Name: Entrega direta da MIF Morpholinos Into the Otocyst Zebrafish por injeção e Eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda a entregar morfolinos diretamente no otocisto de Danio rerio por microinjeção e eletroporação para estudar o desenvolvimento da orelha interna. Este método permite analisar efeitos específicos sobre células ciliadas sensoriais e inervação do gânglio estato-acústico.

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Este trabalho foi financiado por doações da Fundação de Pesquisa para Surdez Yc S ea NSF (IOS 0930096) para KFB. KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184-08W1</a> , NSF DBI 0832862, 0930096 NSF IOS

1. Eletrodos para fazer Eletroporação <ol><li> Cortar 75 mM fio de tungstênio diâmetro (AM Systems, Inc. Carlsborg, WA) de comprimento adequado (cerca de 3-5 cm) </li><li> Coloque fio de tungstênio através de cabo conector molex (latão estampado pinos) </li><li> Enrole os fios de tungstênio e conector do cabo molex com tubulação do psiquiatra (SPC Technology, Chicago, IL) e aplicar calor com bico de Bunsen ou pistola de calor para selar o tubo de encolhimento para o fio </li><li> Para aguçar a ponta do fio de tungstênio, mergulhe o fio no hidróxido de sódio 1,0 N (Conrad et al. 1993) e, usando um clipe de papel como o outro eletrodo, electrolyze o fio com um Electroporator onda quadrada. As condições que usamos são 5 de 50 Volt pulsos cada uma com duração de 100 ms com 50 ms entre pulsos. Eletrodos deve ser aperfeiçoada para um diâmetro de 15-20 mM </li><li> Manter os fios em uma bandeja dentro de grooves pressionado em massa de modelar antes do uso em eletroporação </li></ol> 2. Set Up Station Eletroporação <ol><li> Fita afiada 75μm eléctrodos de tungsténio para micromanipuladores (instrumentos de precisão Mundial). </li><li> Micromanipuladores lugar em ambos os lados do palco estereomicroscópio (Leica). </li><li> Ligar os eléctrodos a um cuy-21 Editar Protect Praça Electroporator Wave (Figura 1). </li><li> Ligue o electroporator e estabelecer parâmetros para eletroporação, incluindo tensão, duração de pulso, e número de pulsos. Os parâmetros mais eficazes para este experimento foram encontrados para ser de três pulsos de 13 volts que cada durou 5.0ms, com 100ms entre cada pulso. Se eletroporação cria bolhas de ar no embrião, reduzir a duração do pulso. </li></ol> 3. Microinjeção de Morpholinos Em vesícula ótica Zebrafish <ol><li> Colheita de embriões zebrafish de um tanque de criação. Incubar os embriões em embrião de sensibilização média com 0,3 PPM de azul de metileno (Westerfield, 2005) com 28,5 ° C durante a noite. </li><li> Puxar agulhas de vidro com um puxador de Sutter P-97 eletrodo </li><li> Aquecer um gel de agarose base (1% agarose em água de peixe em um prato de 10 milímetros Petri) a 37 ° C em banho-maria </li><li> Heat 1% agarose de baixo ponto de fusão (IMPA) em peixes de água até derreter e mantê-lo aquecido em banho-maria a 37 ° C. </li><li> Preencher uma agulha de vidro com uma solução de morfolino (GeneTools, Corvallis, OR) e cortou a ponta de diâmetro adequado. Montar a agulha de injeção em um micromanipulador (Kuhn). </li><li> Cortar ponta da agulha para cerca de 10 mm e injetar o óleo mineral para garantir que a ponta permite a entrega suficiente de solução morfolino. </li><li> Dechorinate embriões em 24 postfertilization horas (hpf) e anestesiá-lo com MS222 (tricaina, Sigma) em 0,3 PPM peixes de água azul de metileno. </li><li> Alinhar 3-5 embriões anestesiados para a base de gel de agarose com o lado direito para cima para análise uniforme conveniente </li><li> Colocar 1-2 gotas de IMPA 1% sobre cada embrião e deixe solidificar para corrigir o embrião no lugar </li><li> Gire a placa de Petri, para que a vesícula ótica é no lado direito </li><li> Coloque a agulha dentro do lúmen da vesícula ótica e injetar a solução morfolino com um PV820 Pneumatic PicoPump (Instrumentos de Precisão World) com um tanque de nitrogênio em anexo (Figura 2) </li></ol> 4. Procedimento eletroporação <ol><li> Mover os embriões montado para a estação de eletroporação imediatamente após a injeção </li><li> Coloque o eletrodo positivo sobre o tecido imediatamente posterior à vesícula ótica, mas não penetrar; inserir o eletrodo negativo para o cérebro imediatamente anterior à vesícula ótica </li><li> Aplicar atual usando um pedal ou empurrando um interruptor. </li><li> Despeje a água de peixe em agarose e remover embriões de agarose com roda e uma pipeta de vidro. Tenha cuidado para não danificar os embriões. Para os embriões que são difíceis de remover, use uma agulha suavemente para romper qualquer IMPA em torno do embrião. </li><li> Embriões lugar em um prato com água peixe azul de metileno e elevar os embriões para estágios desejado para análise (morfológico, imuno-histoquímica, em anlaysis situ hybridization etc, e microscópica). </li></ol> 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Estação de eletroporação. Eletrodos foram feitas usando fios de tungstênio afiadas 75μm e ligados por conduz a um cuy-21 Editar Protect Electroporator onda quadrada. Estes eletrodos foram gravadas para micromanipuladores. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Estação de injeção. Todos os embriões foram injetados na orelha direita para fins de normalização. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Coloração faloidina de filamentos de actina com 3 embriões dpf. (A) O embrião injecte 3 dpfd com controle de MO tem forte coloração de phalloidin na mácula posterior (pm). (B) O embrião que foi injetado com controle de MO e depois electroporated tinham níveis semelhantes de coloração em phalloidin pm nos embriões de injeção única. (C) Injeção com mif MOs na vesícula ótica sozinho não causou redução da coloração phalloidin, enquanto a injeção de mif MOs juntamente com eletroporação causou uma redução drástica de coloração phalloidin na pm (D). am mácula, anterior. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Faloidina coloração dos filamentos de actina com 5 larvas dpf. Não houve diferença entre a injeção apenas (A) e injeção com eletroporação quando o padrão de controle de morfolino foi usado (B). No entanto, as larvas dpf 5 que foram injetados com mif morpholinos e electroporated mostraram redução da coloração phalloidin na mácula posterior (pm) (D), embora menos dramático do que três dpf, quando comparado com o embrião que foi injetado com mif morpholinos apenas (C ). am mácula, anterior. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Coloração tubulina acetilados de embriões em 3 dpf. O embrião em (A) não recebeu qualquer injeção ou eletroporação. O embrião em (B) foi electroporated mas não recebeu a injeção. Embriões de receber a injeção e eletroporação (C, D) com mif morpholinos tinha visivelmente coloração tubulina diminuiu em comparação aos controles. (Macula pm, posterior). <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Coloração tubulina acetilados de embriões em 3 dpf com controle de morfolino. (A) Embrião sem nenhum tratamento mostrou forte coloração tubulina acetilada na mácula posterior (pm) e inervação extensiva. (B) Embrião injetados com controle de morfolino. (C) de embriões tratados com apenas eletroporação. (D) do embrião de controle com controle de morfolino injetado e electroporated tem níveis semelhantes de tubulina acetilada na mácula e inervação posterior comparação com o controle do tratamento não.

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

A produção do artigo foi patrocinado pela Tools Gene, LLC, que produzem reagentes mencionados no vídeo e texto.

Introduzimos com sucesso MOs oligonucleotídeo antisense no ouvido do embrião zebrafish 24 hpf. Embriões que foram levantadas após a injeção e eletroporação eram viáveis. Se os embriões sobreviveram à eletroporação, que cresceu a taxas normais em comparação com embriões que haviam recebido nenhum tratamento, bem como embriões que só tinha sido injetados e os embriões que só tinha sido electroporated. Observamos os efeitos da mif e mif-like MOs após a injeção de ouvido e eletroporação através da rotulagem com phalloidin e tubulina acetilados. Faloidina coloração dos filamentos de actina em células sensoriais ciliadas da mácula posterior indica que eletroporação de mif e mif-like MO na fase 24 hpf causou mudanças na célula de cabelo e / ou números de estereocílios, quando comparado aos embriões que foram apenas injetado com o MOs (Figura 3). Esta diminuição no número de células ciliadas é consistente com os achados de Shen et al. (Submetido) que MOs para mif e mif-como causar uma redução no número de células ciliadas da mácula sacular. A diminuição do número de células de cabelo em embriões que foram injetados com MOs e electroporated demonstrar que eletroporação pode ajudar em mover o MOs através da membrana celular, aumentando assim a extensão dos efeitos morfológicas quando comparadas com embriões no qual a vesícula ótica só foi injetado. Alterações na morfologia do gânglio statoacoustic foram observados através de coloração tubulina acetilados. A extensão da inervação pelo gânglio statoacoustic foi afetada, como embriões que foram injetados e electroporated mostram diminuição da ramificação das neurites (Figura 5). Também pode haver diminuição da condensação das células ganglionares e / ou diminuição do número de células ganglionares, porque a coloração tubulina acetilada é significativamente diminuída em embriões que eram injetadas e electroporated. Mif porque tem se mostrado fundamental para o desenvolvimento do sistema nervoso (Suzuki et al., 2004), as mudanças observadas após a eletroporação pode ser o resultado de transfecção aumento da mif e mif-MO como solução para as células neuroblastos. Eletroporação de oligo antisense morpholinos diretamente em um tecido em desenvolvimento é uma ferramenta útil para controlar a expressão de um gene durante o desenvolvimento que o tecido, tanto espacialmente e temporalmente, no embrião. Eletroporação de mif e mif-like MOs para os tecidos do ouvido interno resultou em alterações morfológicas de ambos macula o posterior eo gânglio statoacoustic. Houve uma redução no número de células sensoriais ciliadas na mácula posterior nos embriões que haviam sido injetados e electroporated em comparação com embriões que haviam recebido nenhum tratamento ou com embriões que tinham sido apenas injetados ou apenas electroporated. Houve também uma diminuição no grau de inervação do patch posterior sensoriais pelo gânglio statoacoustic eo tamanho do SAG. Eletroporação é um método valioso para transfecting macromoléculas em tecidos específicos, com a vantagem de observar os efeitos primários do que o DNA particular, RNA, ou MO no tecido desejado e discriminar estes de efeitos secundários sobre outros tecidos, incluindo o cérebro, da crista neural e mesênquima periotic sobre o desenvolvimento do ouvido interno (Barald e Kelley, 2004).

<ol><li> MOs: 0,3 mM de uma combinação de para mif, mif-like MO1 e mif-like MO2 foi usado. Mif MO é gratuito para o códon de iniciação do mRNA zebrafish mif: 5&#39;-acatcggcatgactgcgacagagat-3 &#39;. Dois MOs foram usados ​​para mif-like mif-like MO1 é gratuito para o local de início de translação:. 5&#39;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 &#39;, enquanto mif-like MO2 derivado AS seqüência na fronteira intron1/exon 2: 5&#39;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 &#39;. Controle de MO foi a seqüência de nucleotídeos a partir de Ferramentas mexidos Gene: 5&#39;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 &#39;. </li><li> azul de metileno (0,3 ppm) em água de peixes </li><li> MS222 (tricaina, Sigma, 0,64 mM em água de peixe) </li><li> Baixo ponto de fusão de agarose (IMPA; Roche) </li><li> vermelho de fenol (Sigma) </li><li> Anti-acetilado tubulina (Sigma) </li><li> Alexa Fluor ® 488 cabras de anticorpos anti-rato segundo (sondas Molecular) </li><li> Texas vermelho-phalloidin (sondas Molecular) </li></ol>

entrega direta da mif morpholinos into the otocyst zebrafish por injeção e eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

Nos últimos anos, eletroporação tornou-se uma técnica popular no transfecção in vivo de DNA, RNA e morpholinos em vários tecidos, incluindo o olho, cérebro e somitos do peixe-zebra. A vantagem de eletroporação sobre outros métodos de manipulação genética é que tecidos específicos podem ser direcionados, tanto espacialmente e temporalmente, para a introdução de macromoléculas pela aplicação de corrente elétrica. Aqui nós descrevemos o uso da eletroporação para transfecting mif e mif-like morpholinos para os tecidos do ouvido desenvolvimento interno do zebrafish. Em estudos anteriores, mif morfolino injetadas em embriões no 1 - de 8 células estágio resultou em ampla alterações morfológicas no sistema nervoso e olho, assim como o ouvido. Ao direcionar os tecidos do ouvido interno em fases posteriores de desenvolvimento, podemos determinar os efeitos primários da MIF no ouvido desenvolvimento interior, em oposição a efeitos secundários que podem resultar da influência de outros tecidos. Usando tubulina phalloidin e acetilada coloração para estudar a morfologia de neurônios, processos neuronais e células ciliadas da mácula associado a posterior, fomos capazes de avaliar a eficácia da eletroporação como um método de transfecção alvejado no ouvido zebrafish interior. As vesículas ótica de embriões foram injetados com 24hpf morpholinos e electroporated e foram comparados com embriões que haviam recebido nenhum tratamento ou tinham sido injetados ou apenas electroporated. Embriões que foram injetados e electroporated mostraram uma diminuição no número de células de cabelo, diminuição da inervação pelo gânglio statoacoustic (SAG) e menos neurônios SAG comparados com grupos controle. Nossos resultados mostraram que a entrega direta de morpholinos em otocysts em fases posteriores evita o sistema nervoso não-específica e efeitos da crista neural de morpholinos emitidos na fase celular 1-8. Ele também permite o exame dos efeitos que são direcionados para o ouvido interno e não efeitos secundários sobre a orelha de efeitos primários sobre o cérebro, ou mesênquima da crista neural periotic.

Um método para entregar morpholinos diretamente no otocyst zebrafish em 24hpf tem sido desenvolvido. Usando microinjeção de morpholinos no lúmen da vesícula ótica e eletroporação para efeito de penetração, fomos capazes de contornar o efeito de morpholinos sobre o cérebro e obter efeitos específicos para o ouvido interno.

Entrega direta da MIF Morpholinos Into the Otocyst Zebrafish por injeção e Eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna

Nos últimos anos, a eletroporação tornou-se uma técnica popular para a transfecção in vivo de DNA, RNA e morfolinos em vários tecidos, incluindo o...

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir diretamente antisense, oligonucleotídeos, morphos ou outras moléculas perturbadoras do desenvolvimento na orelha interna de peixe-zebra no estágio de um dia ou 24 horas após a fertilização. Neste exemplo, utilizamos morphos direcionados à primeira neurotrofina responsável pelo desenvolvimento do gânglio acústico estático, uma citocina do sistema imunológico chamada fator inibidor da migração de macrófagos, ou MIF, para determinar se os morphos contra essa molécula afetam o desenvolvimento da orelha interna ou a neurogênese. Isso é alcançado primeiramente introduzindo os morphos na luz da vesícula ótica por meio de microinjeção, seguido de eletroporação, que facilita a penetração dos morphos nas células da orelha interna a partir da luz.Em seguida, os embriões são mantidos a 28,5 graus Celsius para observar os efeitos dos morphos no desenvolvimento da orelha interna e na neurogênese. Nos próximos dias, são obtidos resultados que mostram uma diminuição nas células ciliadas sensoriais da orelha interna, bem como uma redução na inervação pelo gânglio estatoacústico com base em imunohistoquímica e coloração com foid e acton, que marcam a tubulina acetilada nas quinocílios e a actina nos estereocílios na superfície das células ciliadas, respectivamente. Desenvolvemos originalmente este método de injeção e eletroporação de morphos no embrião de galinha com a ajuda de uma estudante de graduação muito talentosa do laboratório.Katie Holmes conseguiu reduzi-la com sucesso às dimensões do peixe-zebra. A equipe de pesquisa atual, incluindo Yuchi, uma pós-doutoranda, e Matt Wyatt, um estudante de pós-graduação, juntamente com a ex-pós-doutoranda do laboratório, Deb Thompson, aperfeiçoou esta técnica para o peixe-zebra. Espera-se que este método possa responder perguntas fundamentais nas áreas da biologia do desenvolvimento e da pesquisa auditiva, incluindo se efeitos morfológicos específicos em um sistema orgânico como a orelha podem ser diferenciados de efeitos desenvolvimentais generalizados que afetam múltiplos sistemas orgânicos e são secundários em relação à orelha, por exemplo, efeitos no cérebro que afetam indiretamente a orelha.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como microinjeções em estágios de um a quatro células, é que este método introduz diretamente os morfos no ouvido em estágios posteriores. Assim, os efeitos diretos dos morfos no embrião, bem como os efeitos secundários no ouvido interno, podem ser evitados. Para fabricar os eletrodos, comece cortando um fio de tungstênio com diâmetro de 75 micrômetros em segmentos de cerca de três a cinco centímetros de comprimento. Passe o fio de tungstênio através de um conector de cabo Molex.Em seguida, envolva os fios de tungstênio e o conector do cabo Molex com tubo termorretrátil e aplique calor com um bico de Bunsen ou uma pistola de calor para selar o tubo ao fio. Depois, para afiar a ponta do fio de tungstênio, mergulhe o fio em hidróxido de sódio 1 N e, usando um clipe de papel como o outro eletrodo, realize a eletrólise do fio com um pulso eletrolítico em onda quadrada. As condições que utilizamos são cinco pulsos de 50 volts, cada um com duração de 100 milissegundos, com intervalos de 50 milissegundos entre os pulsos.Realize três repetições com a ponta do eletrodo submersa na hidróxido de sódio normal 1. Insira o eletrodo um pouco mais fundo no hidróxido de sódio e realize mais uma repetição. Insira o eletrodo ainda mais, avançando-o aproximadamente a mesma distância em ambas as vezes, e realize uma última repetição.Este afiação progressiva produz uma ponta muito fina no eletrodo, permitindo uma inserção mais precisa e com menos danos dos eletrodos no embrião de peixe-zebra em desenvolvimento. Mantenha os fios pressionados em argila de modelar em uma bandeja antes do uso para eletroporação para microinjeção de morphos em vesículas oticas de peixe-zebra. Primeiro, prepare tanques de reprodução com um divisor de plástico para separar machos de fêmeas à noite.Coloque quatro machos e quatro fêmeas no tanque e deixe o tanque em uma sala de incubação com um ciclo claro-escuro de 14 para 10 durante a noite. Na manhã seguinte, após as luzes serem acesas, retire o divisor e deixe os peixes em repouso por cerca de 20 a 30 minutos. Separe os machos das fêmeas e remova os reprodutores do tanque de desova.Coloque-os em tanques contendo água fresca para peixes. Colete os embriões do tanque de reprodução despejando a água contendo os ovos por meio de uma peneira. Enxágue os ovos na peneira várias vezes com água fresca para ovos antes de drená-los para uma placa de Petri.Remova os ovos não fertilizados ou opacos e incube os embriões em meio de crescimento com azul de metileno a 0,3 PP m a 28,5 graus Celsius durante a noite enquanto os embriões se desenvolvem. Puxe agulhas de vidro com um puxador de eletrodos Sutter P 97 logo antes da injeção. Aqueça uma base de gel AROS composta por 1%agros em água para peixes em uma placa de Petri de 10 milímetros a 37 graus Celsius em banho-maria, 1% AGROS de ponto de fusão baixo ou LMPA em água para peixes até derreter e mantenha aquecido no banho-maria a 37 graus Celsius.Encha uma agulha de vidro com uma solução de morfo e corte a ponta até o diâmetro apropriado. Aproximadamente 10 a 15 mícrons. Monte a agulha de injeção em um micromanipulador acoplado a uma bomba pneumática Pico Pump PV820 com tanque de nitrogênio. Decote os embriões 24 horas após a fertilização e anestesie-os com trica na água para peixes contendo azul de metileno a 0,3 PPM.Em seguida, alinhe três a cinco embriões anestesiados sobre a base de gel AROS com o lado direito voltado para cima para facilitar a análise uniforme, coloque uma a duas gotas de LMPA 1% sobre cada embrião e deixe solidificar para fixar o embrião no lugar. Gire a placa de Petri de modo que a vesícula otica fique do lado direito. Em seguida, insira a agulha na luz da vesícula otica e injete a solução morfo utilizando o pedal do pé.Imediatamente após a microinjeção, transfira os embriões montados para a estação de eletroporação para preparar a estação de eletroporação. Primeiro, fixe com fita as pontas de tungstênio afiadas de 75 micrômetros aos micromanipuladores. Em seguida, posicione os micromanipuladores em ambos os lados da platina do microscópio estereoscópico.Ligue o eletroporador e configure os parâmetros para a eletroporação. Os parâmetros mais eficazes para este experimento mostraram-se três pulsos de 13 volts com duração de dois milissegundos cada, com intervalos de 100 milissegundos entre cada pulso.Insira os eletrodos de modo que a vesícula ótica seja uniformemente flanqueada, com um eletrodo superficial à vesícula ótica e o outro profundo em relação a ela. Em seguida, aplique uma corrente elétrica usando um pedal ou pressionando um interruptor quando a eletroporação for concluída. Despeje água para peixes sobre os aros e remova os embriões utilizando uma pipeta de vidro, girando suavemente a placa.Use cuidado para não danificar os embriões que são difíceis de remover. Use uma agulha para romper suavemente qualquer LMPA ao redor deles. Transfira os embriões para uma placa com água de peixe azul de metileno e eleve os embriões até as fases desejadas para imunohistoquímica morfológica.Na hibridização em dois componentes e na análise microscópica, são apresentados aqui resultados representativos da injeção no ouvido e eletroporação de morfos. O máculo posterior ou auditivo, rotulado como PM, é um dos órgãos auditivos do peixe quando marcado com foina vermelha. Nesta fotografia, os feixes de actina nos estereocílios das células ciliadas sensoriais aparecem como pontos vermelhos na bola de pingue-pongue.Mancha em forma de pás, conforme observado pela marcação fluorescente com Phin em embriões de três dias pós-fertilização injetados com morpholinos de MIF, mostra apenas mais filamentos de actina dentro das estereocílios nas células ciliadas quando comparado com embriões da mesma idade que foram eletroporados e injetados. No entanto, a injeção e eletroporação com o morpholino controle padrão não causaram redução na marcação de F e na coloração em comparação com a injeção do morpholino isolado. Os resultados são semelhantes na mácula posterior, embora menos acentuados após cinco dias em larvas que foram injetadas e eletroporadas, quando comparadas com o embrião injetado apenas com morpholinos de MIF.Não houve diferença entre a injeção apenas e a injeção com eletroporação quando o morph controle padrão foi utilizado. Este embrião, que foi corado com um anticorpo contra tubulina acetilada, não recebeu nenhuma injeção nem eletroporação de Morphoses MIF. Este embrião foi eletroporado, mas não recebeu injeção.Os dois embriões mostram coloração normal de tubulina acetilada. Ambos os embriões foram injetados e eletroporados. Eles apresentaram coloração visivelmente reduzida de tubulina em comparação com os controles e muito menos processos neuronais associados à orelha, bem como aos gânglios circundantes.Quando o morpho controle foi utilizado para injeção e eletroporação, não observamos uma redução na extensão da marcação de tubulina acetilada, nem uma diminuição na inervação pelo gânglio acústico quando comparado com a injeção do morpho apenas Uma vez dominado. Esta técnica pode ser realizada em cerca de duas horas se for executada corretamente. A parte mais difícil da técnica a ser dominada é a eletroporação, devendo-se ter particular cuidado para não danificar o cérebro, embora eletrodos afiados ajudem a minimizar esse problema.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Microinjeção é um método bem estabelecido e eficaz para a introdução de substâncias estranhas em embriões de peixe-zebra fertilizado. Aqui, nós demonstramos uma técnica de microinjeção robusta para a realização de superexpressão do mRNA, e oligonucleotídeos morfolino estudos gene knockdown no zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Este vídeo mostra como morfolino ou mRNA podem ser injetadas em embriões de peixe-zebra na fase de uma célula para diminuir ou aumentar o nível de produtos de genes específicos durante o desenvolvimento subseqüente.

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Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

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Um método de genética reversa adaptável para peixe-zebra para avaliar a função do gene em fases posteriores do desenvolvimento e homeostase fisiológica, como a regeneração do tecido usando injeções intraventricular de morpholinos gene-específicos.

Reverter Genética Abordagem Morfolino Usando Injeção Cardíaca Ventricular para transf múltiplos tecidos de difícil alvo do Zebrafish Zergling

Usando a eletroporação do ovo , desenvolvemos um método para transfectar seletivamente o ouvido interno auditivo e o núcleo coclear em embriões de galinha para alcançar uma derrubada específica do grupo celular da proteína de retardo mental X frágil durante períodos discretos de montagem do circuito.

Dissecando a Função Autônoma Celular da Proteína de Retardo Mental do X Frágil em um Circuito Auditivo por Eletroporação In Ovo

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de ratos E16

Aprenda a entregar morfolinos diretamente no otocisto de Danio rerio por microinjeção e eletroporação para estudar o desenvolvimento da orelha interna. Este método permite analisar efeitos específicos sobre células ciliadas sensoriais e inervação do gânglio estato-acústico.

Entrega direta da MIF Morpholinos Into the Otocyst Zebrafish por injeção e Eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna (Vídeo) | JoVE Journal

Entrega direta da MIF Morpholinos Into the Otocyst Zebrafish por injeção e Eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna

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