Um Método para o alternante dos membros posteriores NASA modelo tradicional de Descarga em Ratos

O objetivo geral deste procedimento é realizar a suspensão dos membros posteriores, ou hu, em camundongos com um método mais simples e direto, que minimize o estresse para o animal. Esse método de cauda induz com sucesso atrofia nos membros posteriores sem comprometer a saúde geral nem o peso corporal. O primeiro passo é implantar um anel na cauda de um camundongo adulto.

É importante que o peso corporal e as observações de saúde sejam registrados ao longo do estudo. Em seguida, o equipamento de suspensão dos membros posteriores é montado e colocado em uma gaiola onde a suspensão será realizada. Uma vez que o animal tenha se recuperado, ele é colocado no equipamento para o procedimento de suspensão.

No final, os resultados podem ser obtidos por meio de medições da massa corporal e da massa muscular que mostraram atrofia muscular nos membros posteriores de camundongos descarregados. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a técnica de enfaixamento de Maori Holton, é que a pele da cauda permanece sempre visível. Os camundongos não conseguem sair do aparelho de suspensão nem brincar com o anel, além de se recuperarem mais rapidamente e manterem um peso corporal estável.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de fisiologia musculoesquelética, bem como na biologia gravitacional e espacial, como por exemplo como prevenir a atrofia muscular esquelética e a perda óssea após períodos prolongados de inatividade física, repouso em cama, imobilização de membros, microgravidade, doenças neuromusculares e com o avanço da idade. Tivemos essa ideia pela primeira vez quando enfrentamos complicações com a técnica de fixação da cauda de Maury Holden. Perdemos consistentemente animais e dados experimentais devido à fuga de camundongos do equipamento de membros posteriores durante a demonstração dessa técnica.

Hoje estão conosco Andre's Ferrara, Pesquisador Associado Sênior do meu laboratório, auxiliado por Jacqueline Chrissy, aluna de doutorado do laboratório, e Andrew Dunn, aluno de graduação também do laboratório. Comece por esterilizar a área cirúrgica, anestesiar o camundongo adulto com isoflurano e, em seguida, registrar o peso do camundongo e colocá-lo sobre uma placa aquecida. Prepare a cauda para a cirurgia esfregando com solução de clorexidina.

Comece a contar a partir da extremidade dos pelos do corpo na base da cauda para localizar o quinto, sexto ou sétimo espaço intervertebral entre dois pequenos ossos na cauda. Use um hemostato e uma agulha 20 5G para fazer um furo piloto entre duas vértebras, no espaço intervertebral. Remova a agulha e insira um fio de sutura de aço.

Corte um comprimento de 10 centímetros através do orifício. Cinco centímetros da sutura devem sobressair de cada lado da cauda. Coloque a ponta do polegar sobre a cauda e use a outra mão para enrolar a sutura de aço ao redor do polegar.

Enrosque as pontas para formar uma grande alça. A parte enrolada ou circular deve ter aproximadamente três milímetros de comprimento. Prenda uma das pontas da sutura com uma pinça hemostática e dobre-a em uma alça menor, cuja extremidade deve ser fixada o mais próximo possível do entrelaçamento na alça grande original.

Corte o excesso de fio e dobre o fio torcido para trás. Interrompa qualquer sangramento excessivo com bastões de nitrato de prata. Deixe o animal se recuperar por cinco a sete dias antes da suspensão da pata traseira ou hu após a cirurgia.

O miser house individualmente para evitar que os anéis da cauda fiquem emaranhados. Coloque uma camada de barra de aço ranhurada revestida com um fio de uma polegada por três oitavos de espessura sobre o topo da gaiola e fixe-a com fita adesiva. Adicione outra porca e porca borboleta, mas não aperte completamente para permitir ajustes posteriores.

Insira o parafuso máquina através do orifício central do bobina para evitar que o bobina caia. Parafuse uma porca trava de nylon na extremidade do parafuso máquina. O bobina deve girar livremente.

Insira o gancho de encaixe de um mosquetão de pesca na parte inferior do carretel. Use um alicate para moldar um gancho em forma de S a partir de um clipe de papel. Insira uma das extremidades do gancho em forma de S no orifício do mosquetão de pesca e feche-o com o alicate.

Coloque um arame em formato de U paralelo ao parafuso máquina na parte interna da gaiola e dobre as pontas sobre a lateral. Para suportar uma garrafa cheia de água, insira uma garrafa no arame em formato de U com o bico voltado para baixo, mas sem tocar o fundo. Fixe a garrafa de água à gaiola com fita adesiva.

Dobre um grampo de arquivo de dois polegadas aberto, deixando tensão suficiente para segurar alguns pedaços de alimento sem esmagar os pelotas antes do procedimento de descarga da pata traseira. Registre o peso do camundongo para uso em comparações. Posteriormente, insira a extremidade aberta do gancho em forma de S através do anel menor que se projeta da cauda.

Ajuste a altura do camundongo apertando ou soltando a porca borboleta inferior no parafuso da máquina. Os membros inferiores não devem sustentar peso. Uma vez alcançada a altura ideal, aperte a porca borboleta superior e reposicione a garrafa d'água com um novo arame moldado de modo que o camundongo não possa subir na biqueira com as patas traseiras.

Para medir o consumo alimentar durante o estudo, pese as pelotas antes de colocá-las no prendedor de argolas. Forneça cerca de oito a dez gramas para permitir o consumo de aproximadamente cinco a seis gramas de ração por dia. Por posição de camundongo, coloque o prendedor de argolas com a comida na parte inferior da gaiola, de modo que o animal não possa subir sobre ele, e fixe-o com fita adesiva isolante.

Usando dois por dois polegadas de Gores de forma solta. Enrole a cauda no mosquetão. Enrole um pequeno pedaço da cauda ao redor dos Gores, fixando-os à cauda.

Esta etapa é importante para evitar que a cauda penda para baixo, o que pode provocar acúmulo de sangue na ponta e levar à necrose da cauda. Repita o mesmo procedimento com um animal adicional do outro lado da gaiola. Ao alojar dois animais por gaiola, posicione-os de modo que quase possam se tocar.

No centro da gaiola, adiciono uma pequena quantidade de camação de cob à gaiola, certificando-me de que não há quantidade suficiente para o camundongo formar um montículo. Após o procedimento de suspensão da extremidade posterior, retire o animal do aparelho e remova o anel da cauda.

Usando um cortador de arame, registre o peso corporal e devolva o animal à sua gaiola de origem para recuperação. Após um período de recuperação, os animais aguardam novamente e as massas do músculo sóleo e das glândulas adrenais são medidas. Os pesos corporais antes da cirurgia de cauda não diferiram significativamente dos observados cinco dias após a cirurgia e antes do hu.

Embora a suspensão das patas traseiras por 14 e 28 dias tenha resultado em uma pequena perda de massa corporal, mas não significativa, os camundongos se recuperaram completamente, atingindo seus pesos corporais pré-suspensão. Após três dias de recuperação. O consumo alimentar de camundongos controles ambulatoriais e camundongos suspensos é mostrado aqui.

A ingestão alimentar diária média não diferiu nos camundongos HU ao longo de 28 dias em comparação com os controles. Observa-se atrofia significativa do músculo sóleo após 14 e 28 dias de HU, indicando um procedimento eficaz após três dias de recuperação. A massa do sóleo foi significativamente maior do que em ambos os grupos HU, mas ainda significativamente menor do que nos animais controles ambulatórios.

As glândulas adrenais esquerda e direita foram removidas e pesadas para fornecer um indicador do estresse do animal. Como visto aqui, os pesos médios foram comparáveis entre os camundongos controle e os camundongos HU. Uma vez dominada, a cirurgia de adaptação pode ser concluída em cinco a dez minutos por camundongo, e a montagem da gaiola pode ser finalizada em 15 minutos após este procedimento. Outros métodos, como os camundongos Hein, o recarregamento de membros e a recuperação da atrofia por desuso, podem ser realizados para responder a questões adicionais, como a forma pela qual os sistemas muscular e ósseo podem se recuperar e responder a esses períodos prolongados de inatividade.

Agora que você assistiu a este vídeo, deverá ter uma boa compreensão de como realizar a suspensão dos membros posteriores em camundongos. Esta técnica permite o estudo de múltiplos tecidos e sistemas, como cardiovascular, músculo-esquelético e intestinal, sob condições de descarga e recarga, utilizando uma variedade de modelos de camundongos, tais como knockouts ou knockins.