Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamp in the Rat Consciente

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a sensibilidade à insulina no rato consciente e desenfreado. Isso é feito primeiro cateterizando, a artéria carótida esquerda. Em seguida, a veia jugular direita é cateterizada para garantir os melhores resultados.

Os cateteres são lavados diariamente para manter a permeabilidade durante um período de recuperação pós-operatória de cinco dias. Em última análise, os resultados podem ser obtidos a partir do clamp glicêmico U hiperinsulinêmico que mostra as taxas de infusão de glicose em todo o corpo. A principal vantagem dessa técnica é que medições diretas das taxas de eliminação de glicose no corpo inteiro podem ser obtidas em altos níveis fisiológicos de insulina.

Os cateteres arteriais e venosos devem ser preparados antes do procedimento cirúrgico. O cateter deve ter extremidades rombas, ser preenchido com solução salina heparinizada e esterilizado com etanol com um batimento de contenção firmemente preso a 2,7 ou 3,2 centímetros de uma extremidade para cateteres arteriais e venosos, respectivamente. Ratos machos adultos de aproximadamente 300 gramas são usados neste procedimento.

Registre o peso inicial do animal e use esse peso para monitorar o ganho de peso pós-operatório. Trabalhando em uma área cirúrgica asséptica. Anestesiar o rato com 3% de flúor, colocando-o em uma caixa anestésica.

Transfira o animal para longe da área cirúrgica e prepare o local da incisão removendo os pelos ao redor do pescoço e ombros. Uma vez removido o pelo, coloque o animal em um cone nasal para manter a anestesia com aproximadamente 2% de flúor. Prenda o animal à mesa cirúrgica.

Certifique-se de que o rato esteja totalmente anestesiado, verificando a presença de reflexos nos pés e/ou olhos. Limpe o local da incisão com etanol a 70%, seguido de uma esfoliação Betadine e seguido novamente de etanol a 70%. O primeiro passo do procedimento é fazer uma pequena incisão vertical na linha média 10 milímetros superior ao esterno.

Use uma pinça de microdissecação curva para dissecar o tecido e expor o músculo mastóideo esternal esquerdo. Reflita esse músculo para revelar aproximadamente um centímetro da artéria carótida esquerda. Coloque uma pinça de microdissecação sob a artéria carótida para mantê-la no lugar enquanto remove suavemente o tecido conjuntivo.

É importante isolar o nervo vago da artéria sem danificar a artéria ou o nervo. Use sutura estéril de seda de quatro oh para ligar a extremidade cefálica. Prenda o vaso com uma pinça de microdissecação serrilhada.

Perfure o ligado. Termine com um adaptador de isca de amostra multis de ejeção de ven de 21 gauge. Remova o tampão de aço inoxidável do cateter e use um introdutor de cateter estéril para guiar para dentro da artéria.

Use uma pinça para garantir que o cateter esteja seguro. Parcialmente. Solte a pinça de microdissecação, apertando a artéria e continue a inserir o cateter até o cordão. Neste ponto, a ponta do cateter deve estar no arco aórtico.

Prenda duas suturas abaixo do cordão e uma acima e lave a linha com 10 unidades por mililitro de solução salina heparinizada. Para confirmar se o cateter irá sample reconecte a extremidade externa do cateter com um plugue de aço inoxidável. Em seguida, dissecar o tecido rombudo Para expor a veia jugular externa direita, isole a veia cuidadosamente e ligue a cefálica.

Termine com sutura de seda. Perfure a veia com uma veia de calibre 21. Ejete o adaptador de isca de amostra multis.

Remova o plugue de aço inoxidável do cateter e use um introdutor de cateter estéril para inseri-lo no cordão. Prenda duas suturas abaixo do cordão e uma acima. E lave a linha com 10 unidades por mililitro de heparina salina.

Para confirmar que o cateter irá amostrar, reconecte a extremidade externa do cateter com um tampão de aço inoxidável usando um túnel de agulha romba de calibre 14 sob a pele e faça uma incisão nas costas entre as omoplatas. Em seguida, passe os cateteres pela agulha para que saiam da parte de trás do rato. Aproximadamente quatro centímetros de cada cateter devem ser visíveis.

Corte 0,5 centímetros de tubo médico Tigon S 50 HL e coloque-o ao redor de ambos os cateteres exteriorizados. Prenda com fita azul para veias e vermelha para artérias. Teste novamente os cateteres para garantir a permeabilidade e, em seguida, lave e encha com 150 unidades por mililitro de solução salina heparinizada para evitar a coagulação.

Feche todas as incisões com três suturas de seda. Coloque o rato em decúbito ventral em uma gaiola limpa pré-avisada com alimentos facilmente acessíveis. Assim que o rato recuperar a capacidade ambulatória e o estado de alerta completos, devolva-o à gaiola de origem.

Permita que o rato se recupere por três a cinco dias, monitorando diariamente a infecção, a dor e as mudanças de peso. É importante que a permeabilidade do cateter seja mantida durante todo o estudo. A cada dia após a cirurgia, encha as seringas de ponta deslizante de um mililitro com 150 unidades por mililitro de solução salina heparinizada e cubra-as com uma agulha romba de calibre 22

A agulha romba é inserida em 20 centímetros de tubulação PE 50 com acoplador de tubulação de aço inoxidável de calibre 23 na outra extremidade. Certifique-se de remover todas as bolhas de ar da linha Clamp a linha arterial externalizada do rato com hemostáticos. Logo abaixo do plugue.

Remova o tampão do cateter de aço usando outro par de hemostáticos. Insira o acoplador do tubo conectado à seringa na linha arterial e solte os hemostáticos que ocluem o cateter arterial externalizado. Em seguida, aspire o sangue arterial do cateter para a seringa.

Se o cateter não puxar facilmente, pode ser necessário empurrar suavemente uma pequena quantidade de solução através do cateter para desalojar a ponta. O cateter é considerado limpo. Quando o sangue chegar à seringa, prenda o tubo P 50 perto da seringa de um mililitro e descarte a seringa.

Substitua por uma nova seringa cheia de solução salina gelada de heparina fresca. Un clamp o tubo e, enquanto segura a nova seringa na vertical, mova a nova seringa para desalojar as bolhas de ar para cima e para longe da linha. Injete solução salina heparinizada até que a linha do cateter esteja limpa e livre de sangue.

Prenda a linha arterial logo abaixo do acoplador da tubulação. Remova o conector da seringa da linha do cateter arterial e substitua-o pelo plugue do tubo de aço inoxidável. Libere os hemostáticos ocluindo, o cateter arterial externalizado.

Repita este procedimento para a linha venosa. Devido à baixa pressão venosa, a amostragem pode não ser possível. Em geral, se a solução salina heparinizada puder ser infundida com resistência mínima, é provável que o cateter esteja bem posicionado na veia.

Antes de iniciar o procedimento, os animais devem ser pesados com soluções preparadas e o aparelho de pinça montado Após a pesagem do animal e confirmada a patência do cateter, coloque-o em um pequeno recipiente com cama que limite, mas não restrinja o movimento. Os ratos utilizados neste estudo estão em jejum de pelo menos cinco horas e atenderam aos requisitos de ganho de peso pós-operatório. O peso do rato determina a quantidade de insulina necessária aqui.

Quatro miliunidades por quilograma por minuto são administradas a uma taxa de dois microlitros por minuto. Prepare uma solução de dextrose a 50% e certifique-se de que há o suficiente de ambas as soluções para durar cerca de duas horas aqui, são usadas seringas de três mililitros. Agora você está pronto para montar o aparelho de fixação.

Configure as linhas e bombas de infusão como visto aqui. Coloque as seringas de glicose e insulina na bomba da seringa. Prenda as linhas e deixe o rato relaxar por 30 minutos antes de iniciar o experimento.

Para iniciar o procedimento, pegue uma amostra de insulina basal e hematócrito A amostragem de hematócrito garante que o volume sanguíneo seja mantido durante todo o experimento. Geralmente, os níveis de hematócrito não devem cair mais de 10% do valor inicial. Obtenha uma amostra de glicose basal e determine o nível de glicose a ser clampeado.

Aqui fixamos em U glicemia ou cinco milimolares. Após cada amostra de sangue, lave a linha arterial com um pequeno volume de 10 unidades por mililitro de solução salina heparinizada para evitar a coagulação. Depois de determinar o nível de glicose a ser pinçado, inicie a infusão da solução de insulina.

Registre a glicose no sangue em intervalos de cinco a 10 minutos e ajuste a taxa de infusão de glicose conforme necessário até que um estado estacionário seja alcançado. Geralmente, é um processo de tentativa e erro e pode levar de 30 minutos a mais de duas horas. O nível de glicose necessário para manter a glicemia depende do protocolo experimental.

Espécies e condições presentes para serem consideradas fixas, três leituras consecutivas devem estar dentro de um intervalo definido. Três leituras dentro de aproximadamente um milimolar uma da outra implicam que os níveis de glicose atingiram um registro de estado estacionário. A taxa de infusão de glicose necessária para manter a glicemia por um período de 30 minutos, amostras de sangue adicionais podem ser obtidas durante esse período, no mínimo.

Uma segunda amostra de hematócrito de insulina plasmática deve ser coletada assim que o procedimento de pinça for concluído. Os animais podem ser usados para testes adicionais ou sacrificados em tecidos coletados para análise posterior. Dependendo do animal, as linhas de cateter podem permanecer patentes por cinco a sete dias quando executadas corretamente.

O procedimento de pinça pode medir a sensibilidade à insulina no estado estacionário. É essencial registrar os níveis de insulina e glicose, bem como as taxas de infusão de glicose e os valores de hematócrito. O estado estacionário é alcançado quando os níveis de glicose permanecem dentro de um milimolar um do outro durante um período de 30 minutos.

A taxa de infusão de glicose revela o nível de glicose exógena necessário para manter a glicemia U, onde a taxa possível deve ser enxertada ao longo do tempo, em oposição a um único ponto de tempo médio. Os níveis de insulina em jejum e clampeados devem ser relatados. Essas medidas confirmam que a insulina foi administrada com sucesso e detectarão quaisquer diferenças na resposta à insulina entre os grupos de tratamento medindo os níveis de hematócrito no início do estudo e, novamente, após o procedimento, garantindo que os níveis não tenham caído mais de 5% da linha de base ao longo do experimento Após este procedimento.

Outros métodos, como a administração de traçadores isotópicos, podem ser usados para avaliar a utilização de glicose específica de todo o corpo e tecido.