Detecção de Metaloproteinases da Matriz Funcional por zimografia

O objetivo geral deste procedimento é detectar a metaloproteína funcional da matriz ais. Isso é obtido primeiro preparando a amostra para zy, adicionando um buffer de carregamento livre de agilidade de agentes redutores. A gelatina, o gel ZY Graham é então carregado com a amostra e deixado escorrer até que o corante de rastreamento atinja o final do gel.

Após a eletroforese, o gel é renaturalizado, desenvolvido, corado e desmanchado. A etapa final do procedimento é escanear o gel para análise de dados. Por fim, podem ser obtidos resultados que mostrem a atividade da metaloproteinase da matriz nas amostras por meio da análise de densidade de banda.

Olá, sou do laboratório da Dra. Kristin mordido no Departamento de Fisiologia Molecular e Biofísica da Faculdade de Medicina LER. Hoje vamos mostrar-lhe um procedimento para detectar matriz metallo Persis por phy. Usamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a matriz Metallo Persis secretada por célula primária cultivada.

Então, vamos estudar. Antes do início deste protocolo, prepare todas as metaloproteinases da matriz ou MMPs adequadamente para manter a função das enzimas. As amostras podem ser usadas imediatamente ou armazenadas a 80 graus Celsius negativos.

Aqui, a MMP dois, também conhecida como gelatiniza A ou colagenase tipo quatro, é usada para demonstrar a visualização da atividade da MP com sinografia. Uma vez preparadas as enzimas MMP, obtenha uma bolsa de gel de gelatina a 10% contendo um gel dentro de um. Enxágue o com água deionizada.

Remova a fita protetora da parte inferior do e o pente da parte superior do gel. Enxágue os poços três vezes com tris glicina. Buffer de execução do SDS.

Coloque o gel em um aparelho de eletroforese de minicélulas, garantindo que o lado menor do esteja voltado para dentro. Trave o gel no lugar com a cunha de tensão do gel. Encha a câmara superior do aparelho com tampão de trisglicina SDS acima do nível dos poços e verifique se há vazamentos.

Encha também a câmara inferior da eletroforese em gel configurada com tampão de corrida. Em seguida, carregue 10 microlitros de marcador molecular de proteína. Misture uma quantidade igual da amostra em um tampão de carregamento de gel, que não contém agentes redutores.

Ao contrário da página SDS normal, não ferva as amostras e, em vez disso, carregue-as diretamente nos poços do gel. Usando pontas de carregamento de gel, esses poços podem conter até 20 microlitros de volume. Coloque a tampa na mini célula e conecte os cabos do eletrodo à fonte de alimentação.

Ligue a fonte de alimentação e configure o gel para funcionar a 125 volts constantes por 90 minutos. Verifique a formação de pequenas bolhas no fio da câmara inferior indicando circulação de corrente ao executar o primeiro gel. Monitore o progresso da migração a cada 15 minutos usando o azul de bromo fenol incluído no buffer de carregamento como um indicador para cada gel.

Prepare 100 mililitros de tampão Rena de grama xmo único e 200 mililitros de tampão de revelação xmo grama, ambos em água deionizada. Quando o corante de rastreamento de azul de bromo fenol atingir o fundo do gel, desligue a fonte de alimentação. Abra a mini célula e remova o gel.

Separe os dois lados do. Usando uma faca de gel, corte um canto para marcar a direção do gel. Remova cuidadosamente o gel do e coloque-o em um recipiente com 100 mililitros de Rena Buffer.

Incube o gel por 30 minutos Em temperatura ambiente com vegetação suave, remova o tampão Rena e adicione 100 mililitros de tampão revelador ao gel. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente com vegetação suave. Em seguida, remova o tampão de revelação e adicione mais 100 mililitros de tampão de revelação fresco ao gel.

Incube o gel durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação durante a noite, remova o tampão de desenvolvimento e lave o gel incubando-o com água deionizada e uma vegetação suave. Por cinco minutos em temperatura ambiente, repita esta lavagem duas vezes.

Coloque o gel em um protetor de folha de plástico e remova as bolhas. Em seguida, escaneie o gel com um scanner fotográfico para salvar o posicionamento exato das bandas padrão da proteína, pois elas se tornarão pouco visíveis. Após a coloração do gel.

Manchar o gel adicionando 20 mililitros de mancha simplesmente azul segura ao gel. Incube o gel por uma hora em temperatura ambiente. Sob agitação suave, remova a mancha segura simplesmente azul e detenha o gel em 100 mililitros de água deionizada em temperatura ambiente sob agitação suave.

Após uma hora, substitua por água fresca deionizada e continue a incubar o gel por pelo menos uma hora. Para analisar os dados usando citometria primeiro remova cuidadosamente o gel da água e coloque-o em um protetor de folha de plástico. Usando um scanner fotográfico, digitalize o gel com uma resolução de 300 pontos por polegada ou superior.

Salve a imagem em um formato TIFF. Abra o arquivo TIFF na Imagem J ou em um software de quantificação semelhante para medir as intensidades da banda. Visualize a imagem em preto e branco selecionando o tipo de imagem de oito bits.

Use a ferramenta de seleção retangular para contornar a primeira faixa, desenhando um retângulo que seja pelo menos duas vezes mais alto do que largo. Selecione analisar géis. Selecione a primeira pista e a banda será selecionada.

Em seguida, um novo retângulo aparecerá. Mova-o para a próxima banda e selecione Analisar géis, selecione a próxima pista. Repita esse processo até que todas as bandas sejam selecionadas.

Selecione analisar géis plotar pistas para gerar o gráfico de perfil para cada banda. Use a seleção de linha reta para desenhar linhas de base de modo que o pico de interesse seja uma área completamente fechada. Selecione a ferramenta varinha e clique dentro de cada pico para selecioná-la.

Selecione analisar picos de rótulo de géis para obter uma tabela com a área de cada pico selecionado. Esses dados podem ser plotados como tal ou podem ser normalizados para o valor de uma banda escolhida. Essa normalização é especialmente importante ao agrupar valores de vários géis replicados para determinar a significância estatística dos resultados.

Cada poço do gel mostrado aqui foi carregado com uma cultura de células diferente. Supinato contendo diferentes quantidades de MMP dois. A observação direta deste gel mostra diferenças óbvias nas concentrações de MMP dois entre alguns dos poços.

Por exemplo, é claro que ambos os poços quatro e cinco contêm muito mais MMP dois do que os poços 10 e 11 para quantificação objetiva de bandas. A citometria densa foi utilizada com o software Image J. Este software revelou uma diferença aproximada de quatro vezes na mmp.

Duas quantidades entre, bem, 11 e poços quatro e cinco. Da mesma forma, uma diferença de duas vezes nas quantidades de MMP dois foi observada entre os poços 10 e os poços quatro e cinco. Estamos apenas mostrando como detectar métricas funcionais.

Persis de metal por xog. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de não ferver sua amostra. Caso contrário, você não poderá ver nenhuma faixa em seu gel.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.