Dish microtitulação Assay formação de biofilme
30 de janeiro de 2011
O ensaio descreve um meio rápido de medir a formação de biofilme no início de bactérias e fungos. Este método utiliza uma placa de microtitulação, como o substrato para formação de biofilme microbiano, e do biofilme é visualizada utilizando cepa cristal violeta. O ensaio fornece tanto um ensaio qualitativo ou quantitativo para a formação de biofilme cedo.
O objetivo geral deste procedimento é estabelecer e estudar biofilmes em uma placa de microtitulação. Isso é realizado primeiramente adicionando cultura bacteriana a uma placa de 96 poços. Em seguida, a cultura é incubada na temperatura e pelo tempo apropriados, dependendo do microrganismo, para coloração do biofilme.
O violeta de cristal é adicionado a cada poço contendo bactérias, seguido pela lavagem das bactérias. Por fim, os poços são fotografados e as bactérias são quantificadas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram o acúmulo e a formação de biofilmes ao longo do tempo por meio da medição do violeta de cristal.
A principal vantagem deste método é que permite aos pesquisadores avaliar rapidamente a formação de biofilme em organismos bacterianos e fúngicos. Também pode ser configurado para telas genéticas de alto rendimento ou para identificar novos compostos terapêuticos que inibem a formação de biofilme. Prepare um cultivo noturno de cinco mililitros da cepa selvagem de pseudomonas, aerogen ou cepa mutante.
No meio LB, dilua 10 microlitros de cultura em um mililitro de meio mínimo M 63 fresco, suplementado com magnésio, sulfato, glicose e ácidos cassino. Em seguida, utilizando uma pipeta, transfira 100 microlitros da cultura diluída para poços separados de uma placa de fundo redondo com 96 poços. Incube a placa a 37 graus Celsius por quatro a 24 horas para permitir o crescimento de biofilme.
Uma vez que os biofilmes tenham se formado, remova a placa do incubador e descarte os sobrenadantes culturais invertendo a placa e agitando para eliminar o líquido. Em seguida, submerja suavemente a placa em um recipiente pequeno com água para remover quaisquer células não ligadas ou componentes do meio que possam causar coloração de fundo. Agite para eliminar a água, seque a placa com papel absorvente e repita a lavagem.
Uma vez que a placa esteja limpa, adicione 125 microlitros por poço de uma solução de violeta cristal a 0,1%. Para corar as células, incube a placa à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos.
Em seguida, lave a placa três ou quatro vezes conforme demonstrado anteriormente. Após a lavagem final, seque bem a placa em uma pilha de toalhas de papel para remover o excesso de líquido, coloque a placa de cabeça para baixo e deixe secar nessa posição por algumas horas. Uma vez seca a placa, as cavidades podem ser fotografadas com uma câmera digital para avaliar a qualidade dos biofilmes.
Como mostrado aqui, bactérias móveis, como Pseudomonas aerogen à esquerda e Pseudomonas fluorescence à direita, tendem a formar biofilmes na região da interface ar-líquido durante o crescimento do biofilme. Em contraste, bactérias de Staphylococcus ora, que são não móveis, formam biofilmes na base das cavidades. Para quantificar os biofilmes, primeiro adicione 125 microlitros de ácido acético a 30% em cada cavidade, incluindo uma cavidade em branco contendo apenas ácido acético, e incube a placa à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos para permitir a solubilização do violeta de cristal retido pelos biofilmes.
Em seguida, transfira 125 microlitros da coloração solubilizada de cada poço para uma nova placa de microtitulação plana de 96 poços. Utilizando um leitor de placas, quantifique a absorbância de cada poço em um comprimento de onda de 550 nanômetros. A concentração de violeta de cristal em cada poço é proporcional ao número de células no biofilme.
Este gráfico mostra uma quantificação da formação e acumulação de biofilme por Pseudomonas fluorescence ao longo do tempo durante a incubação a 37 graus Celsius. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de biofilme em placa de 96 poços, usado em conjunto com outros métodos, como microscopia. Ele pode contribuir significativamente para o nosso entendimento da formação de biofilme.
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Visão Geral
Este ensaio descreve um método rápido para medir a formação inicial de biofilme em bactérias e fungos utilizando uma placa de microtitulação. O biofilme é visualizado com coloração por violeta de cristal, permitindo análises qualitativa e quantitativa.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Pesquisa em biofilmes
- Desenvolvimento de ensaios
Antecedentes
- Os biofilmes são comunidades de microrganismos que aderem a superfícies.
- O estudo da formação de biofilmes é fundamental para compreender o comportamento microbiano.
- O violeta de cristal é um corante comum utilizado para visualizar biofilmes.
- Este método permite uma avaliação rápida do desenvolvimento de biofilmes.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um ensaio confiável para a formação inicial de biofilmes.
- Quantificar o acúmulo de biofilme ao longo do tempo.
- Facilitar o estudo das interações microbianas em biofilmes.
Métodos Utilizados
- Adicione cultura bacteriana a uma placa de microtitulação de 96 poços.
- Incube a cultura na temperatura e no tempo apropriados.
- Adicione violeta cristal para corar o biofilme.
- Lave os poços e fotografe para quantificar a formação de biofilme.
Resultados Principais
- Os resultados mostram o acúmulo de biofilmes ao longo do tempo.
- Dados quantitativos podem ser obtidos a partir de medições de violeta de cristal.
- O ensaio fornece uma visualização clara da formação de biofilme.
Conclusões
- Este método é eficaz para o estudo da formação inicial de biofilmes.
- Pode ser aplicado a diversas espécies bacterianas e fúngicas.
- O ensaio aprimora a compreensão da dinâmica microbiana dos biofilmes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio de formação de biofilme em placa de microtitulação permite uma avaliação rápida e de alto rendimento do desenvolvimento inicial do biofilme, apoiando a validação de alvos na descoberta de agentes antimicrobianos. Ao quantificar o acúmulo de biofilme por meio da coloração com violeta cristal, o método fornece dados quantitativos e reprodutíveis que auxiliam na redução de riscos de candidatos terapêuticos direcionados à adesão microbiana e persistência. Essa abordagem escalonável é aplicável a sistemas bacterianos e fúngicos, facilitando a triagem inicial de compostos que modulam biofilmes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao identificar genes e fatores necessários para o início da formação de biofilmes, como adesinas, pilis e vias do di-GMP cíclico.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio de telas de perda de função em cepas microbianas sob condições padronizadas.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir compostos que inibem a formação inicial de biofilmes daqueles sem efeito.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Prepara sistemas microbianos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes, estabelecendo métricas reprodutíveis de formação de biofilme.
- Valor Operacional: Aborda a padronização de ensaios por meio de etapas padronizadas de incubação, coloração e quantificação utilizando o formato de placa de 96 poços.
- Escalabilidade: Destaca a prontidão para triagem e a reutilização da plataforma em telas genéticas e bibliotecas de compostos em múltiplas linhagens microbianas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância Translacional: Conecta dados da formação inicial de biofilme a perfis fenotípicos de resistência, apoiando a desmistificação mecanicista de compostos antimicrobianos em desenvolvimento.
- Continuidade Pré-clínica: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular a inibição de biofilme in vitro à tolerância frente a antibióticos e efetores imunológicos.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia o desenvolvimento de biomarcadores translacionais por meio de saídas quantificáveis que se correlacionam com fenótipos de tolerância associados ao biofilme.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a otimização do composto líder, especialmente para programas anti-infecciosos que visam a resistência mediada por biofilmes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias de adesão microbiana e formação de biofilmes por meio de perturbações genéticas e químicas.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio por meio da formação padronizada de biofilmes e quantificação com violeta de cristal, permitindo avaliação confiável de compostos.
- Análises: Destaca medições quantitativas de absorbância a 550 nm que permitem comparação da biomassa de biofilmes entre diferentes condições e cepas.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados iniciais de inibição de biofilmes à relevância pré-clínica, modelando mecanismos de tolerância observados em infecções crônicas.
- Reutilização Empresarial: Posiciona o método como uma plataforma de triagem reutilizável para programas antimicrobianos, antifúngicos e antibiofilmes em diversos modelos de patógenos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução mensurável da formação de biofilme após intervenção genética ou farmacológica.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade em formatos de 96 poços para aplicações de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Tomada de decisões mais assertiva sobre avanço ou interrupção no estágio de identificação de compostos líderes, reduzindo falsos positivos por meio da quantificação ortogonal de biofilme.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de compostos com base na inibição dependente da dose da formação inicial de biofilme.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimento microbiológico em técnica estéril, preparação de culturas e manipulação de biofilmes.
- Depende do acesso a leitores de microplacas capazes de medição de absorbância a 550 nm e placas microtituladoras padrão de 96 poços.
- Necessita padronização entre equipes dos tempos de incubação, etapas de lavagem e protocolos de coloração para minimizar a variabilidade entre poços.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a organismos não modelo ou fungos com propriedades de adesão diferentes.
- Inclui limitações práticas, como a incapacidade de modelar arquitetura de biofilme maduro ou fenótipos dependentes de fluxo, conforme observado na fonte.
