BioImaging registradas de Nanomateriais para Monitoramento de Diagnóstico e Terapêutica

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens da distribuição e avaliar a eficácia terapêutica de nanopartículas marcadas magneticamente ou formuladas por medicamentos. Isso é feito primeiro fabricando as partículas, testando suas propriedades biológicas para absorção celular em sistemas modelo de laboratório, depois injetando as formulações carregadas de células e avaliando sua distribuição tecidual por meio de bioimagem. As regiões cerebrais afetadas visualizaram antes e depois da injeção de macrófagos derivados de monócitos infectados pelo vírus.

A segunda etapa do procedimento é obter imagens de sub-regiões cerebrais contendo nanopartículas carregadas de células, marcadas magneticamente ou terapêuticas. Isso é feito em vários momentos após as injeções de células contendo nanopartículas marcadas magneticamente ou medicamentos nanoformulados. A terceira etapa do procedimento é realizar a análise histológica do endpoint de nanopartículas, biodistribuição e alterações celulares.

O co-registro dos resultados de imagem é feito com histologia. A etapa final do procedimento é quantificar e exibir a biodistribuição das nanopartículas, determinar anormalidades espectroscópicas e avaliar anormalidades do tensor de difusão em função do tempo após a colocação da injeção celular. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a biodistribuição e os efeitos na química cerebral e na morfologia celular que ocorrem como consequência do tratamento terapêutico e diagnóstico com nanomateriais por meio de ressonância magnética e espectroscopia que são co-registrados em análises histológicas.

Olá, sou o Dr. Michael Bosca, diretor do Programa de Bioimagem do Centro Médico da Universidade de Nebraska. Este trabalho faz parte de uma colaboração contínua entre meu laboratório e o laboratório do Dr. Howard Gendelman. A principal vantagem da imagem não invasiva em relação aos métodos comumente usados, como microscopia confocal, nanopartículas fluorescentes, é que todo o cérebro pode ser coberto em um único exame e estudos longitudinais são possíveis no mesmo animal.

Isso reduz a variabilidade biológica, requer menos animais e, em muitos casos, pode ser traduzido para uso humano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre nanopartículas recém-derivadas, incluindo perfis farmacocinéticos de biodistribuição e eficácia terapêutica. A combinação de procedimentos de imagem robustos combinados com co-registro histológico é única e necessária para realizar os estudos de biodistribuição e eficácia de medicamentos resolvidos no tempo em modelos animais complexos de doenças, demonstrando que esses procedimentos serão os técnicos do meu laboratório, Lindsey e Melissa e o colega de pós-doutorado Dr.P. Eles são responsáveis pela aquisição de dados de imagem de animais no laboratório.

Aaron e Mariano são responsáveis pelo processamento da imagem, incluindo imagem por tensor de difusão e co-registro histológico. Olá, meu nome é Dr.Howard Delman e sou o chefe do Laboratório de Neurociência Emergente Carol Schwartz do Centro Médico da Universidade de Nebraska. Esta colaboração interdisciplinar com o Dr. Basca e seu laboratório tem amplas implicações para a terapia e diagnóstico de uma série de doenças neurodegenerativas.

A espectroscopia magnética residente e as anormalidades de imagem do tenor de difusão são usadas para monitorar lesões neuronais e de processos neurológicos durante a doença. Para o projeto atual, os métodos incluem a eficácia da biodistribuição de nanomedicamentos, como distribuições de medicamentos de corpo inteiro e eficácia terapêutica para o sistema nervoso. Uma variedade de técnicas de fabricação de partículas está sendo desenvolvida para melhorar a detecção da distribuição celular durante a doença e incluir alterações no tamanho das partículas, revestimento e carga.

Todas elas permanecerão áreas ativas de investigação em nossos laboratórios. Primeiro, os nanomateriais para entrega e biodistribuição de medicamentos devem ser preparados, que é um tópico de um manuscrito paralelo nesta edição. Primeiro, replique as nanoformulações candidatas para uso in vivo, substituindo o núcleo ou gotícula do medicamento por uma partícula de tamanho idêntico ou pedaço moído de óxido de ferro superparamagnético antes de revestir com o surfactante apropriado.

Em seguida, meça o tamanho, a forma da carga e a citotoxicidade para determinar se o sistema modelo SPIO tem as mesmas propriedades que o candidato a medicamento nanoformulado. Por fim, realizar ensaios de carregamento celular por incubação com a formulação nano modelo SPIO candidata para determinar a atividade dentro das células, utilizando simuladores compostos por células marcadas suspensas em gel de ágar, os simuladores devem ser preparados em triplicata em uma série de concentrações, a fim de quantificar a atividade devido à captação de SPIO nas células. Isso fornece um índice de sensibilidade e determina se as nano formulações podem afetar o estado de oxidação e, portanto, a visibilidade do SPIO em exames de ressonância magnética.

Antes do escaneamento, coloque o animal em uma câmara de anestesia pré-preenchida com os gases anestésicos. Isso acelerará o início da anestesia e minimizará o tempo necessário para garantir que o animal não acorde após a remoção da câmara. Uma vez totalmente anestesiado, remova o animal da câmara e coloque-o no suporte estereotáxico equipado para monitorar a frequência respiratória e a temperatura.

Coloque a cabeça do animal no suporte de cabeça, prenda as barras auriculares e prenda o corpo com gaze. O porta-animais deve estar equipado com uma barra de dentes ajustável, permitindo o alinhamento vertical e horizontal da cabeça, garantir que a cabeça esteja posicionada corretamente na direção rostral do cordão e que a cabeça não seja girada. Verifique se a bobina de superfície está bem colocada na cabeça, permitindo a rotação do suporte do animal.

Quando no ímã fornecerá compensação para pequenas rotações, que podem ocorrer de animal para animal. Assim que o animal estiver seguro no suporte, coloque-o no scanner de ressonância magnética. Agora mova o suporte com a bobina de superfície para o centro do scanner.

Um ressonador de 72 milímetros ativamente desacoplado é usado para transmitir energia de RF para criar o sinal, enquanto a bobina principal é usada para recepção de sinal. Agora determine a posição inicial usando uma leitura unidimensional em tempo real na direção rostral cordal. O uso da recepção da bobina de superfície restringe o sinal à área ao redor da bobina de superfície, limitando a necessidade de interpretação das formas de onda observadas.

Em seguida, adquira um localizador de três planos para determinar a posição precisa do animal no scanner. Em seguida, é necessário calço ou ajuste à homogeneidade do campo magnético. Para fazer isso, usamos uma sequência de eco multigradiente e um software de mapeamento desenvolvido pelo Dr. Hobie Heatherington, que combina regiões de homogeneidade com a região examinada por cada método de imagem individual.

Assim que o calço estiver concluído, as varreduras de interesse podem ser adquiridas. A biodistribuição de nanopartículas contendo SPIO pode ser detectada como regiões de perda de sinal em ressonância magnética ponderada de três DT de duas estrelas de alta resolução primeiro, antes de injetar o animal, determine a região do cérebro a ser escaneada a partir das varreduras do LOCALIZADOR. Em seguida, prescreva um gradiente 3D de alta resolução, sequência de eco lembrada com uma resolução isotrópica de 150 mícrons.

Adquira uma varredura de linha de base, injete o animal e adquira a mesma sequência novamente. Estudos paralelos para determinar a eficácia terapêutica de nanomedicamentos podem ser realizados usando exames de imagem por tensor de difusão e espectroscopia de ressonância magnética de hidrogênio. Primeiro adquira imagens de batedores S e calce a região a ser escaneada.

Em seguida, adquira DTI usando uma difusão de eco de spin gated respiratória, sequência de imagem planar ponderada em nossos exames. A codificação de difusão usada foi um esquema de catedral ISO de polaridade alternada e variante e alternada balanceada com 12 direções, e o esquema de codificação foi projetado para reduzir os acoplamentos de gradiente de difusão de fundo. O tempo total de aquisição foi de 20 a 40 minutos, dependendo da frequência respiratória.

Em seguida, adquira o Mr.Spectroscopy. Localize a região de interesse nas imagens adquiridas anteriormente, execute o calço na região selecionada e, em seguida, otimize a potência dos pulsos de supressão de água. Meça a frequência da água para garantir o sinal de água de ressonância e adquira um espectro de teste curto para fornecer controle de qualidade se, se os espectros forem de qualidade insuficiente.

Verifique as configurações do sistema, incluindo configurações de radiofrequência, energia e calço. Finalmente, adquira os espectros em blocos curtos com redefinição da frequência do sistema entre as aquisições para eliminar os efeitos do desvio do campo magnético. Ao final da aquisição.

Use um único espectro de água de pulso como um ganho pré-amplificador predefinido como uma referência quantitativa de amplitude de sinal. Após a ressonância magnética final da série, perfunda o mouse, remova o cérebro e incorpore-o em um bloco de composto OCT, que foi escurecido com uma gota de tinta nanquim. Em seguida, coloque este bloco em um criostato para corte e análise histológica.

Adquira imagens de rosto em bloco usando uma câmera digital montada na frente do criostato. As imagens devem ser tiradas a cada 50 micrômetros através de todo o número do volume cerebral, as fatias para permitir o registro dentro do volume. Após o processamento histológico e a coloração, alinhe as fatias individuais da face do bloco para reconstruir o volume 3D.

Usando os contornos do bloco para contabilizar o jitter na posição da cabeça do criostato e, em seguida, segmente automaticamente o volume do cérebro usando um algoritmo de crescimento de região baseado em sementes no pacote de software de análise. O óxido de ferro superparamagnético causa perda de sinal na ressonância magnética ponderada em T duas estrelas e, como tal, o vazio do sinal da ressonância magnética é um marcador sensível, mas não específico, para sua presença. Fornecer sensibilidade e especificidade para a presença de SPIO no cérebro.

Imagens de subtração devem ser criadas a partir dos exames de ressonância magnética 3D pré e pós-injeção para nosso estudo. As varreduras foram sub-imageadas usando um método de conjunto de níveis restritos desenvolvido em nosso laboratório. Os volumes cerebrais com imagens secundárias foram então co-registrados, a intensidade do sinal foi normalizada e o volume subtraído para detectar regiões dentro do cérebro com perda de sinal, que não estava ao longo das bordas para eliminar o sinal positivo de força de quaisquer erros de registro de subpixel.

Em seguida, o co-registro entre histologia e ressonância magnética é realizado usando a imagem da face em bloco como referência comum. A colocalização precisa desses dois sinais fornece uma medida da precisão do co-registro e distorção da histologia de volta às formas originais das fatias. As varreduras de DTI podem ser analisadas selecionando primeiro uma região anatômica de interesse para determinar as propriedades médias de difusão do tecido em uma subestrutura anatômica específica.

Em nossos estudos, as análises dos dados ponderados por difusão são realizadas usando programas personalizados escritos em linguagem de dados interativa fornecida pelo Dr. Cada Hassan. As análises de San produzem mapas da difusividade do tensor, difusividade média e atrofia fracionária de anes. Os componentes transversais e longitudinais do tensor de difusão também podem ser obtidos uma vez que os mapas são construídos.

Desenhe regiões de interesse na ressonância magnética ponderada T dois sobreposta com mapas de direcionalidade codificados por cores. Exemplos da região escolhida em nossos experimentos para análise no modelo de camundongo HIV são exibidos aqui. Os dados de cada região de interesse são baixados como um arquivo de texto para serem inseridos em um banco de dados posteriormente.

Um exemplo de resultado de ajuste da curva MRS de um único espectro é mostrado aqui em nosso laboratório. Empregamos um método de ajuste no domínio do tempo chamado Quest. No pacote de processamento de sinal J-M-R-U-I.

O Quest ajusta os espectros usando uma combinação linear de espectros de metabólitos individuais para realizar pelo menos a minimização de quadrados entre o espectro estimulado e o real. Usamos um conjunto básico de 22 metabólitos individuais como potenciais fatores contribuintes. Os espectros de base são simulados e validados usando espectros de soluções de metabólitos individuais.

Exemplos da biodistribuição de macrófagos marcados com SPIO usando esses métodos são vistos aqui com uma sobreposição da localização das células marcadas detectadas por ressonância magnética em vermelho, localização das células marcadas usando histologia co-registrada em azul e amarelo sobreposto. O camundongo havia marcado macrófagos derivados de monócitos injetados na veia da cauda. Cinco dias depois, a ressonância magnética ponderada em T duas estrelas foi adquirida e processada conforme descrito.

O camundongo foi preparado por injeção de macrófagos humanos infectados pelo HIV no cérebro, que é visto como uma linha de macrófagos derivados de monócitos de camundongo detectados. Outros exemplos de detecção de células marcadas e co-registro com histologia podem ser vistos em nossas publicações anteriores. O fabricante das partículas e o ensaio das suas propriedades biológicas para a absorção celular em sistemas-modelo de laboratório são necessários e devem ser realizados de acordo com procedimentos estéreis para utilização nestas investigações em animais.

As injeções das formulações carregadas de células devem ser feitas sem comprometer o acesso às veias, pois afetarão o cérebro e outras regiões do tecido, visualizaram a integração da célula biológica com as técnicas de bioimagem e o forte cenário de colaboração cruzada provou ser vital para o sucesso do projeto geral. Uma vez dominados, os procedimentos podem ser concluídos em duas horas, dependendo da disponibilidade de pessoal treinado para configurar, posicionar e calibrar os sistemas durante a execução do procedimento. É importante lembrar de manter a esterilidade para que os frágeis camundongos imunocomprometidos sejam mantidos viáveis durante o curso de estudos em série, alguns dos quais podem durar meses.

Esses métodos prepararam o terreno para como os pesquisadores podem explorar a relação entre as alterações celulares visualizadas usando a histologia e as anormalidades morfológicas, fisiológicas e bioquímicas detectadas. O uso de métodos de neuroimagem no co-registro cerebral da histologia é desafiador e foi realizado por apenas alguns grupos. Depois de assistir a este vídeo.

Você deve entender como os experimentos de imagem cerebral são realizados e co-registrados com histologia em um modelo de doença de roedor. Isso pode ser usado para medir a biodistribuição de partículas de óxido de ferro super paramagnéticas. Alternativamente, a ressonância magnética pode e a Mr.Spectroscopy localizada pode ser usada para rastrear a neurodegeneração observada durante os processos da doença.

Os efeitos terapêuticos para melhorar os danos cerebrais podem então ser avaliados em série. A imagem pode ser usada em conjunto com a histologia para validar os achados experimentais. No geral, esses métodos fornecerão um conjunto dinâmico e preciso de medidas para nanopartículas, biodistribuição e eficácia terapêutica.