Name: Detecção de Metaloproteinases da Matriz Funcional por zimografia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a detectar metaloproteinases da matriz funcionais por zimografia usando eletroforese em gel de gelatina e análise de densidade de bandas. Este método permite quantificar atividade enzimática em sobrenadantes de cultura.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. S. Ressler (Departamento de Biologia Molecular e Celular, Baylor College of Medicine) para sugerir o uso de proteína concentradores para aumentar a concentração de MMPs em sobrenadante de cultura de células. Este projeto foi suportado por concessões do Elder Clifford Sra. White Graham Fundo de Investigação Dotado eo NIAMS NIH / (AR059838) para CB. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIH.

1. Carregando e executando o Gel <ol><li> Todas as amostras devem ser preparadas adequadamente para manter a função das enzimas e utilizado imediatamente após a coleta ou armazenado congelado a -80 ° C. As amostras não devem conter agentes redutores (como uma β-mercaptoetanol) ou ser fervida antes de carregá-gel. </li><li> Abra a bolsa que contém um gel dentro de uma gaveta, lavar a cassete com água deionizada. <ul><li> Remover a fita protetora da parte inferior da cassete eo pente de cima do gel. </li><li> Lave os poços três vezes com tampão de corrida (diluído em água deionizada 1X). </li><li> Coloque o gel para o Mini-Cell, garantindo que o menor lado da cassete faces para dentro. Encaixado com o Wedge Tension Gel. O Mini-Cell permite executar um ou dois géis em paralelo. </li><li> Encha a câmara (no interior) superior com 1X tampão de corrida acima do nível do poço, verificar se há vazamentos. Em caso de vazamentos, retire o tampão e reposicionar o gel. </li><li> Encha a câmara baixa com 1X tampão de corrida. </li></ul></li><li> Carga de 10 L de marcador molecular de proteínas em um poço. <ul><li> Misture uma quantidade igual de gel de carregamento de buffer e de amostra e de carga nos poços do gel utilizando gel de carregamento de dicas (alterada entre cada amostra). Estes poços podem ser carregados com até 20 total mL. </li></ul></li><li> Coloque a tampa sobre a Célula Mini-e conecte os cabos eletrodo para o fornecimento de energia. Mudar a fonte de alimentação e configurá-lo para funcionar em 125 V constante por 90 minutos. Verificar a formação de pequenas bolhas no fio da câmara baixa, indicando a circulação atual. </li><li> Ao executar o seu primeiro gel, monitorar o progresso da migração a cada 15 minutos, utilizando o azul de bromofenol incluído no tampão de carregamento como um indicador. Deixe a executar até que o gel corante indicador atinge o fundo do gel. </li></ol> 2. Renaturing e Desenvolvimento do Gel <ol><li> Para cada gel, preparar 100 ml de 1X tampão renaturing e 200 mL de tampão de desnaturação, tanto em água deionizada. </li><li> Quando o corante azul de bromofenol rastreamento atinge o fundo do gel, mude a fonte de alimentação desligada, abrir o celular Mini-, e remover o gel. Separar os dois lados da cassete usando a faca gel (ou uma espátula de pesagem). Cortar um canto para marcar a direção do gel. </li><li> Remova cuidadosamente o gel da gaveta e coloque em um recipiente com 100 mL de tampão renaturing. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Remova o tampão renaturing e adicionar 100 mL de buffer para o desenvolvimento de gel. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Remova o tampão desenvolvimento e adicionar mais 100 mL de tampão para o desenvolvimento de gel. Incubar overnight (16-18 horas) a 37 ° C. </li><li> Remova o tampão desenvolvimento e lavar três vezes (5 minutos cada) com água deionizada sob agitação suave na temperatura ambiente. </li><li> Digitalizar o gel para salvar o posicionamento exato das bandas padrão de proteínas como eles vão se tornar menos visíveis ou não após coloração do gel. </li><li> Manchar o gel pela adição de 20 mL de SimplyBlue Safestain ao gel. Incubar durante uma hora à temperatura ambiente sob agitação suave. </li><li> Remover o SafeStain SimplyBlue e de mancha o gel em 100 mL ou água deionizada por mais uma hora em temperatura ambiente sob agitação suave. </li><li> Para melhores resultados, substitua com água deionizada fresco e incubar por mais uma hora ou mais à temperatura ambiente sob agitação suave. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> Remova cuidadosamente o gel da água e coloque em um protetor de plástico. </li><li> Digitalizar o gel com uma resolução de 300 dpi ou superior. Salve a imagem no formato TIFF (Figura 1A). </li><li> Medir intensidades banda com ImageJ (ou outro software similar). <ul><li> Abra o arquivo TIFF no ImageJ (Figura 1A). </li><li> Visualize em preto e branco, selecionando "Image&gt;&gt; Tipo de 8 bits" (Figura 1B). </li><li> Use a ferramenta de seleção retangular para delinear a primeira banda, desenhando um retângulo, pelo menos, duas vezes maior do que larga (este é um requisito de software). </li><li> Pressione "1" ou selecione "Analisar&gt; Géis&gt; lane Selecione primeiro" ea banda serão delineadas. </li><li> Um novo retângulo aparecerá, movê-lo para a banda e escolha a opção "Analisar&gt; Géis&gt; lane Select next". Repita até que todas as bandas são selecionados (Figura 1B). </li><li> Pressione "3" ou selecione "Analisar&gt; Géis pistas&gt; Plot" para gerar o mapa do perfil de cada banda (Figura 1C). </li><li> Use a seleção de linha reta (já deve estar selecionado automaticamente) para desenhar linhas de base para que o pico de interesse é uma área completamente fechado. </li><li> Selecione a ferramenta varinha e clique dentro de cada pico para selecioná-lo. </li><li> Selecione "Analisar&gt; Géis picos&gt; Label" para obter uma tabela com a área de cada pico selecionado. Estes dados podem ser plotados como tal (F1D IGURA) ou pode ser normalizada para o valor de uma banda escolhida. Esta normalização é especialmente importante quando o agrupamento de vários valores géis replicar para determinar a significância estatística dos resultados. </li></ul></li></ol> 4. Resultados representante Mostramos um gel com 11 poços carregado com sobrenadantes de células diferentes de cultura contendo diferentes quantidades de MMP-2 (Figura 1A). Observação direta deste gel mostra diferenças óbvias em MMP-2 concentrações entre alguns dos poços. Por exemplo, fica claro que os poços # 4 e 5 contêm muito mais MMP-2 do que bem # 11 ou até mesmo bem # 10. Para a quantificação objetivo de bandas que têm usado com o software de densitometria ImageJ (Figura 1B-D), confirmando uma diferença de cerca de 4 vezes na MMP-2 montantes entre bem # 11 e # poços 4 e 5 e uma diferença de aproximadamente 2 vezes na MMP-2 montantes entre bem # 10 e # poços 4 e 5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Detecção de MMP-2 por zimografia gelatina. Uma imagem, digitalizada de um gel de gelatina. Números são bem indicado na parte superior do gel. B gel, mesmo que em um mostradas em preto e branco para a densitometria. Cada banda foi selecionada com um retângulo no ImageJ. C, dois exemplos de perfis de densitometria para o gel mostrado em A e B (bandas # 4 e # 11). Uma linha reta foi traçada na base de cada pico para criar uma área fechada. D, Lote das áreas de pico para o gel mostrado em A e B antes (esquerda) e após a normalização (direita) para a densidade da banda # 1. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esta figura demonstra como zimografia pode ser usado como uma técnica semi-quantitativa. Temos carregado diluições em série (passos de 1:1 diluições) em 7 poços consecutivos e mediram a densidade de banda para os dois pró-MMP-2 e MMP-2.

<ol><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós demonstramos como realizar análise zymographic de MMP-2 em sobrenadante de cultura de células. A quantidade de amostra para carregar em um gel deve ser determinada empiricamente, dependendo da origem e MMP de interesse. Carregamento muito pouco vai impedir a detecção ao carregar demais pode levar à saturação como há substrato somente tanto uma protease pode digerir na área da banda. Se necessário, a amostra pode ser diluída em água deionizada antes da mistura com tampão de carregamento ou o tempo de desenvolvimento podem reduzido de overnight a 4 horas. Também é possível concentrar as proteínas em uma solução utilizando concentradores (por exemplo, catálogo Millipore # UFC803024). Se bandas permanecem pouco visíveis, pode ser necessário para desenvolver o gel por um longo período de tempo, até um máximo de 48 horas. Ao preparar as amostras de sobrenadantes de cultura de tecido, deve-se notar que o soro fetal bovino (e outros soros) contém MMPs que podem afetar os resultados. Por essa razão, coletamos todos os nossos sobrenadantes após cultura em meio livre de soro. As lavagens descritos nos parágrafos 2.9 e 2.10 do protocolo são necessárias para remover o fundo de coloração de bandas digeridas. Vezes mais lavar irá remover mais fundo, mas também dim a coloração do substrato ao longo do gel. Se lavar mais vezes são necessárias, recomendamos a varredura do gel a cada poucas horas para selecionar o scan com o melhor contraste. Esta técnica pode ser utilizada para detectar outras MMPs. Por exemplo, MMP-9 pode ser detectado em gel de gelatina, e também em menor escala MMP-1, MMP-8 e MMP-13 como a gelatina não é o seu substrato preferencial. MMP-1 e MMP-13 são melhor detectadas em zimografia colágeno, enquanto a caseína é o substrato preferido para a MMP-11 e também permite a detecção de MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 e MMP-13 9. MMP-7 (matrilisina) e colagenases (MMP-1 e MMP-13) são difíceis de detectar quando presente em níveis baixos em caseína ou géis de gelatina. Adição de heparina ao exemplo em tempo de carregamento gel melhora significativamente o limite de detecção para MMP-7. Para MMP-1 e MMP-13, a heparina deve ser adicionado ao gel após a corrida eletroforética já está em andamento 12. Desde zimografia medidas atividade enzimática após desnaturação e renaturação das enzimas, ele irá medir a atividade de todas as MMPs presentes na amostra. Isto inclui as enzimas, pró-enzimas, enzimas e obrigado a inibidores endógenos (por exemplo, TIMP-2). No entanto, é possível determinar o nível de ativação MMP na amostra, comparando a densidade da banda da enzima ativa e do da pró-enzima, que terá um peso molecular um pouco maior. Zimografia muitas vezes não é suficiente para identificar uma MMP. Comparação do nível de migração de uma MMP com conhecidos padrões de peso molecular não ajuda na identificação, mas deve-se notar que algumas dessas normas contêm um agente redutor e que, quando usado sob condições não-redução que pode indicar diferentes pesos moleculares 9. Uma opção é carregar um MMP solúvel recombinante no mesmo gel que as amostras de teste. MMPs pode, contudo, ser associado com outras proteínas, induzindo uma mudança no peso molecular aparente. Inibidores seletivos MMP pode ser adicionado ao gel (ou parte de um corte pela metade gel) durante a incubação em tampão desenvolvimento como ferramentas farmacológicas para a identidade do MMP de interest.A segunda técnica (Western Blot, imunocitoquímica, ou ELISA) é recomendada para ajudar na identificação da MMP de interesse. Note-se que os limites de detecção para Western Blot são frequentemente muito inferiores aos dos géis zymographic, podendo levar a resultados falso-negativos quando se usa esta técnica.

<table><tbody><tr><td>Aparelho de eletroforese com marcação CE Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação (modelo 302)</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>Géis zimográficos de gelatina Novex 10%, 1,0 mm, 12 poços</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de carregamento Blue Juice</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>Pontas para carregamento de géis</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>Padrão de peso molecular de proteína</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de corrida Novex Tris-Glycine-SDS</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de renaturação zimográfico Novex</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de desenvolvimento zimográfico Novex</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Scanner Epson Perfection 4490 Photo</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>Desenvolvido por W. Rasband, NIH/NIMH</td></tr></tbody></table>

detecção de metaloproteinases da matriz funcional por zimografia

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Metaloproteinases de matriz (MMPs) são endopeptidases contendo zinco. Eles degradam proteínas por clivagem de ligações peptídicas. Mais de vinte MMPs foram identificados e são separados em seis grupos com base em sua estrutura e especificidade de substrato (colagenases, gelatinases, tipo de membrana [MT-MMP], estromelisinas, matrilisinas, e outros). MMPs desempenham um papel crítico na invasão celular, a degradação da cartilagem, remodelação do tecido, cicatrização de feridas, e embriogênese. Eles, portanto, participar em ambos os processos normais e na patogênese de muitas doenças, como artrite reumatóide, câncer ou doença pulmonar obstrutiva crônica 1-6. Aqui, vamos nos concentrar em MMP-2 (gelatinase A, colagenase tipo IV), a MMP amplamente expressa. Vamos demonstrar como detectar MMP-2 em sobrenadante de cultura de células por zimografia, uma técnica comumente usada, simples, e ainda assim muito sensível descrita pela primeira vez em 1980 por C. Heussen e Dowdle EB 7-10. Esta técnica é semi-quantitativo, portanto pode ser usada para determinar os níveis de MMP em amostras de teste quando concentrações conhecidas de MMP recombinante são carregados no mesmo gel 11. Soluções contendo MMPs (por exemplo, sobrenadantes de cultura de células, urina ou soro) são carregados em um gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS, para linearizar as proteínas) e gelatina (substrato para a MMP-2). O tampão de amostra é projetado para aumentar a viscosidade da amostra (para facilitar o carregamento gel), fornecem um corante de rastreamento (azul de bromofenol, para monitorar a migração da amostra), fornecem moléculas de desnaturação (para linearizar proteínas), e controlar o pH da amostra. Proteínas são, então, permissão para migrar sob uma corrente elétrica em um tampão de corrida projetado para fornecer uma taxa de migração constante. A distância de migração é inversamente correlacionada com o peso molecular da proteína (pequenas proteínas se movem mais rapidamente através do gel de proteínas e, portanto, fazer grandes migrar ainda mais para baixo do gel). Após a migração, o gel é colocado em um buffer renaturing para permitir que as proteínas para recuperar a sua estrutura terciária, necessárias para a atividade enzimática. O gel é então colocada em um buffer de desenvolvimento concebido para permitir a protease para digerir seu substrato. O buffer de desenvolvimento também contém p-aminophenylmercuric acetato (APMA) para ativar a não proteolíticos pró-MMPs em MMPs ativas. O próximo passo consiste em manchar o substrato (gelatina no nosso exemplo). Depois de lavar o excesso de corante fora do gel, as áreas de digestão protease aparecem como faixas claras. Quanto mais clara a banda, mais concentrada a protease que ele contém. Intensidade de coloração da banda pode ser determinada por densitometria, utilizando um software, como ImageJ, permitindo a comparação da amostra.

Este protocolo descreve um ensaio baseado em atividades para a detecção de metaloproteinases de matriz em sobrenadante de cultura ou fluidos corporais.

Detecção de Metaloproteinases da Matriz Funcional por zimografia

As metaloproteinases de matriz (MMPs) são endopeptidases que contêm zinco. Elas degradam proteínas através da clivagem de ligações peptídicas. Mais de vinte MMPs foram ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar metaloproteinases matriciais funcionais. Isso é alcançado primeiramente preparando a amostra para zy mediante a adição de um tampão de carga livre de agentes redutores agility. Em seguida, o gel de gelatina ZY Graham é carregado com a amostra e deixado correr até que o corante de acompanhamento atinja o final do gel.Após a eletroforese, o gel é renaturado, desenvolvido, corado e descorado. O passo final do procedimento é escanear o gel para análise dos dados. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram a atividade da metaloproteinase da matriz nas amostras por meio da análise da densidade das bandas.Olá, sou do laboratório da Dra. Kristin Bitten, do Departamento de Fisiologia Molecular e Biofísica do LER College of Medicine. Hoje vamos mostrar um procedimento para detectar metaloproteinases da matriz por zimografia. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar metaloproteinases da matriz secretadas por células primárias cultivadas.Então vamos começar o estudo. Antes do início deste protocolo, prepare adequadamente todas as metaloproteinases da matriz ou MMPs para manter a função das enzimas. As amostras podem ser usadas imediatamente ou armazenadas a menos 80 graus Celsius.Aqui, a MMP dois, também conhecida como gelatinase A ou colagenase do tipo quatro, é utilizada para demonstrar a visualização da atividade de MP com sinografia. Uma vez que as enzimas MMP tenham sido preparadas, obtenha um sachê de gel de zimograma de gelatina 10% contendo um gel dentro de uma cassete. Enxágue a cassete com água desionizada.Remova a fita protetora da parte inferior da cassete e o pente do topo do gel. Enxágue os poços três vezes com tampão de corrida de tris glicina-SDS.Coloque o gel em um equipamento de eletroforese em minicélula, garantindo que o lado menor da cassete fique voltado para dentro. Fixe o gel no lugar com a cunha de tensão do gel. Encha a câmara superior do equipamento com tampão de corrida de tris glicina SDS acima do nível dos poços e verifique a presença de vazamentos.Encha também a câmara inferior do conjunto de eletroforese em gel com tampão de corrida. Em seguida, carregue 10 microlitros do marcador molecular de proteínas. Misture uma quantidade igual da amostra com tampão de carga para gel, que não contém agentes redutores.Diferentemente da eletroforese SDS-PAGE convencional, não aqueça as amostras em banho-maria e carregue-as diretamente nos poços do gel. Utilizando ponteiras próprias para carregamento de géis, esses poços podem conter até 20 microlitros de volume. Coloque a tampa na cuba e conecte os cabos dos eletrodos à fonte de alimentação.Ligue a fonte de alimentação e configure o gel para correr a 125 volts constantes durante 90 minutos. Verifique a formação de pequenas bolhas no fio da câmara inferior, indicando a circulação de corrente ao executar o primeiro gel. Monitore o progresso da migração a cada 15 minutos utilizando o azul de bromofenol incluído no tampão de carregamento como indicador para cada gel.Prepare 100 mililitros de tampão Rena xmo gram uma vez, e 200 mililitros de tampão de revelação xmo gram, ambos em água deionizada. Quando o corante de rastreamento azul de bromofenol atingir a base do gel, desligue a fonte de alimentação. Abra a minicélula e remova o gel.Se pare as duas partes da cassete. Usando uma faca de gel, corte um canto para marcar a direção do gel. Remova cuidadosamente o gel da cassete e coloque-o em um recipiente com 100 mililitros de Rena Buffer.Incube o gel por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação suave, remova o tampão Rena e adicione 100 mililitros de tampão de revelação ao gel. Incube por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, remova o tampão de revelação e adicione mais 100 mililitros de tampão de revelação fresco ao gel.Incube o gel durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação noturna, remova o tampão revelador e lave o gel incubando-o com água desionizada e uma agitação suave. Repita essa lavagem duas vezes, durante cinco minutos à temperatura ambiente.Coloque o gel sobre um protetor plástico e remova as bolhas. Em seguida, digitalize o gel com um scanner fotográfico para salvar a posição exata das bandas do padrão proteico, pois elas se tornarão pouco visíveis após a coloração do gel.Manche o gel adicionando 20 mililitros do corante azul simples seguro ao gel. Incube o gel por uma hora à temperatura ambiente. Sob agitação suave, remova o corante azul simples seguro e mantenha o gel em 100 mililitros de água desionizada à temperatura ambiente sob agitação suave.Após uma hora, substitua por água desionizada fresca e continue a incubar o gel por pelo menos uma hora. Para analisar os dados utilizando citometria, remova cuidadosamente o gel da água e coloque-o em um protetor de folhas plástico. Utilizando um scanner de fotos, digitalize o gel com uma resolução de 300 pontos por polegada ou superior.Salve a imagem no formato TIFF. Abra o arquivo TIFF no ImageJ ou em software similar de quantificação para medir as intensidades das bandas. Visualize a imagem em preto e branco selecionando o tipo de imagem de oito bits.Use a ferramenta de seleção retangular para delinear a primeira banda, desenhando um retângulo com altura pelo menos duas vezes maior que sua largura. Selecione analisar géis. Selecione a primeira fileira, e a banda será selecionada.Então, um novo retângulo aparecerá. Mova-o para a próxima banda e selecione Analisar géis, selecione a próxima fileira. Repita este processo até que todas as bandas sejam selecionadas.Selecione analisar géis e traçar faixas para gerar o gráfico de perfil para cada banda. Use a seleção de linha reta para desenhar as linhas de base de modo que o pico de interesse seja uma área completamente fechada. Selecione a ferramenta de varinha mágica e clique dentro de cada pico para selecioná-lo.Selecione analisar géis e rotular picos para obter uma tabela com a área de cada pico selecionado. Esses dados podem ser plotados como estão ou podem ser normalizados em relação ao valor de uma faixa escolhida. Essa normalização é especialmente importante ao agrupar valores de vários géis replicados para determinar a significância estatística dos resultados.Cada poço do gel mostrado aqui foi carregado com uma cultura celular diferente. Os sobrenadantes continham diferentes quantidades de MMP-2. A observação direta deste gel mostra diferenças evidentes nas concentrações de MMP-2 entre alguns dos poços.Por exemplo, é evidente que os poços quatro e cinco contêm muito mais MMP dois do que os poços 10 e 11 para a quantificação objetiva das bandas. A citometria densa foi utilizada com o software Image J. Esse software revelou uma diferença aproximada de quatro vezes na mmp.Duas quantidades entre, bem, 11 e poços quatro e cinco. De forma semelhante, uma diferença de duas vezes nas quantidades de MMP-2 foi observada entre os poços 10 e os poços quatro e cinco. Estamos apenas mostrando como detectar métricas funcionais.O metal persis pelo xog. Quando realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não ferver sua amostra. Caso contrário, não será possível visualizar nenhuma banda em seu gel.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste artigo, descrevem a utilização de uma pinça magnéticos para estudar o efeito da força sobre a proteólise enzimática no nível única molécula de uma maneira altamente paralelizável.

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Neste vídeo, realizamos zimografia, uma técnica eletroforética, para analisar a atividade proteolítica em amostras biológicas.

Zimografia de peptídeos fluorescentes: uma técnica modificada para detectar a atividade da protease usando substratos fluorogênicos em géis de zimograma

Este vídeo demonstra a técnica de eletroforese em gel de zimografia para avaliar a atividade das metaloproteinases da matriz (MMPs) presentes no sobrenadante da cultura de células. As MMPs ativas degradam o substrato específico da MMP incorporado em um gel de poliacrilamida, que aparece como faixas transparentes contra um fundo manchado escuro após a coloração.

Eletroforese em gel com zimografia: uma técnica eletroforética para detectar metaloproteinases da matriz avaliando a atividade enzimática

Medição de massa exata representa um passo importante durante a investigação de proteínas. De matriz assistida por laser de dessorção / ionização (MALDI) Espectrometria de massa (MS) pode ser utilizado para tal determinação e a sua principal vantagem é a tolerância para os sais, detergentes e contaminantes. Aqui, ilustramos uma abordagem acessível para a análise de proteínas maiores do que 100 kDa, por MALDI-MS.

Matrix-assisted laser dessorção / ionização Time of Flight (MALDI-TOF) espectrometria de massa Análise de proteínas intactas maior que 100 kDa

Este protocolo descreve como preparar uma matriz mista 2D, consistindo em gelatina e colágeno I, e um plugue 3D de colágeno I para estudar invadossomas lineares. Esses protocolos permitem o estudo da formação de invadosoma linear, atividade de degradação da matriz e as capacidades de invasão de células primárias e linhas celulares de câncer.

Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a especificidade da protease no tecido cru rato extratos usando espectrometria de MALDI-TOF.

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para uma técnica modificada de zymographic na qual fluorescentes peptídeos são usados como substrato degradável no lugar de proteínas nativas. Eletroforese de amostras biológicas em Zimogramas peptídeo fluorescente permite a detecção de uma gama maior de proteases que as técnicas de zymographic anterior.

Deteção da atividade de Protease por zimografia peptídeo fluorescente

Aqui, um protocolo é apresentado para encapsular e cultivo de células em hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) acrescida com um fluorogenic matriz metaloproteinase (MMP)-peptídeo degradável. Celular MMP e atividade metabólica são medidos diretamente a partir das culturas de hidrogel usando um leitor de microplacas padrão.

Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D

Sua marca purificação, diálise e ativação são empregadas para aumentar os rendimentos da expressão proteica de domínio catalítico de matriz solúvel-3 em bactérias. As frações proteicas são analisadas através de géis SDS-PAGE.

Expressão bacteriana e purificação da matriz humana Metaloproteinase-3 usando cromatografia de afinidade

As proteinases são vitais para a patogênese bacteriana, permitindo a invasão e a evasão imunológica. A extração em uma única etapa de proteínas citoplasmáticas e de membrana de bactérias em sua forma ativa é angustiante. Este artigo em vídeo demonstra a extração de proteínas celulares inteiras de Leptospira para análise de zimografia para detectar e caracterizar gelatinases.

Extração em uma etapa e análise zimográfica de gelatinases bacterianas

Aprenda a detectar metaloproteinases da matriz funcionais por zimografia usando eletroforese em gel de gelatina e análise de densidade de bandas. Este método permite quantificar atividade enzimática em sobrenadantes de cultura.

Detecção de Metaloproteinases da Matriz Funcional por zimografia

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