Name: Dish microtitulação Assay formação de biofilme (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-30T18:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 57 s
Description: Aprenda a ensaio de formação de biofilme em placa de microtitulação com coloração de violeta de cristal. Este método rápido permite análise qualitativa e quantitativa de biofilmes bacterianos e fúngicos.

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Meus agradecimentos a Sherry Kuchma, Pete Newell e Shanks Robert para fornecer as imagens na Figura 1. Este trabalho foi financiado pelo NIH para conceder R01AI083256 GAO

1. O crescimento de um biofilme <ol><li> Crescer uma cultura da Pseudomonas aeruginosa do tipo selvagem ou cepa mutante durante a noite em um meio rico (ou seja, LB) </li><li> Diluir a 1:100 cultura durante a noite em meio fresco para ensaios de biofilme. Um meio de ensaio padrão biofilme de P. aeruginosa é M63 meio mínimo suplementado com sulfato de magnésio, glicose e ácidos casamino (ver quadro). Como um biofilme, promovendo alternativas meio que estimula o crescimento menos planctônicas e biofilme mais robusto, a glicose e ácidos casamino pode ser substituída por arginina como o carbono única e fonte de energia. </li><li> Adicionar 100 mL da diluição por poço em um prato de 96 poços. Para ensaios quantitativos, normalmente usam 4-8 poços replicar para cada tratamento. </li><li> Incubar a placa de microtitulação para 4-24 horas a 37 ° C. </li></ol> 2. Coloração do biofilme <ol><li> Após a incubação, despejar células girando o prato mais e agitação fora do líquido. </li><li> Delicadamente mergulhe a placa em uma banheira pequena de água (ou seja, use o fundo de caixas de pipeta dica para P1000 pipetmen como a banheira). Sacudir a água. Repita este processo uma segunda vez. Este passo ajuda a remover as células solto e componentes de mídia que pode ser manchada na próxima etapa, e reduz significativamente a coloração de fundo. </li><li> Adicionar 125 mL de uma solução 0,1% de cristal violeta em água para cada poço da placa de microtitulação. Usar luvas e um casaco de laboratório ao fazer a solução. Tenha cuidado ao pesando o CV como o pó é higroscópico e prontamente roupas manchas, pele, etc </li><li> Incubar a microplaca em temperatura ambiente por 10-15 min. </li><li> Lavar o prato 3-4 vezes com água por imersão em uma banheira de água, conforme descrito acima, sacudir e secar vigorosamente sobre uma pilha de toalhas de papel para livrar o prato de todas as células em excesso e corante. </li><li> Ligue a placa de microtitulação de cabeça para baixo e seco por algumas horas ou durante a noite. </li><li> Para ensaios qualitativos, os poços podem ser fotografados quando seco. </li></ol> 3. Quantificação do biofilme <ol><li> Adicionar 125 mL de 30% de ácido acético em água a cada poço da placa de microtitulação para solubilizar o CV. </li><li> Incubar a microplaca em temperatura ambiente por 10-15 min. </li><li> Transferência de 125 mL do CV solubilizados a um prato de microtitulação novo fundo plano. </li><li> Quantificar absorbância em leitor de placas a 550 nm usando 30% de ácido acético em água como o branco. </li></ol> 4. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2437/2437fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Mostra um resultado representativo para ensaios de formação de biofilme realizada para Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens e Staphylococcus aureus. (A) Uma visão do lado do bem com um biofilme de P. aeruginosa (8 horas, 37 ° C). (B) Uma visão do lado do bem com um biofilme de P. fluorescens (6 hrs, 30 ° C). (C) Uma visão top-down do biofilme formado por S. aureus em uma placa de microtitulação de fundo plano (dois poços, 24 horas, 37 ° C). P. aeruginosa e P. fluorescens são ambos organismos móveis e formam um biofilme na interface ar-líquido. S. aureus é não-móveis e forma um biofilme no fundo do poço.

<ol><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple%2C+convergent+signalling+pathways%3A+a+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Toole%2C+GA+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Doyle, R. J. , Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426, 306-310 (2003).</li>
<li>Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-component+regulatory+system+regulates+biofilm+maturation+and+type+III+secretion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).</li>
<li>Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SadB+is+required+for+the+transition+from+reversible+to+irreversible+attachment+during+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14.</a> J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).</li>
<li>Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catheter+lock+solutions+influence+staphylococcal+biofilm+formation+on+abiotic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces.</a> Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).</li>
<li>Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+regulation+of+biofilm+formation+and+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14.</a> J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).</li>
<li>Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+reversible+to+irreversible+attachment+during+biofilm+formation+by+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+requires+an+ABC+transporter+and+a+large+secreted+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein.</a> Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).</li>
<li>Mack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transposon+mutants+of+biofilm-producing+Staphylococcus+epidermidis+impaired+in+the+accumulative+phase+of+biofilm+production%3A+genetic+identification+of+a+hexosamine-containing+polysaccharide+intracellular+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin.</a> Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).</li>
<li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces%3A+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li>
<li>Junker, L. M., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este método pode ser modificada para uso com uma grande variedade de espécies microbianas. Micróbios móveis tipicamente aderir às paredes e / ou fundo dos poços, enquanto os não-móveis micróbios normalmente aderir ao fundo dos poços. As condições ideais para a formação de biofilme (ou seja, meio de crescimento, temperatura, tempo de incubação) deve ser determinado empiricamente para cada micróbio. Eu recomendo realizar múltiplas repetições para cada estirpe ou condição (4-8), e incluindo um controle positivo e, se possí...

<table><tbody><tr><td>1 X M63</td><td></td><td></td><td>Prepare como estoque 5X M63 dissolvendo 15 g de KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 35 g de K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; e 10 g de (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; em 1 L de água. Este estoque n&amp;#8211;o precisa ser autoclavado e pode ser armazenado à temperatura ambiente. Dilua o estoque 5X na proporção de 1:5, autoclave, esfrie e então adicione os componentes desejados.</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>Adicione até concentração final de 1 mM. Prepare como estoque 1 M em água e autoclave.</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Adicione até concentração final de 0,2%. Prepare como estoque de 20% em água e autoclave.</td></tr><tr><td>Ácidos casamino</td><td>BD Biosciences</td><td>223050</td><td>Adicione até concentração final de 0,5%. Prepare como estoque de 20% em água e autoclave.</td></tr><tr><td>Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5131</td><td>Adicione até concentração final de 0,4%. Prepare como estoque de 20% em água e esterilize por filtração. Esta fonte alternativa de carbono/energia pode substituir a glicose e os ácidos casamino.</td></tr><tr><td>Placas de microtitulação</td><td>BD Biosciences</td><td>353911</td><td>Falcon 3911, Microtest III, placas de ensaio flexíveis, 96 poços, fundo em U, não estéreis, não tratadas para cultura de tecidos.</td></tr><tr><td>Tampas para placas de microtitulação</td><td>BD Biosciences</td><td>353913</td><td>As tampas podem ser reutilizadas mediante limpeza com etanol a 95% em água.</td></tr><tr><td>Violeta cristal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229641000</td><td>Prepare uma solução a 0,1% em água.</td></tr></tbody></table>

dish microtitulação assay formação de biofilme

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilmes são comunidades de micróbios ligados a superfícies, que podem ser encontrados em ambientes médicos, industrial e natural. Na verdade, a vida em um biofilme, provavelmente, representa o modo predominante de crescimento para os micróbios na maioria dos ambientes. Biofilmes maduros têm algumas características distintas. Micróbios biofilme são normalmente cercados por uma matriz extracelular que fornece estrutura e proteção para a comunidade. Micróbios que crescem em um biofilme também têm uma arquitectura característica geralmente compostas por macrocolonies (contendo milhares de células), rodeadas por canais cheios de líquido. Biofilme-grown micróbios também são notórios por sua resistência a uma gama de agentes antimicrobianos, incluindo antibióticos clinicamente relevantes. O ensaio de microtitulação prato é uma importante ferramenta para o estudo dos estágios iniciais de formação de biofilme, e tem sido aplicado principalmente para o estudo de biofilme bacteriano, embora este ensaio também tem sido usado para estudar a formação de biofilmes de fungos. Porque este ensaio utiliza estática, lote crescimento condições, não permite a formação do biofilme maduro normalmente associados com sistemas de célula de fluxo. No entanto, o ensaio tem sido eficaz na identificação de muitos fatores necessários para o início da formação de biofilme (ie, flagelos, pili, adesinas, enzimas envolvidas na cíclico-di-GMP ligação e metabolismo) e assim como genes envolvidos na produção de polissacarídeo extracelular. Além disso, trabalhos publicados indicam que os biofilmes cultivadas em placas de microtitulação se desenvolvem algumas propriedades de biofilmes maduros, como um antibiótico tolerância e resistência à efetores do sistema imune. Este ensaio prato simples de microtitulação permite a formação de um biofilme na parede e / ou fundo de um prato de microtitulação. A natureza de alto rendimento do ensaio o torna útil para as telas de genética, bem como a formação de biofilme por cepas de testes múltiplos sob várias condições de cultivo. Variantes deste ensaio foram usadas para avaliar a formação de biofilme inicial para uma ampla variedade de micróbios, incluindo mas não limitado a, pseudomonas, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococos, micobactérias e fungos. No protocolo descrito aqui, vamos nos concentrar sobre o uso deste ensaio para estudar a formação de biofilme pelo modelo aeruginosa organismo Pseudomonas. Neste ensaio, a extensão da formação de biofilme é medida usando o corante cristal violeta (CV). No entanto, uma série de outras manchas colorimétrico e metabólicas têm sido relatadas para a quantificação da formação de biofilme utilizando o ensaio de placa de microtitulação. A facilidade, baixo custo e flexibilidade do ensaio de microplaca tornou uma ferramenta fundamental para o estudo de biofilmes.

O ensaio descreve um meio rápido de medir a formação de biofilme no início de bactérias e fungos. Este método utiliza uma placa de microtitulação, como o substrato para formação de biofilme microbiano, e do biofilme é visualizada utilizando cepa cristal violeta. O ensaio fornece tanto um ensaio qualitativo ou quantitativo para a formação de biofilme cedo.

Dish microtitulação Assay formação de biofilme

Biofilmes são comunidades de microrganismos aderidos a superfícies, as quais podem ser encontradas em contextos médicos, industriais e naturais. De fato, a vida em um biofilme...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer e estudar biofilmes em uma placa de microtitulação. Isso é realizado primeiramente adicionando cultura bacteriana a uma placa de 96 poços. Em seguida, a cultura é incubada na temperatura e pelo tempo apropriados, dependendo do microrganismo, para coloração do biofilme.O violeta de cristal é adicionado a cada poço contendo bactérias, seguido pela lavagem das bactérias. Por fim, os poços são fotografados e as bactérias são quantificadas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram o acúmulo e a formação de biofilmes ao longo do tempo por meio da medição do violeta de cristal.A principal vantagem deste método é que permite aos pesquisadores avaliar rapidamente a formação de biofilme em organismos bacterianos e fúngicos. Também pode ser configurado para telas genéticas de alto rendimento ou para identificar novos compostos terapêuticos que inibem a formação de biofilme. Prepare um cultivo noturno de cinco mililitros da cepa selvagem de pseudomonas, aerogen ou cepa mutante.No meio LB, dilua 10 microlitros de cultura em um mililitro de meio mínimo M 63 fresco, suplementado com magnésio, sulfato, glicose e ácidos cassino

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um método simples, rápido e robusto para a formação...

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

Este vídeo demonstra um ensaio para triagem de compostos antimicrobianos que eliminam biofilmes com eficiência usando uma placa de pino. A metodologia monitora o estado metabólico do biofilme após o tratamento com compostos antimicrobianos, facilitando a determinação da concentração mínima de erradicação do biofilme.

Um ensaio de biofilme de placa de Peg para triagem de agentes antibacterianos

O vídeo demonstra um ensaio de aderência em fase sólida para avaliar a formação de biofilme. Em uma placa de vários poços, as bactérias em meios suplementados com sais biliares aderem a superfícies sólidas, formando biofilmes, o que é confirmado por colorimetria por meio de coloração com cristal violeta e tratamento com etanol.

Um ensaio de aderência de fase sólida para avaliar a formação de biofilme

O vídeo mostra um ensaio de dispersão de biofilme usando uma placa de vários poços. O tampão e o tratamento com glicose desmontam o biofilme, liberando bactérias, enquanto os sais biliares induzem o estresse, retendo as bactérias na substância polimérica extracelular protetora. Maior dispersão com tampão e glicose confirma a desmontagem bem-sucedida do biofilme, estimada pela medição das unidades formadoras de colônias.

Detecção de desmontagem de biofilme por meio de um ensaio de dispersão

A maioria das infecções bacterianas produz um biofilme. Em virtude de seu ambiente, as bactérias associadas ao biofilme são frequentemente fenotipicamente resistentes a medicamentos. Novas moléculas antibacterianas que matam bactérias em biofilmes são, portanto, uma alta prioridade. Estabelecemos um ensaio para rastrear rapidamente compostos antimicrobianos que são eficazes na erradicação de biofilmes.

Segmentação de biofilme Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade

Este estudo apresenta o desenvolvimento de metodologias reprodutíveis para estudar inibidores de biofilme e seus efeitos sobre a multicelularidade de Bacillus subtilis.

Metodologias para o estudo<em&gt; B. subtilis</em&gt; Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

As infecções por biofilme mostram alta tolerância à quimioterapia. Nenhum ensaio captura a complexidade dos biofilmes. Em vez disso, são necessários ensaios complementares. Apresentamos uma plataforma de triagem (desenvolvida para S. aureus) que combina ensaios de viabilidade, biomassa e matriz de biofilme. Permite a descoberta de medicamentos anti-biofilme, incluindo a avaliação dos efeitos quimioterápicos a longo prazo.

A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais

Este protocolo permite que o leitor a analisar a formação de biofilme induzida por sais biliares em patógenos entéricos, usando uma abordagem multifacetada para capturar a natureza dinâmica dos biofilmes bacterianos avaliando aderência, formação de matriz extracelular de substâncias poliméricas, e dispersão.

Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

Este protocolo apresenta metodologia para realizar o crescimento de biofilmes e medições de biomassa utilizando dispositivos de placa PCR de poço profundo auto-montados para triagem de biofilme de tampa estática de alta produtividade de 96 bem-equipados.

Geração de maior biomassa de biofilme bacteriano usando dispositivos microplacas de poço profundo pcr-placa

Um protocolo baseado em placa de microtitulação de 96 poços usando um ensaio de redução de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilidade-2H-tetrazólio (XTT) é descrito neste documento, para estudar os efeitos de anticorpos em biofilmes formados por C. tropicalis. Este protocolo in vitro pode ser usado para verificar o efeito de potenciais novos compostos antifúngicos sobre a atividade metabólica de células de espécies de Candida em biofilmes.

Um ensaio de redução solúvel à base de tetrazólio para avaliar o efeito de anticorpos em biofilmes de Candida tropicalis

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