Name: Quantificação de dsDNA usando a Hitachi F-7000 Espectrofotômetro de Fluorescência e PicoGreen Dye (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a quantificar dsDNA usando o espectrofotômetro de fluorescência Hitachi F-7000 com corante PicoGreen. Este método estabelece uma curva de calibração linear para medições precisas de DNA em pesquisa biológica.

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1. Configuração do Instrumento <ol><li> Ligue o espectrofluorímetro e deixe aquecer por 1 hora. </li><li> Usando o Excel cria um arquivo com as Normas e os dados da amostra, como mostrado na Figura 1 e salve-o em comma separated values ​​"csv" formato. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Padrões e dados de amostras. </li><li> Configurar fluorímetro da seguinte forma: <ol><li> Clique na <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="Ícone de uma"> botão, isto irá abrir a janela de Método de Análise, mostrado na Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. Janela Método de Análise, na guia Geral. Faça as seguintes seleções: <ul><li> Na "medição" de campo, selecione Fotometria do menu suspenso. </li><li> Em "Operador", digite o nome do operador apropriado. </li><li> Não há necessidade de inserir informações no "Instrumento" campo. Esta é selecionado automaticamente pelo software. </li><li> A "amostragem" de campo é inativa quando se utiliza o leitor de microplacas. </li><li> Digite comentários que você pode querer incluir no relatório no campo "Comentários". </li><li> No "acessório" de campo, insira as informações relacionadas com os acessórios utilizados para este teste. </li><li> Nota os botões do lado direito da janela. </li><li> O botão "Load" permite carregar Métodos de Análise salvo anteriormente. </li><li> O botão "Salvar" permite a atualização de um conjunto de parâmetros de teste ou método de análise anteriormente salvo e carregado, usando o mesmo nome. </li><li> O "Salvar como" botão permite salvar um novo conjunto de parâmetros de teste ou Método de Análise com um nome desejado. </li></ul> Agora clique em "quantificação" guia, veja a Figura 3 e faça as seguintes seleções. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3. Janela Método de Análise, guia quantitativa. <ul><li> No "A determinação quantitativa do tipo" campo, selecione Wavelength. Isto indica a leitura de fluorescência será feita utilizando o comprimento de onda selecionado. </li><li> Na "calibragem" tipo de campo, selecione 1 ª ordem. </li><li> No "Número de comprimentos de onda" de campo, selecione 1. </li><li> Na "Concentração unidade" de campo, entrar ng / mL. </li><li> Deixe desmarcado as caixas para "Manual de Calibração" e "Força através da curva de zero". </li><li> No "Digit após ponto decimal" campo, selecione 2. </li><li> Na "Baixa-limite de concentração", digite 0. </li><li> No campo limite "superior de concentração, digite 10000. </li></ul> Agora clique em "Instrumento" guia e faça as seguintes seleções. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="Figura 4"> Figura 4. Janela de análise do método, guia Instrumento <ul><li> No "modo de dados:" campo, selecione Fluorescência. </li><li> O "Chopping velocidade" campo está inativo no momento, ele é usado somente para medições de fosforescência. </li><li> No "modo de comprimento de onda" de campo, selecione Ambos fixo WL. </li><li> Na "EX / WL1" field entrar 480nm. </li><li> No "EM / WL1" field entrar 520nm. </li><li> Todos os outros campos sob EX e EM estão inativos no momento. </li><li> Na "EX fenda" campo selecione 5.0nm do menu suspenso. </li><li> No "EM fenda" campo selecione 5.0nm do menu suspenso. </li><li> Deixe desmarcada a caixa na frente da "Tensão PMT 1-1000V" campo. </li><li> No "PMT Voltage" campo, selecione 700V do menu suspenso. </li><li> No "Auto calc estatística. Número" campo selecione 2. </li><li> No "Replica" campo selecione 1. </li><li> No "tempo de integração" campo selecionar 0.1s. &lt;/ Li&gt; </li><li> No "Delay" campo de digitar ou selecionar 0s. </li></ul> Clique no separador "Monitor". <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="Figura 5"> Figura 5. Janela de análise do método, guia Monitor. <ul><li> No "eixo Y", "Max:" campo, selecione 10000 </li><li> No "eixo Y", "Min:" campo, selecione 0. </li><li> Selecione a caixa à esquerda do "Aberto de processamento de dados após a aquisição de dados". </li><li> Deixe desmarcada a caixa à esquerda do "relatório de impressão depois de aquisição de dados", a menos que você queira um relatório a ser impresso automaticamente após as leituras sejam concluídas. </li></ul> Clique no botão "Report" guia, veja a Figura 6. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="Figura 6"> Figura 6. Janela de análise do método, guia do relatório. <ul><li> Na "saída" de campo, selecionar Imprimir relatório do menu suspenso. Você também pode selecionar "Use Microsoft Excel" se você deseja que os dados exportados para o Excel, ou "Use Folha Generator Imprimir" se estiver usando o suplemento opcional no Gerador de Relatórios programa que permitirá gerar relatórios personalizados feitos. </li><li> Clique nas caixas para os itens que você quer ser incluído no relatório. </li><li> Para salvar todos os parâmetros selecionados nas diferentes guias do "Método de Análise" janela, clique novamente na guia "Geral" e salvá-las sob um nome de arquivo e em um local onde você pode encontrá-los para uso futuro, e clique no botão " OK "para fechar esta janela. </li><li> Isso completa a criação de parâmetros de teste do instrumento. </li><li> Agora vamos configurar o leitor de microplaca. </li><li> Clique na <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="Ícone 2"> botão, que trará a janela de configuração do MPR em cima. </li></ul> Selecione poços para os Padrões e amostras na guia Configurar MPR Window / Plate, como mostrado na Figura 7. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="Figura 7"> Figura 7. MPR janela de instalação, guia Plate. <ul><li> Clique na posição A1 e arraste o mouse para E1, em seguida, clique na <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="Ícone 3"> botão. Isso irá selecionar as posições a serem utilizados para os padrões. Essas posições será destaque na cor verde. </li><li> Agora, precisamos selecionar as posições a F1 H3 para as amostras. Clique e arraste o mouse a partir de F1 posição, a posição H3 e depois clique no <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="Ícone 4"> botão, isto irá destacar as posições na cor amarela. </li><li> Em seguida, repita a mesma operação para os cargos de A2 E3, para selecionar as posições para medições da amostra. </li><li> Agora, vamos carregar o arquivo Comma Separated arquivo (csv) Variável preparado com antecedência com as Normas e informação de amostra. </li></ul> Clique no botão "Bem informações" guia da "janela de configuração do MPR", como mostrado na Figura 8. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="Figura 8"> Figura 8. MPR janela de instalação, guia de informação bem. <ul><li> Em seguida, clique na <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="Ícone 5"> botão. Uma janela do Windows Explorer será aberto que, como mostrado na Figura 9, o que permitirá localizar o "Bem information.csv" arquivo e carregá-lo. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="Figura 9"> Figura 9. Carregando informações de amostra bem. Depois de carregar o "Bem informações" arquivo, a "informação Bem" vai olhar como mostrado na Figura 10 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="Figura 10"> Figura 10. Carregado de informações de amostra bem. </li></ul></li></ol></li></ol> 2. Picogreen Preparação de amostras de Ensaio <ol><li> Prepare 1X tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), adicionando 1 mL de 20 X tampão TEa 19 mL dI H 2 O. </li><li> Prepare PicoGreen Solução Reagente pela adição de 50 mL 200 X Reagente PicoGreen para 9,95 1 X mL tampão TE. </li><li> Elaborar normas (Lambda dsDNA) fazendo diluições em série de ações dsDNA (100 mcg / mL). Primeiro preparar uma solução de 50 mg / mL dsDNA adicionando 25 mL de estoque dsDNA (100 mcg / mL) e 25 mL 1 x tampão TE. Em seguida, preparar as soluções padrão, adicionando os volumes indicados de dsDNA e buffer como listadas na tabela abaixo: <table border="1"><tbody><tr><td> Concentração de dsDNA </td><td> Volume de dsDNA </td><td> Volume de Tampão </td></tr><tr><td> 1 mg / mL </td><td> 20 mL de 50 mcg / mL dsDNA </td><td> 980 mL 1 X tampão TE </td></tr><tr><td> 0,1 g / mL </td><td> 100 L de 1 mg / mL dsDNA </td><td> 900 mL 1 X tampão TE </td></tr><tr><td> 0,01 mcg / mL </td><td> 100 L de 0,1 mcg / mL dsDNA </td><td> 900 mL 1 X tampão TE </td></tr><tr><td> 0,001 mg / mL </td><td> 100 L de 0,01 mcg / mL dsDNA </td><td> 900 mL 1 X tampão TE </td></tr></tbody></table></li></ol> 3. Medição de Padrões e fluorescência da amostra <ol><li> Pipetar 150 mL de cada padrão em poços A1-E1 de uma placa de 96 poços, por Figura 7, e de acordo com a tabela a seguir: <table border="1"><tbody><tr><td> Bem </td><td> Padrão </td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1 mg / mL </td></tr><tr><td> B1 </td><td> 0,1 g / mL </td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0,01 mcg / mL </td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0,001 mg / mL </td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 X tampão TE </td></tr></tbody></table></li><li> Pipetar 150 mL amostras desconhecidas em poços de F1 H3, mostrado na Figura 7 </li><li> Despeje PicoGreen solução preparada na etapa 1,2 em uma calha projetado para multi-canal de uso da pipeta. Use uma pipeta multi-canal para fornecer solução de 150 mL PicoGreen aos poços A1-H3. Solução de misturar e padrões cuidadosamente com pipeta. </li><li> Colocar a placa na área escura e esperar 2-5 minutos para a reação para se desenvolver. </li></ol> 4. Resultados representante A curva de calibração bom é avaliado utilizando os diferentes parâmetros fornecidos pelo software F-7000 em cima da medida das normas e cálculo da curva de calibração pelo software. O coeficiente de determinação indica a qualidade do ajuste dos padrões de medida e calculada a curva de calibração. Quanto mais próximo este valor é "1", melhor o ajuste do valor medido e curva de calibração. Se o valor está longe de "1", as normas devem ser reavaliados, preparado novamente, ou a adequação da curva de calibração mudou. A Figura 11 mostra um exemplo de uma curva de calibração com um coeficiente de determinação calculado = 0,99993, obtidos para a quantificação de dsDNA usando PicoGreen corante. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="Figura 11"> Figura 11. Exemplo de dsDNA curva de calibração.

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li>
</ol>

Luis A. Moreno e Kendra L. Cox são empregados por Hitachi High Technologies Latina que produz o instrumento utilizado neste artigo.

Pipetagem cuidadosa durante a preparação da amostra, bem como a utilização de um espectrofotômetro de fluorescência estável e sensível é essencial para obter bons resultados e reprodutíveis. No caso do espectrofotômetro de fluorescência utilizado para este teste, sugere-se com 300 mL de amostra de volume final no leitor de microplacas. Menor volume diminui a sensibilidade, e um volume maior pode causar contaminação cruzada entre os poços.

<table><tbody><tr><td>Água destilada H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio Quant-iT Picogreen dsDNA da Invitrogen</td><td>Reagente</td><td></td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Placas microfluorométricas Nalge Nunc, n.º do produto 237108</td><td>Material</td><td></td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta microlitera de 12 canais Eppendorf</td><td>Material</td><td></td><td>3516677</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Eppendorf de 1000 &amp;mu;L</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Eppendorf de 200 &amp;mu;L</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 10 mL</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espetrofotômetro de fluorescência Hitachi F-7000 com FL Solutions 2.1</td><td>Equipamento</td><td></td><td>5J1-0003</td><td></td></tr><tr><td>Acessório para leitora de microplacas para F-7000</td><td>Equipamento</td><td></td><td>5J0-0139</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de dsdna usando a hitachi f-7000 espectrofotômetro de fluorescência e picogreen dye

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantificação de DNA, especialmente em pequenas concentrações, é uma tarefa importante, com uma ampla gama de aplicações biológicas, incluindo padrão ensaios de biologia molecular, tais como síntese e purificação do DNA, aplicações de diagnóstico, tais como a quantificação de produtos de amplificação de DNA, e detecção de moléculas de DNA em drogas preparações. Durante este vídeo vamos demonstrar a capacidade do espectrofotômetro Hitachi F-7000 de fluorescência equipado com um acessório Placa Micro Reader para realizar dsDNA quantificação usando Molecular Probes Quant-it PicoGreen kit reagente corante. O Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000 oferece alta sensibilidade e medições em alta velocidade. É um sistema altamente flexível, capaz de medir a fluorescência, luminescência, e fosforescência. Vários modos de medição estão disponíveis, incluindo comprimento de onda de digitalização, digitalizar tempo, fotometria e 3-D de medição de varredura. O espectrofotômetro tem sensibilidade na faixa de 50 picomoles de fluoresceína quando se utiliza um volume de amostra 300 mL na microplaca, e é capaz de medir velocidades de digitalização de 60.000 nm / minuto. Ele também tem uma ampla faixa dinâmica de até 5 ordens de magnitude, que permite o uso de curvas de calibração em uma ampla faixa de concentrações. O sistema óptico utiliza todos óptica reflexiva para o máximo de energia e sensibilidade. A faixa de comprimento de onda padrão é de 200 a 750 nm, e pode ser estendido a 900 nm quando se usa um dos opcionais perto fotomultiplicadores infravermelho. O sistema permite o controle de temperatura opcional para o leitor de placas 5-60 graus Celsius usando um externo opcional de temperatura controlada circulador de líquido. O leitor de microplaca permite o uso de 96 microplacas bem, ea velocidade de medição para 96 ​​poços é menos de 60 segundos ao usar o modo cinética. Controles de software para a F-7000 e Leitor de Microplacas também são altamente flexíveis. As amostras podem ser definidos em formatos uma coluna ou linha, e qualquer combinação de poços podem ser escolhidas para medições da amostra. Isto permite uma utilização óptima da microplaca. Além disso, o software permite importar as configurações da placa micro amostra criados no Excel e salvas em valores separados por vírgula, ou &quot;csv&quot; formato. Configurações microplaca de medição podem ser salvas e recuperadas pelo software para a conveniência e aumento da produtividade. Resultados dos dados pode ser saída para um relatório padrão, para o Excel, ou para um programa opcional Report Generator.

Demonstração de quantificação de dsDNA usando Molecular Probes PicoGreen corante e Hitachi Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000 equipado com um acessório de leitor de microplacas.

Quantificação de dsDNA usando a Hitachi F-7000 Espectrofotômetro de Fluorescência e PicoGreen Dye

A quantificação de DNA, especialmente em pequenas concentrações, é uma tarefa importante com uma ampla gama de aplicações biológicas, incluindo a molecular padrão...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a capacidade do espectrofotômetro de fluorescência F 7,000 com leitor de microplacas de realizar a quantificação de DNA de dupla fita utilizando o corante Pico green. Isso é realizado primeiramente preparando as amostras e os reagentes. O segundo passo do procedimento é configurar o instrumento.O terceiro passo do procedimento é carregar as amostras no leitor de microplacas. O passo final do procedimento é realizar a medição dos padrões e das amostras. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram uma curva de calibração linear, a qual pode ser utilizada para a quantificação de DNA de dupla fita em amostras desconhecidas.Ligue o Espectrofluorímetro Hitachi F 7,000 para permitir que a lâmpada de xenônio aqueça por uma hora no Excel. Crie um arquivo com os dados dos padrões e das amostras e salve-o em formato de valores separados por vírgula ou CSV. Para configurar o espectrofluorímetro primeiro, clique no botão de método que abre a janela de método de análise.No campo de medição, selecione fotometria no menu suspenso. Agora, clique na guia de quantificação. No campo de tipo de quantificação, selecione comprimento de onda para indicar que a leitura de fluorescência será feita usando um comprimento de onda específico.Para o tipo de calibração, selecione primeira ordem e, para o número de comprimentos de onda, selecione um. Insira nanogramas por mililitro como unidade de concentração. Certifique-se de que as opções de calibração manual e forçar a curva a passar pelo zero não estejam marcadas. Após a vírgula decimal, selecione dois, insira zero para o limite inferior de concentração e 10.000 para o campo do limite superior de concentração.Em seguida, clique na guia do instrumento e, no campo modo de dados, selecione fluorescência. Verifique se o campo velocidade de corte está inativo, pois é utilizado apenas em medições de fosforescência. No campo modo de comprimento de onda, selecione ambos WL fixo no campo ex WL um e insira 480 nanômetros no campo EM WL um.Digite 520 nanômetros. Mantenha todos os outros campos em EX e EM inativos. Ajuste a fenda de excitação e a fenda de emissão para 5,0 nanômetros.Usando os menus suspensos, mantenha a caixa diante do campo de tensão do PMT de um a 1000 volts desmarcada. Para a tensão do PMT, selecione 700 volts no menu suspenso. Além disso, selecione dois para o número de cálculo automático de estatísticas, um para réplicas, 0,1 segundos para o tempo de integração e zero para o atraso.Agora abra a guia monitor e defina o campo máximo do eixo y para 10.000 e o mínimo do eixo y para zero. Em seguida, selecione a caixa à esquerda de processar dados após a aquisição e, se necessário, a caixa à esquerda de imprimir relatório após a aquisição para gerar um relatório que será impresso automaticamente ao final das leituras. Por fim, para salvar todos os parâmetros selecionados nas diferentes guias da janela do método de análise, clique na guia geral e salve com um novo nome de arquivo em um local especificado.Clique no botão OK para fechar esta janela. Isso conclui a configuração dos parâmetros de teste do instrumento. Para configurar o leitor de microplacas, clique no botão MPR para trazer a janela de configuração do MPR para a frente.Primeiro, selecione os poços para os padrões. Por exemplo, clique na posição A1 e arraste o mouse até E1. Em seguida, clique no botão definir padrão.Isso selecionará as posições a serem usadas para os padrões, destacadas na cor verde. Em seguida, selecione as posições para as amostras. De forma análoga, clique e arraste o mouse sobre as posições correspondentes na placa e, então, clique no botão do conjunto de amostras, que automaticamente destacará as posições selecionadas em amarelo.Continue repetindo a mesma operação para as posições das medições de amostra desejadas. Para carregar as informações dos padrões e das amostras no arquivo de variáveis separadas por vírgula preparado anteriormente, clique na aba de informações dos poços da janela de configuração do MPR.Selecione o botão de informações do poço de carga e uma janela do Windows Explorer será aberta para identificar o arquivo csv de informações dos poços. Após carregar as informações, a janela deve exibir uma tabela. Para preparar uma solução de trabalho do reagente Pico Green, adicione 50 microlitros do reagente Pico Green 200 X a 9,95 mililitros de tampão TE.Para a curva padrão, prepare diluições seriadas de DNA duplo-filamento Lambda em tampão TE para concentrações finais variando de um a 100 nanogramas por mililitro; pipete 150 microlitros de cada padrão em poços designados de uma placa de 96 poços. Em seguida, pipete 150 microlitros de cada amostra teste nos poços correspondentes da placa. Agora, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 150 microlitros da solução Pico Green a cada poço e misture a solução e as amostras de DNA.Incube suavemente a placa em local escuro por dois a cinco minutos para que a reação se desenvolva. Clique no botão da tela de exibição do MPR para trazer a janela de configuração do MPR para a frente da tela e clique no botão de troca de posição. A plataforma de sustentação da microplaca mover-se-á para a frente do instrumento, abrirá a porta do leitor de microplacas e colocará a placa de 96 poços sobre a plataforma de sustentação com o poço A1 voltado para a frente, fechando em seguida a porta do leitor de microplacas.Clique no botão de posição inicial para posicionar o ponto A em um dos poços da microplaca na posição de medição. Clique no botão de exibição do monitor para trazer a janela de medição para o topo da tela. Clique no botão de medição para iniciar a leitura dos padrões e das amostras desconhecidas.Uma boa curva de calibração é avaliada utilizando os diferentes parâmetros fornecidos pelo software F 7,000. Por exemplo, esta curva de calibração ideal obtida para a quantificação de DNA de dupla fita utilizando o corante Pico Green apresenta um coeficiente de determinação calculado de 0,99993. O sistema de alto rendimento descrito é uma montagem em série de tecnologias que inclui o corante Pico Green, um espectrofotômetro de fluorescência Hitachi F 7,000, equipado com leitor de microplacas e um programa de software para automatizar a coleta, armazenamento, análise e apresentação de dados.A combinação de tecnologias avançadas pode atender à crescente necessidade de analisar com precisão pequenas quantidades de DNA de dupla fita.

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