Organotípicas Hippocampal Culturas Slice
3 de fevereiro de 2011
Nós descrevemos um método para preparar organotípicas fatias do hipocampo que pode ser facilmente adaptado a outras regiões do cérebro. Fatias de cérebro são colocadas em membranas porosas e meios de cultura está autorizado a formar uma interface. Este método preserva a arquitetura bruta do hipocampo para até duas semanas em cultura.
O objetivo geral deste procedimento é cultivar fatias organotípicas do hipocampo. Isso é realizado primeiramente dissecando o hipocampo. O segundo passo do procedimento consiste em cortar o hipocampo em fatias.
O terceiro passo do procedimento é separar e classificar as fatias hipocampais. O passo final do procedimento é cultivar as fatias hipocampais. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram fatias hipocampais orgânicas saudáveis por meio da visualização com um microscópio estereoscópico ou com um microscópio óptico.
Olá, meu nome é Jimena Opitz e sou cientista pesquisadora no laboratório do Dr. Andres bar, na Universidade de Washington, em Seattle. Vou demonstrar o procedimento para o cultivo de fatias organotípicas do hipocampo, LICs. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades devido à necessidade de dissecar e fatiar rapidamente os hipocampos e de prevenir contaminação, solução de dissecação estéril e cultivo de fatias.
O meio pode ser preparado com até três semanas de antecedência e armazenado a quatro graus Celsius, conforme descrito no protocolo escrito. Antes do corte de hipocampo, as culturas podem ser preparadas. É necessário esterilizar adequadamente tanto a cabine de cultura celular quanto o equipamento que será utilizado na dissecção.
Primeiro, limpe a superfície interna da cabine de cultura de tecidos com etanol 70%. Em seguida, coloque o microscópio estereoscópico e todos os instrumentos de dissecação dentro da cabine. Prepare o cortador de tecidos colocando um pedaço limpo de folha de teflon sobre a platina e fixando uma lâmina nova.
Coloque o cortador de tecidos dentro da capela de cultura celular e, utilizando uma luz UV, esterilize todas as superfícies e equipamentos por 15 minutos. Desligue a luz após a conclusão do processo de esterilização por UV. Trabalhe dentro da capela de cultura celular.
Primeiro, prepare as placas de cultura de tecidos de seis poços que serão usadas para o cultivo dos fragmentos de hipocampo. Pipete 750 microlitros de SEM para cada poço da placa de seis poços. Em seguida, utilizando pinças estéreis, coloque um inserto de cultura celular em cada poço da placa de cultura de tecidos.
Tendo o cuidado de não aprisionar bolhas de ar sob o inserto. É importante que a membrana de cada inserto de cultura celular esteja úmida com o meio de cultura de fatias. Se a membrana estiver seca, verifique se não há bolhas de ar presentes.
Se a membrana estiver acima do menisco do meio SCM, mais meio pode ser adicionado ao poço. Coloque as placas de cultura preparadas em um incubador de cultura de tecidos. Ajuste para 35 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até o momento do uso.
Por fim, encha um balde de gelo com uma mistura de gelo e sal e coloque-o ao lado da área de decapitação, trabalhando dentro da câmara de fluxo laminar. Encha um béquer de 100 mililitros com solução de dissecação. Insira o béquer na mistura de gelo e sal e borbulhe a solução com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio por 10 a 20 minutos, até que a cor mude de rosa para laranja.
E a solução de dissecação forma uma mistura pastosa de solução congelada e líquida. Agora, o ambiente de dissecação e as placas de cultura de tecidos estão prontos para a dissecação. Envolva P três a P sete.
Utilizam-se filhotes para este procedimento. Cortes. As culturas podem ser preparadas a partir de até três filhotes por vez. Este procedimento será ilustrado utilizando um único filhote.
Retire rapidamente o cérebro do filhote decapitado e coloque-o no béquer de 100 mililitros contendo a solução de dissecção Slurry Chill por um minuto. Durante esse tempo, prepare um recipiente de dissecção adicionando cerca de 10 mililitros de solução de dissecção gelada no fundo de uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros. Usando uma colher arredondada ou espátula microscópica, transfira o cérebro do béquer de 100 mililitros para a placa de 60 milímetros contendo o meio de dissecção frio. Certifique-se de que o cérebro esteja completamente coberto pela solução de dissecção.
Coloque a placa contendo o cérebro sob o microscópio estereoscópico. Olhe através do microscópio estereoscópico e localize o cérebro. Utilize pinças estéreis de dissecação para mover o cérebro para o centro do campo de visão.
Segure o cérebro na linha média com a pinça de dissecação pressionada contra o fundo do recipiente. Usando a ferramenta de dissecação do hipocampo, desprenda suavemente os hemisférios corticais do mesencéfalo, mantendo o mesencéfalo no lugar e, idealmente, sem destacar os hemisférios corticais do restante do cérebro; agora o hipocampo está exposto. Pegue a ferramenta de dissecação do hipocampo e retire o hipocampo de um dos hemisférios.
Em seguida, use a agulha de dissecação para remover o máximo possível de tecido não-hipocampal. Após o primeiro hipocampo ser isolado e limpo, repita este processo para o segundo hipocampo do outro hemisfério. A seguir, use uma tesoura estéril para cortar a ponta de uma ponteira de pipeta filtrante P 1000.
Coloque a ponteira na pipeta estéril P 1000. Aspire suavemente um hipocampo e transfira-o para a folha de teflon no cortador de tecidos. Em seguida, coloque o segundo hipocampo no cortador da mesma maneira.
Posicione as metades do hipocampo com os lados côncavos voltados para baixo e alinhe-as perpendicularmente à lâmina; aspire o excesso de líquido da folha de teflon. Ajuste o micrômetro na posição zero. Corte os hipocampos em seções de 400 micrômetros.
Prepare outro tubo de ponta P 1000 cortado e acople-o a uma pipeta estéril P 1000. Despeje aproximadamente 10 mililitros de SCM frio em uma placa de cultura de tecidos estéril de 60 milímetros. Usando a pipeta, adicione meio e transfira as fatias de hipocampo do cortador para a placa.
Evite formar bolhas; após repetir o processo de transferência para todas as fatias, coloque a placa sob o microscópio estereoscópico. Finalmente, utilizando uma espátula de íris e uma espátula reta, separe suavemente as fatias umas das outras.
Sequencie as fatias bem definidas e sem danos, separando-as das fatias danificadas. As fatias de hipocampo bem definidas estão agora prontas para serem cultivadas. Remova do incubador as placas de cultura de tecidos de seis poços previamente preparadas, contendo SCM e inserts para cultura celular, utilizando uma pipeta P1000 com ponteira larga cortada, e transfira quatro a cinco fatias individuais por membrana.
Quando necessário, utilize a espátula de íris para separar as fatias. Tenha cuidado para não colocar as fatias muito próximas à parede do inserto ou muito próximas umas às outras. Tendo o cuidado de não tocar nas fatias, aspire qualquer meio em excesso da superfície superior do cultivo celular.
Insira a membrana. Por fim, retorne a placa, que agora contém os cultivos de fatias hipocampais, ao incubador de cultura de tecidos. Ajuste para 35 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após 48 horas, retire a placa do incubador trabalhando dentro da cabine de cultura de tecidos. Aspire o meio com uma pipeta posterior. Adicione 750 microlitros de SCM fresco pré-aquecido por poço.
Mais uma vez, certifique-se de que não se formem bolhas sob a membrana do inserto de cultura celular. Este é um exemplo de um corte hipocampal saudável, pronto para ser cultivado. As regiões CA1, CA3 e giro denteado do hipocampo são claramente visíveis e estão intactas.
É mostrado aqui um corte hipocampal danificado, não utilizado para cultura. Finalmente, este é um exemplo de um corte hipocampal saudável após quatro dias em cultura. Observe que o corte apresenta aparência branca ao microscópio estereoscópico e a superfície do corte está limpa.
As regiões do hipocampo, CA um, CA três e giro denteado, são claramente visíveis e estão intactas. Após dominá-la, esta técnica pode ser realizada em cerca de uma hora, se executada corretamente.
Ao realizar este procedimento, é muito importante lembrar-se de utilizar técnicas apropriadas com esteroides e de ser gentil com o tecido. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar organotipicamente. Lisado hipocampal.
Obrigado e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para o cultivo de fatias organotípicas do hipocampo, que pode ser adaptado para outras regiões cerebrais. A técnica preserva a arquitetura do hipocampo por até duas semanas em cultura.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Cultura Celular
- Pesquisa em Hipocampo
Contexto
- Os cultivos organotípicos são essenciais para o estudo da fisiologia cerebral.
- As fatias do hipocampo mantêm as conexões sinápticas e a arquitetura celular.
- Os métodos existentes podem não preservar a integridade do tecido durante períodos prolongados de cultivo.
- Este método tem como objetivo melhorar a viabilidade e a utilidade das fatias cerebrais na pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para o cultivo de fatias hipocampais.
- Permitir o estudo da função hipocampal em um ambiente controlado.
- Fornecer um protocolo que possa ser adaptado para outras regiões cerebrais.
Métodos Utilizados
- Dissecação do hipocampo a partir do tecido cerebral.
- Seccionamento do hipocampo em cortes finos.
- Classificação e separação dos cortes hipocampais.
- Cultivo dos cortes em membranas porosas com interface de meio.
Resultados Principais
- Preservação bem-sucedida da arquitetura do hipocampo por duas semanas.
- Fragmentos organotípicos saudáveis visualizados utilizando microscópios de dissecação ou microscópios ópticos.
- Adaptabilidade do método para outras regiões cerebrais demonstrada.
- Potencial para estudos adicionais sobre a função e a patologia do hipocampo.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem robusta para o cultivo de fatias hipocampais.
- Permite períodos prolongados de estudo mantendo a integridade do tecido.
- Aplicações futuras podem aprimorar a compreensão da função cerebral e das doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os cultivos de fatias hipocampais organotípicas fornecem um sistema ex vivo fisiologicamente relevante para investigar mecanismos sinápticos, permitindo manipulação genética e farmacológica precisa enquanto preservam a arquitetura nativa do tecido. Esta plataforma apoia a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos em neurociência, preenchendo a lacuna entre ensaios in vitro e modelos in vivo. Sua adaptabilidade e reprodutibilidade tornam-no um recurso valioso para triagem de portfólios e continuidade da pesquisa translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação funcional de proteínas sinápticas em um contexto de circuito neural preservado.
- Apóia a redução de riscos mecanicistas ao manter a conectividade e a arquitetura hipocampais nativas.
- Facilita a manipulação genética e a elucidação de vias por meio de abordagens virais ou biolísticas.
- Oferece um sistema robusto para avaliar o engajamento do alvo e a relevância biológica.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara sistemas de tecido neural validados e reproduzíveis para triagem de compostos em etapas subsequentes.
- Permite imagens quantitativas e leituras eletrofisiológicas para padronização de ensaios.
- Permite a preparação escalonável de fatias para testes farmacológicos em paralelo.
- Permite a avaliação confiável dos efeitos de compostos sobre função sináptica e plasticidade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se à circuitaria neural relevante para doenças, permitindo a exploração de biomarcadores translacionais.
- Mantém a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, preservando a complexidade tecidual.
- Reduz o risco translacional ao fornecer dados preditivos sobre modulação sináptica.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em respostas funcionais do tecido.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Os cultivos de fatias hipocampais organotípicas integram-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial de alvos até a identificação de compostos líderes e a pesquisa pré-clínica, apoiando testes iterativos de hipóteses e avaliação mecanicista.
- Biologia da Descoberta: Permite testes baseados em hipóteses da função sináptica e modulação de vias em um ambiente semelhante ao natural.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para avaliação de compostos e desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Apoia ensaios de imagem, eletrofisiologia e análises bioquímicas para comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta estudos in vitro e in vivo ao preservar a arquitetura neural relevante para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e adaptável para uso repetido em programas de P&D em neurociência.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Fornece preparações de tecidos padronizadas, reprodutíveis e escaláveis para equipes multifuncionais.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao fornecer dados pré-clínicos robustos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco dos ativos em neurociência.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação estéril, manipulação de tecidos e técnicas de cultura de fatias.
- Necessita de acesso a capelas de cultura de tecidos, microscópios e equipamentos especializados para corte.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para garantir reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Adaptável a outras regiões cerebrais com modificações no protocolo, conforme suportado pelo método.
- Depende de manipulação cuidadosa para manter a viabilidade das fatias e minimizar contaminações.
