Entrega direta da MIF Morpholinos Into the Otocyst Zebrafish por injeção e Eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna

O objetivo geral do experimento a seguir é fornecer antissenso, oligonucleotídeo, morfos ou outras moléculas perturbadoras de desenvolvimento diretamente na ótica do peixe-zebra no estágio de um dia ou 24 horas após a fertilização. Neste exemplo, usamos morphos morphos para a primeira neurotrofina responsável pelo desenvolvimento do gânglio acústico estático, uma citocina do sistema imunológico chamada migração de macrófagos, fator inibitório ou MIF, para determinar se os morphos para essa molécula afetam o desenvolvimento ou a neurogênese do ouvido interno. Isso é conseguido introduzindo primeiro Morphos no lúmen da vesícula ótica usando microinjeção e, em seguida, a eletroporação é realizada, o que facilita a penetração de morphos nas células da ótica a partir do lúmen.

Em seguida, os embriões são criados a 28,5 graus Celsius para observar os efeitos dos morfos no desenvolvimento e na neurogênese do ouvido interno. Nos próximos dias, são obtidos resultados que mostram uma diminuição das células ciliadas sensoriais da orelha interna, bem como uma diminuição da inervação pelo gânglio estatoacústico com base na imuno-histoquímica e foid e coloração, que marcam a tubulina acetilada em Kinocilia e o acton em Stereocilia na superfície das células ciliadas, respectivamente. Originalmente, desenvolvemos este método de injeção e eletroporação de morfos no embrião de galinha e um estudante de graduação muito talentoso no laboratório.

Katie Holmes reduziu com sucesso para as dimensões do peixe-zebra. A equipe de pesquisa atual, incluindo Yuchi, ela um pós-doutorado, e Matt Wyatt, um estudante de pós-graduação e um ex-pós-doutorado no laboratório, Deb Thompson refinou essa técnica para o peixe-zebra. Espera-se que este método possa responder a questões-chave nos campos da biologia do desenvolvimento e da pesquisa auditiva, incluindo se os efeitos específicos do morfogênio em um sistema de órgãos como o ouvido podem ser distinguidos dos efeitos generalizados do desenvolvimento que afetam muitos sistemas de órgãos e são secundários no ouvido, por exemplo, efeitos no cérebro que afetam secundariamente o ouvido.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como microinjeções em um a quatro estágios celulares, é que esse método introduz diretamente os morfos no ouvido em estágios posteriores. Assim, nos efeitos diretos das morfoses na marca, esse efeito secundário do ouvido interno pode ser evitado Para fazer eletrodos, comece cortando fio de tungstênio de 75 micrômetros de diâmetro com cerca de três a cinco centímetros de comprimento. Coloque o fio de tungstênio através de um conector de cabo Molex.

Em seguida, enrole os fios de tungstênio e o conector do cabo Molex com um tubo retrátil e aplique calor com um bico de bunsen ou uma pistola de calor para vedar o tubo retrátil ao fio. Em seguida, para afiar a ponta do fio de tungstênio, mergulhe o fio em um hidróxido de sódio normal e, usando um clipe de papel como o outro eletrodo, eletrolise o fio com um eletro de onda quadrada. As condições que usamos são cinco pulsos de 50 volts, cada um com duração de 100 milissegundos com 50 milissegundos entre os pulsos.

Efectuar três repetições com a ponta do eléctrodo submersa num hidróxido de sódio normal. Insira o eletrodo um pouco mais no hidróxido de sódio e faça mais uma repetição. Insira o eletrodo ainda mais, ainda avançando o eletrodo aproximadamente na mesma distância nas duas vezes e faça uma última repetição.

Essa nitidez graduada produz uma ponta muito fina no eletrodo, permitindo uma inserção mais precisa e menos prejudicial dos eletrodos no embrião de peixe-zebra em desenvolvimento. Mantenha os fios pressionados na massa de modelar em uma bandeja antes de usar para eletroporação para microinjeção de morfos em vesículas óticas de peixe-zebra. Primeiro, configure tanques de reprodução com uma divisória de plástico para separar os machos das fêmeas à noite.

Coloque quatro machos e quatro fêmeas no tanque e deixe o tanque em uma sala de incubação com um ciclo de 14 a 10 claros durante a noite. Na manhã seguinte, depois que as luzes forem acesas, puxe a divisória e deixe o peixe intacto por cerca de 20 a 30 minutos. Separe os machos das fêmeas e remova os criadores do tanque de reprodução.

Coloque-os em tanques contendo água fresca para peixes. Colha os embriões do tanque de reprodução despejando o ovo contendo água através de uma peneira. Lave os ovos na peneira várias vezes com água fresca antes de escorrer para uma placa de Petri.

Remova todos os ovos não fertilizados ou opacos e incube os embriões em meio de criação de embriões com 0,3 PP m de azul de metileno a 28,5 graus Celsius durante a noite enquanto os embriões incubam. Puxe as agulhas de vidro com um extrator de eletrodo Sutter P 97 antes da injeção. Aqueça uma base de gel AROS consistindo de 1% de agros em água de peixe em uma placa de Petri de 10 milímetros a 37 graus Celsius em banho-maria, 1% de baixo ponto de fusão AGROS ou LMPA em água de peixe até derreter e mantenha-o aquecido em banho-maria de 37 graus Celsius.

Encha uma agulha de vidro com uma solução morpho e corte a ponta no diâmetro apropriado. Aproximadamente 10 a 15 mícrons. Monte a agulha de injeção em um micro manipulador que é conectado a uma bomba pneumática PV oito 20 pico com tanque de nitrogênio dec coate os embriões 24 horas após a fertilização e anestesiá-los com trica em 0,3 PPM de água de peixe azul de metileno.

Em seguida, alinhe três a cinco embriões anestesiados na base de gel AROS com o lado direito para cima para uma análise uniforme conveniente, coloque uma a duas gotas de 1% de LMPA sobre cada embrião e deixe-o solidificar para fixar o embrião no lugar. Gire a placa de Petri para que a vesícula ótica fique do lado direito. Em seguida, coloque a agulha no lúmen da vesícula ótica e injete a solução morfológica usando o pedal.

Imediatamente após a microinjeção, mova os embriões montados para a estação de eletroporação para configurar a estação de eletroporação. Primeiro cole os eletrodos de tungstênio afiados de 75 micrômetros nos micromanipuladores. Em seguida, coloque os manipuladores micrométricos em ambos os lados do estágio do microscópio de dissecação.

Ligue o eletro e configure os parâmetros para eletroporação. Os parâmetros mais eficazes. Para este experimento, foram encontrados três pulsos de 13 volts em dois milissegundos, cada um com 100 milissegundos entre cada pulso.

Insira os eletrodos de forma que a vesícula ótica seja flanqueada uniformemente com um eletrodo superficial à vesícula ótica e o outro profundamente à vesícula ótica. Em seguida, aplique uma corrente usando um pedal ou pressionando um interruptor quando a eletroporação terminar. Despeje água de peixe no aros e remova os embriões usando uma pipeta de vidro e girando suavemente a placa.

Tenha cuidado para não danificar os embriões para embriões difíceis de remover. Use uma agulha para quebrar suavemente qualquer LMPA ao seu redor. Transfira os embriões para uma placa com água de peixe azul de metileno e eleve os embriões aos estágios desejados para imuno-histoquímica morfológica.

Em C dois hibridização e análise microscópica, resultados representativos de injeção de orelha e eletroporação de morfos são mostrados aqui. O PM macular posterior ou auditivo marcado é um dos órgãos auditivos do peixe quando é rotulado com vermelho Phin. Nesta fotografia, os feixes de acton nos estereocílios nas células ciliadas sensoriais aparecem como pontos vermelhos no pingue-pongue.

A mácula em forma de pá, como visto pela marcação fluorescente com Phin três dias após a fertilização, embrião injetado com MIF morfos mostra apenas mais filamentos de actina dentro dos estereocílios nas células ciliadas quando comparado com embriões da mesma idade que foram eletro e injetados. No entanto, a injeção e a eletroporação com o morfo controle padrão não causaram redução do F e da coloração em comparação com a injeção apenas do morfo. Os resultados são semelhantes na mácula posterior, embora menos dramáticos após cinco dias em larvas que foram injetadas e eletroporadas quando comparadas com o embrião que foi injetado apenas com MIF Morphoses.

Não houve diferença entre injeção apenas e injeção com eletroporação quando o morph de controle padrão foi usado. Este embrião, que é corado com um anticorpo contra a tubulina acetilada, não recebeu nenhuma injeção ou eletroporação de morfoses do MIF. Este embrião foi eletroporado, mas não recebeu injeção.

Ambos os embriões apresentam coloração normal de tubulina acetilada. Esses embriões foram injetados e eletroporados. Eles tinham uma coloração de tubulina visivelmente diminuída em comparação com os controles e muito menos processos neuronais associados à orelha associada, bem como aos gânglios circundantes.

Quando o morfo controle foi usado para injeção e eletroporação, não vimos uma redução na extensão de uma coloração de tubulina ada, nem uma diminuição na inervação pelo gânglio acústico quando comparado com a injeção do morfo apenas uma vez dominado. Esta técnica pode ser feita em cerca de duas horas se for executada corretamente. A parte mais difícil da técnica de dominar é a eletroporação, deve-se tomar cuidado especial para não danificar o cérebro, enquanto eletrodos afiados ajudarão a aliviar esse problema.