Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamp in the Rat Consciente

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a sensibilidade à insulina em ratos conscientes e não restritos. Isso é realizado primeiramente por meio da cateterização da artéria carótida esquerda. Em seguida, a veia jugular direita é cateterizada para garantir resultados ideais.

Os cateteres são lavados diariamente para manter a patência durante um período de recuperação pós-operatória de cinco dias. Em última análise, os resultados podem ser obtidos do clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico, que demonstram as taxas de infusão de glicose em todo o organismo. A principal vantagem dessa técnica é que podem ser obtidas medidas diretas das taxas de captação de glicose em todo o organismo em níveis fisiológicos elevados de insulina.

Os cateteres arteriais e venosos devem ser preparados com antecedência em relação ao procedimento cirúrgico. O cateter deve ter extremidades rombudas, ser preenchido com solução salina heparinizada e ser esterilizado com etanol, com um fio de contenção firmemente fixado a 2,7 ou 3,2 centímetros de uma das extremidades, para cateteres arteriais e venosos, respectivamente. Ratos machos adultos da linhagem Sprague Dawley com peso aproximado de 300 gramas são utilizados neste procedimento.

Registre o peso inicial do animal e utilize esse peso para monitorar o ganho de peso após a cirurgia. Trabalhe em uma área cirúrgica asséptica. Anestesie a rata com 3% de isoflurano colocando-a em uma caixa anestésica.

Transfira o animal para fora da área cirúrgica e prepare o local da incisão removendo o pêlo ao redor do pescoço e dos ombros. Após a remoção do pêlo, coloque o animal em um cone nasal para manter a anestesia com aproximadamente 2% de isoflurano. Fixe o animal à mesa cirúrgica.

Certifique-se de que o rato está completamente anestesiado verificando a presença de reflexos nos pés e/ou nos olhos. Limpe o local da incisão com etanol 70%, seguido por uma limpeza com Betadine e novamente com etanol 70%. O primeiro passo do procedimento é fazer uma pequena incisão mediana vertical a 10 milímetros superior ao esterno.

Use pinças microcirúrgicas curvas para dissecar rombudo o tecido e expor o músculo esternocleidomastoideo esquerdo. Reflita este músculo para revelar aproximadamente um centímetro da artéria carótida esquerda. Coloque as pinças microcirúrgicas sob a artéria carótida para mantê-la no lugar enquanto separa suavemente o tecido conjuntivo.

É importante isolar o nervo vago da artéria sem danificar nem a artéria nem o nervo. Use sutura de seda estéril 4-0 para ligar a extremidade cefálica. Prenda o vaso com pinça microcirúrgica dissecante serrilhada.

Fure o ligado. Termine com um adaptador de coleta múltipla ven eject de calibre 21. Remova o tampão de aço inoxidável do cateter e use um introdutor de cateter estéril para guiá-lo para dentro da artéria.

Use pinças para garantir que o cateter esteja seguro. Parcialmente, solte as pinças de dissecação microcirúrgica, prendendo a artéria e continue a inserir o cateter até a esfera. Neste momento, a ponta do cateter deve estar na curvatura da aorta.

Fixe dois pontos abaixo da conta e um acima, e lave a linha com solução salina heparinizada a 10 unidades por mililitro. Para confirmar que o cateter estará apto para coleta, reconecte a extremidade externa do cateter com um obturador de aço inoxidável. Em seguida, realize dissecação romba do tecido para expor a veia jugular externa direita, isole cuidadosamente a veia e ligue a cefálica.

Finalize com sutura de seda. Puncione a veia com uma veia de calibre 21. Ejetar o adaptador de isca de amostra múltipla.

Remova o plugue de aço inoxidável do cateter e use um introdutor estéril de cateter para inseri-lo até a esfera. Fixe dois pontos abaixo da esfera e um acima. E aspire a linha com solução salina com heparina a 10 unidades por mililitro em gelo.

Para confirmar que o cateter irá coletar a amostra, recoloque a extremidade externa do cateter com um plugue de aço inoxidável usando uma agulha romba de calibre 14 sob a pele e faça uma incisão nas costas entre as escápulas. Em seguida, passe os cateteres através da agulha para que eles saiam pelas costas do rato. Aproximadamente quatro centímetros de cada cateter devem ficar visíveis.

Corte 0,5 centímetro da tubulação médica Tigon S 50 HL e coloque-a ao redor de ambos os cateteres exteriorizados. Fixe com fita azul para veias e vermelha para artérias. Reavalie os cateteres para garantir a patência e, em seguida, lave e preencha com solução salina heparinizada a 150 unidades por mililitro para prevenir coagulação.

Fecham-se todas as incisões com sutura de seda 3-0. Coloque a rata na posição prona em uma gaiola limpa pré-aquecida com alimento facilmente acessível. Assim que a rata recuperar completamente a capacidade de locomoção e alerta, devolva-a à gaiola de origem.

Permita que a rata se recupere por três a cinco dias, monitorando diariamente infecção, dor e alterações de peso. É importante que a perviedade do cateter seja mantida durante todo o estudo. A cada dia após a cirurgia, encha seringas de ponta lisa de um mililitro com solução salina heparinizada a 150 unidades por mililitro e tampe-as com uma agulha romba de calibre 22.

A agulha romba é inserida em 20 centímetros de tubo PE 50 com acoplador de tubo de aço inoxidável 23 gauge na outra extremidade. Certifique-se de remover todas as bolhas de ar da linha. Prenda a linha arterial externada do rato com hemostatos. Logo abaixo da tampa.

Remova a tampa do cateter de aço usando outro par de hemostatos. Insira o acoplador de tubo conectado à seringa na linha arterial e solte os hemostatos que obstruem o cateter arterial externo. Em seguida, aspire o sangue arterial do cateter para dentro da seringa.

Se o cateter não aspirar facilmente, pode ser necessário empurrar muito suavemente uma pequena quantidade de solução através do cateter para desalojar a ponta. Considera-se que o cateter está desobstruído. Quando o sangue atingir a seringa, feche o tubo P 50 próximo à seringa de um mililitro e descarte a seringa.

Substitua por uma nova seringa preenchida com solução salina com heparina gelada. Abra o tubo e, mantendo a nova seringa na posição vertical, toque levemente na nova seringa para desalojar as bolhas de ar para cima e para longe da linha. Injete a solução salina heparinizada até que a linha do cateter esteja limpa e livre de sangue.

Pinça a linha arterial logo abaixo do acoplador do tubo. Remova o conector da seringa da linha do cateter arterial e substitua-o pelo tampão de tubo de aço inoxidável. Solte os hemostatos que estão ocluindo o cateter arterial externado.

Repita este procedimento para a linha venosa. Devido à baixa pressão venosa, a coleta de amostra pode não ser possível. De modo geral, se a solução salina heparinizada puder ser infundida com resistência mínima, é provável que o cateter esteja bem posicionado na veia.

Antes de iniciar o procedimento, os animais devem ser pesados, as soluções preparadas e o equipamento de fixação montado. Após o animal ser pesado e a patência do cateter confirmada, coloque-o em um recipiente pequeno com cama que limite, mas não restrinja, o movimento. Os ratos utilizados neste estudo são mantidos em jejum por pelo menos cinco horas e atendem aos requisitos de ganho de peso pós-operatório. O peso do rato determina a quantidade de insulina necessária aqui.

Quatro mil unidades por quilograma por minuto são administradas a uma taxa de dois microlitros por minuto. Prepare uma solução de dextrose a 50% e certifique-se de que haja quantidade suficiente de ambas as soluções para durar cerca de duas horas; aqui, são utilizadas seringas de três mililitros. Agora você está pronto para montar o aparelho de fixação.

Configure as linhas e as bombas de infusão conforme mostrado aqui. Coloque as seringas de glicose e insulina na bomba de seringa. Prenda as linhas com grampos e permita que a rata relaxe por 30 minutos antes de iniciar o experimento.

Para iniciar o procedimento, colete uma amostra basal de insulina e uma amostra de hematócrito; a coleta de hematócrito garante que o volume sanguíneo seja mantido ao longo do experimento. Geralmente, os níveis de hematócrito não devem cair mais do que 10% do valor inicial. Obtenha uma amostra basal de glicose e determine o nível de glicose a ser fixado.

Aqui, mantemos a glicemia em U ou cinco milimolar. Após cada amostra de sangue, realize uma lavagem da linha arterial com um pequeno volume de solução salina heparinizada a 10 unidades por mililitro para prevenir coagulação. Após determinar o nível de glicose a ser mantido constante, inicie a infusão da solução de insulina.

Registre a glicemia em intervalos de cinco a dez minutos e ajuste a taxa de infusão de glicose conforme necessário até que um estado de equilíbrio seja alcançado. Este processo geralmente é feito por tentativa e erro e pode levar de 30 minutos a mais de duas horas. O nível de glicose necessário para manter a glicemia depende do protocolo experimental.

As espécies e condições presentes para serem consideradas fixadas exigem que três leituras consecutivas caiam dentro de uma faixa definida. Três leituras dentro de aproximadamente um milimolar uma da outra indicam que os níveis de glicose atingiram um estado estável de registro. A taxa de infusão de glicose necessária para manter a glicemia durante um período de 30 minutos pode ter amostras adicionais de sangue obtidas neste intervalo, no mínimo.

Uma segunda amostra de hematócrito de insulina plasmática deve ser coletada assim que o procedimento de clamp for concluído. Os animais podem ser usados para testes adicionais ou eutanasiados, com os tecidos coletados para análises posteriores. Dependendo do animal, as linhas de cateter podem permanecer pérvias por cinco a sete dias quando realizadas corretamente.

O procedimento de clamp pode medir a sensibilidade à insulina em estado estacionário. É essencial registrar os níveis de insulina e glicose, bem como as taxas de infusão de glicose e os valores de hematócrito. O estado estacionário é atingido quando os níveis de glicose permanecem dentro de um milimolar um do outro ao longo de um período de 30 minutos.

A taxa de infusão de glicose revela o nível de glicose exógena necessário para manter a glicemia em U, sendo que a taxa possível deve ser representada graficamente ao longo do tempo, em vez de um único ponto médio. Os níveis de insulina em jejum e durante o clamp devem ser relatados. Essas medidas confirmam que a insulina foi administrada com sucesso e detectarão quaisquer diferenças na resposta à insulina entre os grupos experimentais. A medição dos níveis de hematócrito na linha de base e novamente após o procedimento assegura que os níveis não tenham caído mais de 5% em relação à linha de base ao longo do experimento. Após este procedimento.

Outros métodos, como a administração de traçadores isotópicos, podem ser utilizados para avaliar a utilização de glicose em todo o corpo e específica por tecido.