Quantificação de dsDNA usando a Hitachi F-7000 Espectrofotômetro de Fluorescência e PicoGreen Dye
5 de novembro de 2010
Demonstração de quantificação de dsDNA usando Molecular Probes PicoGreen corante e Hitachi Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000 equipado com um acessório de leitor de microplacas.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a capacidade do espectrofotômetro fluorescente F 7.000 com leitor de microplacas para realizar a quantificação de DNA de fita dupla usando o corante verde Pico. Isso é feito preparando primeiro as amostras e reagentes. A segunda etapa do procedimento é configurar o instrumento.
A terceira etapa do procedimento é carregar amostras no leitor de microplacas. A etapa final do procedimento é realizar a medição de padrões e amostras. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram uma curva de calibração linear, que pode ser usada para quantificação de DNA de fita dupla de amostras desconhecidas.
Ligue o fluorímetro Hitachi F 7, 000 Spectra para permitir que a lâmpada de xenônio aqueça por uma hora no Excel. Crie um arquivo com os padrões e dados de amostra e salve-o em valores separados por vírgula ou formato CSV. Para configurar o fluorímetro primeiro, clique no botão do método que abre a janela do método de análise.
No campo de medição, selecione fotometria no menu suspenso. Agora clique na guia de quantificação. No campo do tipo de quantificação, selecione o comprimento de onda para indicar que a leitura de fluorescência será feita usando um comprimento de onda especificado.
Para o tipo de calibração, selecione primeira ordem e, para o número de comprimentos de onda, selecione um. Insira nanogramas por mililitro para a unidade de concentração. Certifique-se de que a calibração manual e a curva de força através de zero não estejam marcadas para dígito Após o ponto decimal, selecione dois, insira zero para o limite de concentração inferior e 10.000 para o campo de limite de concentração superior.
Em seguida, clique na guia do instrumento e, no campo do modo de dados, selecione fluorescência. Verifique se o campo de velocidade de corte está inativo, pois é usado apenas para medições de fosforescência. No campo de modo de comprimento de onda, selecione WL fixo no campo ex WL um, insira 480 nanômetros no campo EM WL um.
Digite 520 nanômetros. Deixe todos os outros campos em EX e EM como inativos. Defina a fenda ex e a fenda EM para 5,0 nanômetros.
Usando os menus suspensos, deixe a caixa na frente do campo PMT voltage de um a 1000 volts desmarcado. Para o volume PMT, selecione 700 volts no menu suspenso. Além disso, selecione dois para cálculo de estatística automática número um para replicações 0,1 segundos para tempo de integração e zero para atraso.
Agora abra a guia do monitor e defina o campo por que o eixo máximo é 10.000 e o eixo mínimo é zero. Em seguida, selecione a caixa à esquerda do processamento de dados aberto após a aquisição de dados e, se necessário, a caixa à esquerda do relatório de impressão após a aquisição de dados para um relatório que deve ser impresso automaticamente após a conclusão das leituras. Finalmente, para salvar todos os parâmetros selecionados nas diferentes guias da janela do método de análise, clique na guia geral e salve com um novo nome de arquivo em um local especificado.
Clique no botão OK para fechar esta janela. Isso conclui a configuração dos parâmetros de teste do instrumento. Para configurar o leitor de microplacas, clique no botão MPR para trazer a janela de configuração MPR para a frente.
Primeiro selecione poços para os padrões. Por exemplo, clique na posição A um e arraste o mouse para E um. Em seguida, clique no botão de conjunto padrão.
Isso selecionará as posições a serem usadas para os padrões, conforme destacado na cor verde. Em seguida, selecione as posições para as amostras. Da mesma forma, clique e arraste o mouse sobre as posições correspondentes na placa e, em seguida, clique no botão de conjunto de amostras, que destacará automaticamente as posições selecionadas em amarelo.
Continue a repetir a mesma operação para as posições das medições de amostra desejadas. Para carregar os padrões e informações de amostra no arquivo de variável separado por vírgula preparado anteriormente. Clique na guia de informações do poço da janela de configuração do MPR.
Selecione o botão carregar informações do poço e uma janela do Windows Explorer será aberta para identificar o arquivo csv de pontos de informações do poço. Depois de carregar as informações, a janela deve ser exibida como uma tabela. Para preparar uma solução de trabalho de reagente verde Pico, adicione 50 microlitros de reagente verde pico 200 X a 9,95 mililitros de tampão TE.
Para a curva padrão, prepare diluições seriais de DNA de fita dupla Lambda em tampão TE para concentrações finais, variando de um a 100 nanogramas por mililitro pipeta 150 microlitros de cada padrão em poços designados de uma placa de 96 poços. Em seguida, pipete 150 microlitros de cada amostra de teste nos poços designados correspondentes da placa. Agora, usando uma pipeta múltipla, adicione 150 microlitros de solução verde Pico a cada poço e misture a solução e as amostras de DNA.
Incube suavemente a placa em uma área escura por dois a cinco minutos para que a reação se desenvolva. Clique no botão da tela de exibição MPR para trazer a janela de configuração MPR na parte superior da tela e clique no botão de posição de troca. A plataforma de fixação de microplacas se moverá em direção à frente do instrumento, abrirá a porta do leitor de microplacas e colocará a placa de 96 poços na plataforma de retenção com o poço A voltado para a frente e fechará a porta do leitor de microplacas.
Clique no botão de posição inicial para colocar a posição A uma das microplacas na posição de medição. Clique no botão de exibição do monitor para trazer a janela de medição para cima da tela. Clique no botão de medição para começar a medir os padrões e amostras desconhecidas.
Uma boa curva de calibração é avaliada usando os diferentes parâmetros fornecidos pelo software F 7.000. Por exemplo, esta curva de calibração ideal obtida para quantificação de DNA de fita dupla usando corante verde Pico calculou um coeficiente de determinação de 0,99993. O sistema de alto rendimento descrito é um conjunto serial de tecnologias, incluindo o Pico Green Dye, um espectrofotômetro fluorescente Hitachi F 7.000, equipado com leitor de microplacas e um programa de software para automatizar a coleta de dados, análises de armazenamento e apresentação.
A combinação de tecnologias poderosas pode atender à crescente necessidade de analisar com precisão pequenas quantidades de fita dupla. ADN.
Visão geral
Este artigo demonstra a quantificação de DNA de fita dupla (dsDNA) usando o corante PicoGreen e o espectrofotômetro de fluorescência Hitachi F-7000 com um leitor de microplacas. O procedimento descreve a preparação de amostras, configuração do instrumento e processos de medição para obter uma curva de calibração linear para quantificação de dsDNA.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Espectroscopia de fluorescência
- Quantificação de DNA
- Tecnologia de leitor de microplacas
Fundo
- O corante PicoGreen é um corante fluorescente sensível usado para quantificar dsDNA.
- O Hitachi F-7000 é um espectrofotômetro de fluorescência versátil.
- A quantificação precisa de DNA é essencial para vários experimentos biológicos.
- Sistemas de alto rendimento facilitam a análise de múltiplas amostras simultaneamente.
Objetivo do estudo
- Demonstrar a capacidade do espectrofotômetro F-7000 para quantificação de dsDNA.
- Estabelecer um método confiável para medir amostras de DNA desconhecidas.
- Criar uma curva de calibração linear para quantificação precisa.
Métodos utilizados
- Preparação do reagente PicoGreen e padrões de DNA.
- Configuração dos parâmetros do espectrofotômetro Hitachi F-7000.
- Carregamento de amostras no leitor de microplacas.
- Medição da fluorescência para gerar uma curva de calibração.
Principais resultados
- Foi estabelecida uma curva de calibração linear para quantificação de dsDNA.
- O método demonstrou alta sensibilidade e precisão.
- Os resultados mostraram um coeficiente de determinação de 0,99993.
- O sistema efetivamente analisou pequenas quantidades de dsDNA.
Conclusões
- A combinação do corante PicoGreen e o espectrofotômetro F-7000 fornece um método robusto para quantificação de DNA.
- Esta abordagem de alto rendimento atende às demandas de análise precisa em pesquisas biológicas.
- O método pode ser aplicado a vários estudos que requerem medições precisas de DNA.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of double-stranded DNA is a foundational requirement for target validation, assay development, and preclinical model generation in biopharma R&D. The Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with PicoGreen dye enables high-sensitivity, high-throughput measurement of dsDNA, supporting reliable standard curve generation for downstream applications. This method provides predictive confidence in nucleic acid quantification, reducing variability in early discovery workflows and enabling scalable, reproducible data generation across compound screening and biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise measurement of dsDNA concentrations for cloning, transfection, and PCR-based target validation assays.
- Operational Value: Supports reproducible sample preparation and quantification, reducing technical variability in hypothesis-driven experiments.
- Predictive Value: Generates linear calibration curves with high determination coefficients (R² > 0.999), ensuring accurate quantification of unknown samples in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative fluorescence readouts compatible with 96-well formats for assay standardization and reagent titration.
- Operational Value: Enables rapid measurement of 96 wells in under 60 seconds using kinetics mode, supporting high-throughput screening readiness.
- Scalability: Software allows saving and recalling microplate configurations, facilitating consistent assay setup across teams and projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Delivers reliable dsDNA quantification for biomarker analysis, PCR validation, and vector production in preclinical models.
- Risk Mitigation: High sensitivity (50 picomoles fluorescein equivalent) and wide dynamic range (5 orders of magnitude) allow accurate quantification across dilution series, reducing false negatives in low-abundance targets.
- Workflow Integration: Outputs data to Excel or report formats, enabling seamless transfer to bioinformatics and analytical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical development, where accurate nucleic acid quantification is essential for experimental reproducibility and data integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise dsDNA measurement for cloning efficiency, gene expression analysis, and mutagenesis studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs that support assay robustness and compound library normalization.
- Analytics: Generates linear calibration curves and determination coefficients (R²) that allow inter-experiment comparison and quality control.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through reliable quantification of DNA in drug formulations, viral vectors, and biomarker assays.
- Enterprise Reuse: Configurable software and standardized protocols allow reuse across departments, reducing method redevelopment and increasing operational efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High sensitivity and specificity for dsDNA reduce false signals and improve data confidence in molecular assays.
- Operational Value: Automated data collection, storage, and presentation via software minimize manual handling and transcription errors.
- Strategic Value: Reliable quantification supports go/no-go decisions in lead optimization by ensuring accurate dosing and normalization in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing trustworthy nucleic acid data for candidate selection and formulation studies.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence spectroscopy and microplate reader operation.
- Necessitates access to Hitachi F-7000 spectrophotometer with microplate reader accessory and compatible software.
- Demands standardized reagent preparation (PicoGreen dilution in TE buffer) and sample handling to avoid fluorescence quenching.
- Involves optimization of incubation time (2–5 minutes in dark) and wavelength settings (Ex 480 nm, Em 520 nm) for signal consistency.
- Includes practical limitations such as the need for dark incubation and potential interference from contaminants or organic solvents.
