindo 12 mitocôndrias, 14, retículo sarcoplasmático 14, miofilamentos eo citoesquel...

<table><tbody><tr><td>Etanol a 100%</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&amp;#8242;sal monopotássico de difosfato diidratado (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino essencialmente livre de ácidos graxos&amp;#8211;gratuito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&amp;#8242;cloreto de trifeniltetrazólio (TTC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atractilosídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Carbonyl cianeto p-(trifluorometoxi) fenilhidrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis-(2-amino&amp;#8211;tiletílico)-N,N,N&amp;#8242;,&amp;#8242;ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Ácido glutâmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>Ácido lactobiônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexaidratado (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Ácido málico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,&amp;rsquo;-Tetrametil-p-fenilenodiamina diidrocloridrato (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cianeto de potássio</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monobásico de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital de sódio</td><td>Ceva Saúde Animal</td><td>1715 138</td><td>Conc. 54,7 mg/ml</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Ácido succínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Rompun</td></tr><tr><td>ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de joalheiro reta</td><td>George Tiemann &amp;& Cia.</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Curva para Ourives</td><td>George Tiemann &amp;& Cia.</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica reta</td><td>George Tiemann &amp;& Cia.</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina Cirúrgica Estéril</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;m Filtros de seringa</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidro</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de poliestireno, 12 poços</td><td>VWR international</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de Placa</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Microbars</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>Balança de Pesagem</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;Seringa Micro Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;Seringa Micro Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;siringa micro de l Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas Squeeze Nalgene</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Pesagem de Poliestireno</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação fosforilação oxidativa respirométrico em saponina-fibras cardíacas permeabilizadas

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigação da função mitocondrial representa um parâmetro importante da fisiologia cardíaca, como as mitocôndrias estão envolvidas no metabolismo energético, estresse oxidativo, apoptose, envelhecimento, Encefalomiopatias mitocondriais e toxicidade de drogas. Diante disso, tecnologias para medir a função mitocondrial cardíaca estão na demanda. Uma técnica que emprega uma abordagem integrativa para medir a função mitocondrial é respirométrico fosforilação oxidativa análise (OXPHOS). O princípio da avaliação OXPHOS respirométrico é centrado em torno de medir a concentração de oxigênio utilizando um eletrodo de Clark. À medida que o feixe de fibras permeabilizadas consome oxigênio a concentração de oxigênio, no declínio câmara fechada. Usando protocolos selecionados substrato inibidor desacoplador-titulação, os elétrons são fornecidos para sites específicos da cadeia de transporte de elétrons, permitindo a avaliação da função mitocondrial. Antes da análise da função mitocondrial respirométrico, mecânica e química técnicas de preparação são utilizados para permeabilizar o sarcolema das fibras musculares. Permeabilização química emprega saponina para seletivamente perfurar a membrana celular, mantendo a arquitetura celular. Este artigo descreve minuciosamente os passos envolvidos na preparação saponina de pele fibras cardíacas para medições de consumo de oxigênio para avaliar OXPHOS mitocondrial. Além disso, solução de problemas conselhos, bem como substratos específicos, inibidores e desacopladores que podem ser usados ​​para determinar a função da mitocôndria em locais específicos da cadeia de transporte de elétrons são fornecidos. Importante, o protocolo descrito podem ser facilmente aplicadas ao tecido cardíaco e esquelético de vários modelos animais e amostras humanas.

Saponina permeabilizadas preparação de fibras em conjunto com a análise de fosforilação oxidativa fornece respirométrico de avaliação integrada da função mitocondrial. Respiração mitocondrial em estados fisiológicos e patológicos pode refletir várias influências regulamentares, incluindo as interações mitocondrial, morfologia e bioquímica.

Avaliação fosforilação oxidativa respirométrico em saponina-fibras cardíacas permeabilizadas

A investigação da função mitocondrial representa um parâmetro importante da fisiologia cardíaca, visto que as mitocôndrias estão envolvidas no metabolismo energético, ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fibras cardíacas permeabilizadas com Saponina para medições polarográficas. Isso é realizado primeiramente removendo o coração do camundongo. O segundo passo do procedimento consiste em preparar mecanicamente feixes de fibras cardíacas contendo no máximo de seis a oito fibras fracamente conectadas.Em seguida, os feixes cardíacos são permeabilizados quimicamente com esponina. Os feixes cardíacos são então lavados para remoção completa da esponina e de quaisquer metabólitos remanescentes. Por fim, podem ser obtidos resultados que revelam informações sobre a fosforilação oxidativa mitocondrial por meio de medições polarográficas.Olá, sou Curtis Huey do laboratório da Dra. Jane Sheer, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade de Calgary. Hoje vamos mostrar um procedimento para preparar fibras cardíacas permeabilizadas com saponina. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para avaliar a fosforilação oxidativa mitocondrial in situ.Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, remova um coração marinho e coloque-o em uma placa de Petri contendo a solução RP sobre gelo. Usando um microscópio de dissecação, remova cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo e/ou gordura.Corte o coração ao meio ao longo do septo e retire 10 a 25 miligramas, em peso úmido, de tecido cortando a partir da superfície endocárdica do ventrículo esquerdo. Certifique-se de que o corte siga a orientação das fibras para minimizar danos mecânicos ao miocárdio. Coloque a amostra dissecada em uma placa de Petri separada contendo a solução RP sobre gelo.Corte o coração em tiras longitudinais ao longo da orientação das fibras, com diâmetro de um a 1,5 milímetros. Encurte as tiras com um bisturi a um comprimento entre dois e quatro milímetros, tomando extremo cuidado e utilizando pinças afiadas. Separe mecanicamente os feixes de fibras.Os feixes finais de fibras devem conter no máximo de seis a oito fibras conectadas por pequenas áreas de contato e pesando entre um e três miligramas de peso úmido. Visualmente, o tecido cardíaco deve mudar da coloração vermelha original para um rosa pálido. Inicie a preparação dos feixes de fibras cardíacas colocando uma placa de 12 poços sobre gelo.Lave as cavidades com solução RP para minimizar a contaminação por cálcio. Adicione três mililitros de solução RP gelada com 50 microgramas por mililitro de esponina a uma das cavidades. Em seguida, transfira os feixes de fibras preparados mecanicamente para a cavidade.Incube os feixes de fibras por 20 minutos com agitação suave sobre gelo. Enxágue um novo poço com a solução mirror five e pipete 10 mililitros de mirror five gelado para o novo poço. Transfira os feixes cardíacos para o poço e incube-os por 10 minutos com agitação suave sobre gelo.Após a incubação, repita o espelho cinco. Lave duas a três vezes com espelho cinco fresco. Transfira os feixes cardíacos para 10 mililitros de espelho cinco gelado a cada vez.As etapas repetidas de lavagem têm como objetivo garantir a remoção da saponina A-T-P-A-D-P e de quaisquer substratos remanescentes dos feixes de fibras imediatamente antes da análise respiratória. Obtenha o peso úmido dos feixes individuais de fibras secando-os sobre uma superfície absorvente com o auxílio de pinça, mantendo a fibra em contato com a superfície por cinco segundos ou até que toda a umidade seja absorvida. Utilizando outra superfície absorvente, remova o excesso de líquido da pinça.Rasgue a escama e coloque o feixe de fibras sobre uma placa de plástico para medição da massa. Transfira o feixe de fibras cardíacas para um novo poço com solução refrigerada próxima a cinco. O feixe de fibras está agora pronto para a avaliação do consumo de oxigênio.As seguintes titulações de validação são realizadas com um gráfico de injeção em titulação de duas câmaras XI. Esses experimentos podem ser realizados como um protocolo individual ou incluídos em um protocolo de titulação, dependendo do objetivo experimental e diagnóstico dos estudos de respirometria. O ERO GRA 2K utilizado aqui pode medir a concentração de oxigênio.O dispositivo está conectado a um computador equipado com o software DAT lab, permitindo que as alterações na concentração de oxigênio sejam registradas como medições em tempo real do consumo de oxigênio durante toda a duração do experimento. Antes de colocar as fibras cardíacas espelhadas nas câmaras do XI enxerto, adicione 2,1 mililitros de mirror five à carcaça das câmaras, que contém os sensores polariográficos de oxigênio ou POS. Quando as câmaras forem fechadas, dois mililitros de mirror five estarão presentes na câmara do XI enxerto.Permita tempo adequado para a saturação com ar e equilibração do espelho cinco a 37 graus Celsius. Após a equilibração, coloque as amostras de fibras cardíacas no espelho cinco contido nas câmaras de enxerto XI agitadas por politiodina. Barras de agitação revestidas com fluoreto.Aumente a concentração de oxigênio nas câmaras GRAT para entre 250 e 550 micromolar com uma seringa cheia de oxigênio. Aguarde de cinco a dez minutos para a estabilização da concentração de oxigênio utilizando uma seringa Hamilton de 10 microlitros. Adicione 10 microlitros de glutamato 2 molar à câmara para uma concentração final de 10 milimolar.Em seguida, utilize uma seringa Hamilton separada para adicionar cinco microlitros de malato 800 milimolar para uma concentração final de dois milimolares na câmara. Esta titulação é usada para determinar a respiração suportada pelo complexo I basal. O fluxo de oxigênio deve estabilizar dentro de aproximadamente cinco minutos após a titulação, permitindo a determinação do consumo de oxigênio no estado dois, que é o consumo de oxigênio.Na ausência de ADP após dois a cinco minutos de consumo estável de oxigênio, utilize uma microseringa Hamilton de 25 microlitros para adicionar 20 microlitros de 500 milimol de ADP, obtendo uma concentração final saturante de cinco milimolares. Essa concentração é usada para atingir mais de 90% de saturação, permitindo a determinação do estado máximo. Três. A respiração mitocondrial através do complexo I permite um tempo adicional de dois a cinco minutos de consumo estável de oxigênio.Em seguida, utilize uma seringa micrográfica Hamilton de 10 microlitros para adicionar cinco microlitros de citocromo C 4 milimolar para uma concentração final de 10 micromolar. A concentração de oxigênio neste ponto é usada para realizar uma análise de controle de qualidade da integridade da membrana mitocondrial externa. Após mais dois a cinco minutos de consumo estável de oxigênio, adicione um microlitro de ACIN 4 miligramas por mililitro para inibir a sintase de TP.Esta etapa de titulação é utilizada para validar a integridade da membrana mitocondrial interna. Após a avaliação oxphos métrica repetida, remova a amostra para determinação do peso seco ou de marcadores mitocondriais. Em seguida, remova o espelho cinco das câmaras de vidro do XI Grat.Lave as câmaras pelo menos três vezes com água destilada. Posteriormente, lave as câmaras pelo menos três vezes com etanol a 100%. Para remover inibidores solúveis em etanol, como oligomicina.Em seguida, realize duas lavagens adicionais com etanol 70%. Então, adicione etanol 70% e deixe-o agir nas câmaras de enxerto XI por 30 minutos para esterilizá-las. Por fim, lave as câmaras contendo o POS pelo menos cinco vezes com água destilada duplamente, sendo o consumo de oxigênio em fibras cardíacas adequadamente preparadas avaliado pelo protocolo de controle de qualidade, conforme demonstrado; a razão de controle respiratório ou RCR representa o acoplamento entre o consumo de oxigênio e a fosforilação oxidativa em preparações de fibras permeabilizadas.A RCR é a taxa de respiração no estado três em relação ao estado dois, ou alternativamente, o estado três sobre o estado quatro; preparações bem acopladas e permeabilizadas que simulam tecidos cardíacos apresentam uma RCR entre três e seis. A titulação de citocromo C é utilizada como validação de um preparo tecidual adequado. O citocromo C é uma proteína localizada no espaço intermembranar da membrana interna mitocondrial.Quando a membrana externa das mitocôndrias está intacta, o citocromo C endógeno permanece no espaço intermembranar e a titulação de citocromo C exógeno tem um efeito desprezível sobre a respiração. Por outro lado, se a membrana externa das mitocôndrias está danificada, o citocromo C endógeno pode ser liberado do espaço intermembranar e inibirá a respiração até a adição de citocromo C exógeno, permitindo a avaliação da influência de estressores patológicos ou experimentais na integridade da membrana externa mitocondrial. A adição de CIN é utilizada para avaliar alterações na respiração de vazamento, que é o consumo de oxigênio que não contribui para a fosforilação. Fibras controle ou selvagens devem ser sensíveis à adição de CIN e apresentar uma redução significativa no fluxo de oxigênio.Um baixo RCR e sensibilidade reduzida à oligomicina, resultando em um fluxo de oxigênio relativamente elevado, indica dano à membrana mitocondrial interna durante o preparo. A ausência de resposta às titulações de desacoplamento com inibidor de substrato, como observado aqui, pode indicar períodos prolongados de incubação de sasin e feixes de fibras esfoladas nas soluções RP e mirror five. Esforços subsequentes devem minimizar os períodos entre a eutanásia do animal e as medições de consumo de oxigênio.Acabamos de mostrar como preparar feixes de fibras cardíacas para medições polarográficas. É importante lembrar que, ao realizar este procedimento, é necessário ter extremo cuidado durante a separação mecânica das fibras cardíacas. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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O protocolo a seguir descreve a preparação e utilização de tampões para a medição quantitativa das taxas de oxidação de glicose e ácidos graxos no coração isolado de rato em funcionamento. Os métodos utilizados para análise da amostra e interpretação dos dados também são discutidos.

Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho

Este trabalho demonstra a viabilidade de uma técnica de espectroscopia de ressonância magnética de fósforo-31 in vivo (31PMRS) para quantificar a capacidade de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) no músculo esquelético humano.

Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir In Vivo Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

Este protocolo descreve calorespirometry, a medição direta e simultânea de dissipação de calor e de respiração, que fornece uma abordagem não-invasiva para avaliar o metabolismo energético. Esta técnica é usada para avaliar a contribuição das vias aeróbias e anaeróbias para utilização de energia, monitorando o fluxo de energia celular total.

Calorespirometry: Uma abordagem poderosa, não-invasiva para investigar o metabolismo energético celular

Aqui nós introduzimos um método para usar um cateter ótico do intra-ventrículo em corações perfundidos para executar a espectroscopia da absorvência através da parede do coração. Os dados obtidos fornecem informações robustas sobre a tensão do oxigênio tecidual, bem como a utilização do substrato e o potencial de membrana simultaneamente com medidas de desempenho cardíaco nesta preparação onipresente.

Cateter de luz de queima lateral intra-cardíaco para monitoramento do metabolismo celular usando espectroscopia de absorvência transmural de corações de mamíferos perfused

Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.

Respirometria de alta resolução para avaliar bioenergésicos em células e tecidos usando respirômetros baseados em câmara e placas

A respirometria de alta resolução acoplada aos sensores de fluorescência determina o consumo mitocondrial de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar as taxas respiratórias mitocondriais e a produção de ROS no nervo ciático permeabilizado.

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Os cavalos têm uma excepcional capacidade de exercício aeróbio, tornando o músculo esquelético equino um tecido importante tanto para o estudo da fisiologia do exercício equino quanto para a fisiologia mitocondrial de mamíferos. Este artigo descreve técnicas para a avaliação abrangente da função mitocondrial no músculo esquelético equino.

Fluor-respirometria de alta resolução do músculo esquelético equino

A análise da função mitocondrial espermática por respirometria de alta resolução permite medir o consumo de oxigênio de espermatozoides que se movem livremente em um sistema de câmara fechada. A técnica pode ser aplicada para medir a respiração em espermatozoides humanos, o que fornece informações sobre as características mitocondriais e integridade dos espermatozoides.

Respirometria de Alta Resolução para Avaliação da Função Mitocondrial em Espermatozoides Humanos

Aqui, descrevemos um método abrangente para medir a fosforilação oxidativa mitocondrial em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas frescas de músculos humanos ou de camundongos. Este método permite a quantificação em tempo real da respiração mitocondrial e a avaliação da preferência de combustível e flexibilidade metabólica, preservando as redes mitocondriais existentes e a integridade da membrana.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para quantificar a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular dos ventrículos adultos ex vivo de peixe-zebra, a fim de caracterizar sua capacidade metabólica oxidativa e glicolítica.

Avaliação da atividade metabólica dos ventrículos inteiros regeneradores de peixe-zebra ex vivo usando um ensaio de fluxo extracelular

Aprenda a preparar fibras cardíacas permeabilizadas com saponina para avaliar a fosforilação oxidativa mitocondrial por respirometria de alta resolução. Este método permite medir com precisão a função mitocondrial in situ em tecido cardíaco.

Avaliação fosforilação oxidativa respirométrico em saponina-fibras cardíacas permeabilizadas

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