Name: Purificação de Progenitores do músculo esquelético (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprenda a purificar progenitores miogênicos e adipogênicos do músculo esquelético murino usando digestão enzimática e citometria de fluxo. Este método permite analisar viabilidade celular e regeneração tecidual in vivo.

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1. Coleta de tecido: <ol><li> Use ratos entre 7 e 12 semanas de idade. Normalmente, pelo menos dois animais são utilizados: um é para configurar o FACS cor única controles necessários para compensação e de fluorescência-menos e uma amostras controle isotipo. A outra é a amostra real para a classificação. </li><li> Eutanásia os ratos por inalação de CO 2 ou de acordo com um protocolo de ética de escolha. Camundongos lugar em uma toalha de papel, virada para cima, e pulverize com etanol 70% completamente para evitar a contaminação com a pele do rato. </li><li> Levante a pele da região abdominal com uma pinça, faça um pequeno corte longitudinal com tesouras afiadas. </li><li> Descasque as duas abas de pele em sentidos opostos (para cima e para baixo) para expor completamente os músculos dos membros posteriores por baixo. </li><li> O tecido muscular especiais de consumo, inserindo e ampliando a tesoura ao longo de ambos os lados da tíbia. </li><li> Repita o mesmo processo para o fêmur para extrair o tecido muscular. </li><li> Coloque todos os tecidos musculares excisadas em 60 milímetros petri pratos, usando um prato para o tecido de cada rato. </li><li> Repita o procedimento acima para todos os ratos. </li></ol> 2. Dissociar tecido em células isoladas por digestão enzimática: Ao longo desta secção do protocolo, o uso de reagentes estéreis e ferramentas de trabalho e em condições estéreis. <ol start="9"><li> Adicionar 2 mL de colagenase II (Sigma, cat # 6885, 500U / mL) e 20 mL de CaCl 2 250mm de ações para cada placa de Petri. </li><li> Rasgar o tecido muscular em pedaços pequenos (cerca de 1 mm 3) com duas pinças (uma dentada, um com 2 dentes, a partir de Ferramentas Ciência Fine, cat # 11051-10, 11154-10), prestando atenção ao remover e descartar tanto contaminados não-tecido muscular possível. </li><li> Cobrir os pratos de Petri e incube-os a 37 graus Celsius por 30 minutos. </li><li> Recuperar os pratos de Petri e usar um êmbolo da seringa 3 mL para triture bem os pedaços de tecido. Use um êmbolo para cada amostra para evitar contaminações. </li><li> Adicione um pouco de (~ 5 mL) estéril fria PBS a cada Placa de Petri e transferência do lodo de tecido em um tubo Falcon 50 ml (lavar o prato Petri-se necessário para recuperar todo o tecido) </li><li> Agite vigorosamente o tubo Falcon, encha o tubo com PBS, centrifugue @ 800rpm x 5 minutos (Eppendorf modelo de bancada: 5810R) e aspirar o sobrenadante (repete 3 vezes) </li><li> Adicione a mistura de 1 ml de colagenase D (Roche, Cat # 11088882001, 1.5u / mL) / Dispase II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / mL) e 10μL de CaCl 2 (250mm) para cada tubo, incubar a 37 graus Celsius com a rotação durante uma hora. </li><li> Adicionar 5-10 mL de frio estéril PBS, vortex, e pipetar cuidadosamente para homogeneizar o tecido. </li><li> Encha os tubos com PBS e misture bem. </li><li> Transferir o líquido para um filtro de células 40μm colocado em cima de um tubo de Falcon 50 mL para filtrar os pedaços restantes grandes de tecido. Divida cada amostra uniformemente em três tubos de 50mL Falcon. Encha cada um dos tubos com PBS, em seguida, centrifugar @ 1600rpm por 5 minutos a 8 graus Celsius. </li><li> Desprezar o sobrenadante e coletar células para a coloração. </li></ol> 3. Coloração de anticorpos e classificação: Ao longo desta secção do protocolo, use FACS estéril e buffers de coleta e de trabalho em condições estéreis. Anticorpos comerciais são geralmente considerados estéreis se for manuseado correctamente. <ol start="20"><li> Para única cor e amostras de controle isotipo, ressuspender a amostra em tampão FACS 1mL e dividir as células suspensas em nove tubos de 1,5 ml pré-rotulados Eppendorf (100 mL cada tubo). <ol><li> Configurar coloração única cor mistura de acordo com a tabela a seguir: ATENÇÃO: A concentração final de anticorpos isotipo controle na mancha deve coincidir com o anticorpo primário são o controle de. Por exemplo, se anti-Sca-1 é usado para uma μg/10 6 células, o seu isotipo correspondente deverá ser usado na mesma concentração. <table border="1"><tbody><tr><td> Tubo # </td><td> Nome do tubo </td><td> Companhia </td><td> Cat # </td><td> clone </td><td> isotipo </td><td> diluição </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Não mancha </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Hoechst33342 </td><td> sigma </td><td> B2261 </td><td></td><td></td><td> 2-5ug/ml </td></tr><tr><td> 3 </td><td> PI </td><td> sigma </td><td> P4864 </td><td></td><td></td><td> 1ug/ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> 4 </td><td rowspan="2"> CD31-FITC CD45-FITC </td><td> eBioscience </td><td> 11-0311-85 </td><td> 390 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Casa feita </td><td></td><td> I3 / 2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> SCA1-PECY7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-5981-82 </td><td> D7 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> α-7 APC </td><td> Casa feita </td><td></td><td> R2F2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 1000 </td></tr></tbody></table></li><li> Configurar isotipo coloração controle mistura usando a seguinte tabela: <table border="1"><tbody><tr><td> Tubo # </td><td> Nome do tubo </td><td> Hoechst </td><td> PI </td><td> CD31- FITC </td><td> CD45- FITC </td><td> Scal- PE-Cy7 </td><td> A-7- APC </td><td> Rat- IgG2b- APC </td><td> Rat- IgG2a- pecy7 </td><td> Rat- IgG2a- FITC </td><td> Rat- IgG2b- FITC </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Iso- CD31 / CD45 </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 8 </td><td> Iso- Scal- pecy7 </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 9 </td><td> Iso- α-7-APC </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table></li><li> Pipeta a única cor e mistura de isótopos de controle de marcação (que geralmente ajustar a concentração de anticorpos, para que entre 5 e 10 mL de coloração mix são adicionados a cada amostra) para o tubo Eppendorf apropriado a partir do Passo 20. Misturar bem e incubar no gelo por 1 hora. </li></ol></li><li> Mancha células de rato amostra com 800μL do coquetel de anticorpos (abaixo) para separação de células FACS. Misturar bem e incubar no gelo por 1 hora. Cocktail de anticorpos: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC ATENÇÃO: A proporção ideal de anticorpos para as células deve ser determinada por titulação individualmente cada anticorpo, como diferenças significativas possam existir entre os lotes. A quantidade ideal de anticorpos para ser usado deve ser expresso em μgs de anticorpos por 10 6 células-alvo e mantida constante quando se utiliza o mesmo lote de anticorpos. Claramente, se o número de células alvo não muda significativamente entre experimentos, ou se o volume coloração é escalado com o número de células, uma diluição fixa de cada anticorpo também pode ser usado. </li><li> Lavagem: Adicionar cerca de 1mL de tampão FACS a cada um dos nove tubos de controle, adicionar cerca de 20mL de tampão FACS para o tubo de amostra. </li><li> Centrifugar a tubos Eppendorf @ 3000rpm por 5 minutos (bancada topo centrífuga Eppendorf modelo: 5417C). Centrifugar o tubo de amostra @ 1600rpm por 5 minutos (bancada topo centrífuga Eppendorf modelo: 5810R). </li><li> Aspirar e desprezar o sobrenadante de todos os tubos. </li><li> Ressuspender as células no buffer FACS (1mL para cada um dos controles, 4 ml da amostra de classificação), células Pipetar em "tubos FACS" através do filtro de células cap (BD gato Falcon # 352235, 40μm tamanho dos poros) para remover pedaços restantes que podem afetar o citômetro. </li><li> Configure o Sorter FACS com controles de cor única e controles isotipo. </li><li> Coletar células classificados de acordo com a tabela a seguir em um buffer de coleta de 3,5 ml (95% DMEM, 5% FBS) separadamente. Normalmente, quando a colheita ambos os membros posteriores, um único tipo de rato silvestre poderia render cerca de 150.000 células progenitoras miogênica ou 100.000 células progenitoras adipogénicos, com a viabilidade acima de 95%, a avaliar pela re-análise de células classificadas por FACS, no final do procedimento (Figura 1 ) Definição de progenitores miogênicos e adipogénicos baseado em manchas na superfície <table border="1"><tbody><tr><td> Antibody / mancha </td><td> Progenitoras miogênica (MP) </td><td> Progenitoras adipogénicos (AP) </td></tr><tr><td> Hoechst </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> PI </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td>- </td><td> - </td></tr><tr><td> SCA1-PECY7 </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> α-7 APC </td><td> + </td><td> - </td></tr></tbody></table></li></ol> 4. Transplante: <ol start="28"><li> Centrifugar as células classificadas @ 1500rpm por 5 minutos, retire as células sobrenadante e transferir para autoclavado tubos Eppendorf (1,5 mL), lavar as células com 500 mL de PBS estéril (soro grátis!), Então centrífuga @ 3000rpm por 5 minutos. Manutenção de todos os reagentes em condições estéreis e trabalhando em uma capa de cultura de tecidos, ressuspender progenitores miogênicos em PBS, ou progenitor adipogénicos em Matrigel (BD cat # 354234) em aproximadamente 10 6 células / mL. </li><li> Transplante de células progenitoras ou miogênica progenitor adipogénicos a camundongos destinatário. <ol><li> Anestesiar o rato com isoflouran acordo com sua política instituição. </li><li> Raspar o cabelo em torno da região de injeção e, em seguida esterilizar a pele por fricção com álcool a 70% </li><li> Injetar 20μL de células progenitoras ou células progenitoras miogênica adipogénicos (= 20k células) usando um 10/03 seringa de insulina CC (BD cat # 309300). </li></ol></li><li> Depois de um tempo adequado (três semanas funciona bem, mas miofibras expressar doadores marcadores derivados transgênicos são geralmente evidente dentro de uma semana após o transplante), anestesiar os ratos destinatário a partir do passo 29 por injeção intraperitoneal de 400 mL Avertin (Sigma Cat # T04840-2, 25 mg / mL), então perfundir transcardially com 50mL de PBS (contém 10 mM de EDTA) em primeiro lugar, seguido de 15ml de PFA 4%. Coletar tecido alvo, pós-fix com PFA 4% durante a noite, se necessário, então a transferência para sacarose a 20% durante a noite. Incorporar em outubro congelar, e cryosection. </li></ol> 5. Resultados representativos: MP quando são transplantadas no músculo esquelético do rato, eles prontamente se fundem com fibras musculares pré-existentes. Portanto, qualquer rótulo genético presente nas células do doador serão facilmente detectáveis ​​nas fibras que os recebeu. A Figura 2 mostra um exemplo onde as células transplantadas expressa phostphatase alcalinas humanos, revelou histoquimicamente. AP quando são transplantadas o resultado é altamente dependente do ambiente do local de transplante: quando transplantadas por via subcutânea essas células dão origem aos adipócitos e miofibroblastos (ver figura 2). Em muitos outros sites, incluindo o músculo, não sobreviver, a menos degeneração gordurosa foi induzida 3. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Classificação estratégia para o isolamento de populações de células progenitoras do músculo esquelético (A) estratégia de classificação:. Células viáveis ​​foram identificados com base na dispersão para a frente e dispersão lateral. Coloração Hoechst foi usada para excluir restos anuclear e propidium iodeto de coloração (PI) para excluir as células mortas. Hematopoiéticas (CD45) e endoteliais (CD31), as células foram excluídos os portões de classificação. O α7 + + Hoechst PI - CD45 - CD31 - scal - subconjunto contém todos os progenitores miogênicos (MP). O scal + + Hoechst PI - CD45 - CD31 - α7 - População contém progenitores adipogénicos (AP). (B) de fluorescência-menos-um controles (FMO) isotipo confirmar a especificidade da mancha. (C) Pureza cheques de subconjuntos MP e AP após a triagem. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Resultados representativos seguintes MP e transplante AP. AP foram transplantados subcutaneamente (painel superior) e MP por via intramuscular (painel inferior). Em ambos os casos, as células do doador se originou de um camundongo transgênico expressando fosfatase alcalina humana, identificados pela coloração marrom.

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O objetivo deste protocolo é conseguir um equilíbrio razoável entre os rendimentos elevados e alta viabilidade das células purificadas. O passo mais crítico para garantir que as células saudáveis ​​são recuperados é, previsivelmente, a dissociação enzimática do tecido de partida. O manuseio do tecido deve ser particularmente delicado, que é difícil de demonstrar ou apreciar ainda em um formato audiovisual. Outro fator importante é a duração do procedimento. O tempo que leva para ir do doador para o animal receptor, menor a viabilidade e, portanto, a eficiência de enxerto. Caso haja qualquer dúvida sobre a viabilidade de que não é imediatamente respondeu, olhando para a frequência de PI evento positivo nas amostras de células purificadas depois da classificação, sugerimos que um ensaio por diluição limitante para medir clonogenicity é realizada 3. Espécie típica do músculo danificado rotineiramente produzir cerca de 1 em 15-20 células capazes de iniciar colônias miogênica ou fibro / adipogénicos in vitro. Embora essencialmente 100% das colônias iniciadas a partir de MPs contêm miotubos diferenciados, apenas cerca de um terço das colônias obtidas FAPs conter adipócitos, além de miofibroblastos actina músculo liso positivos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Colagenase II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-6885, </td><td> 500 u / ml </td></tr><tr><td> Colagenase D </td><td> Roche </td><td> 11088882001 </td><td> 1,5 u / ml </td></tr><tr><td> Deslocar II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 2,4 u / ml </td></tr><tr><td> coador celular </td><td> BD </td><td> 352340 </td><td> 40 mM </td></tr><tr><td> Tubo com filtro de células </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 40 mM </td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2261 </td><td> 2-5 ug / ml </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td> Clone 390 </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td> Home made </td><td></td><td> Clone I3 / 2 </td></tr><tr><td> SCA1-PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td> Clone D7 </td></tr><tr><td> α-7 integrina APC </td><td> Home made </td><td> Informe-se com Rossi laboratório </td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

purificação de progenitores do músculo esquelético

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Músculo esquelético contém populações progenitoras múltiplas de diferentes origens embrionárias e potencial de desenvolvimento. Progenitores miogênicos, normalmente residente em uma &quot;posição de células satélite&quot; entre a membrana plasmática fibromuscular e da membrana basal laminina-rico que embainha-lo, são auto-renovação de células que é o único comprometido com a linhagem miogênica 1,2. Descrevemos recentemente uma segunda classe de células progenitoras navio associados que podem gerar miofibroblastos e adipócitos brancos, que responde a danos causados ​​por entrar de forma eficiente a proliferação e fornece suporte tróficos para as células miogênicas durante a regeneração do tecido 3,4. Um dos ensaios mais confiável para determinar o potencial de desenvolvimento e regeneração de uma população determinada célula depende de seu isolamento e transplante 5-7. Para este fim temos protocolos otimizados para a sua purificação por citometria de fluxo a partir do músculo enzimaticamente dissociada, que vamos delinear neste artigo. As populações obtidas com este método irá conter células miogênicas colônia ou fibro / adipogénicos formando: não outros tipos de células são capazes de expansão in vitro ou sobrevivendo na entrega vivo. No entanto, quando essas populações são usadas imediatamente após a classificação para a análise molecular (por exemplo qRT-PCR) é preciso ter em mente que os subconjuntos recém-ordenados podem conter outras células contaminante que não têm a capacidade de formar colônias ou enxertando destinatários.

Método para a dissociação enzimática, rotulagem superfície e purificação por citometria de fluxo de fibro / adipogénicos e progenitores miogênica de músculo esquelético murino.

Purificação de Progenitores do músculo esquelético

O músculo esquelético contém múltiplas populações de progenitores de distintas origens embrionárias e potencial de desenvolvimento. Progenitores miogênicos, geralmente residentes...

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar células progenitoras viáveis de linhagem miogênica e adipogênica a partir de músculo esquelético. Isso é alcançado inicialmente pela coleta de tecido muscular de camundongos eutanasiados. Como segundo passo, a amostra é digerida enzimaticamente, o que dissocia o tecido em células isoladas.A seguir, a classificação de células ativada por fluorescência, ou FACS, é utilizada para isolar as células progenitoras. São obtidos resultados que demonstram viabilidade e diferenciação das células isoladas quando transplantadas em camundongos receptores, com base na coloração histoquímica do marcador genético, que, neste exemplo, é a fosfatase alcalina humana. A principal vantagem desta técnica em relação a técnicas pré-existentes, como a pré-PL, é que as células podem ser isoladas diretamente do animal em diferentes pontos temporais.Por exemplo, após induzir dano tecidual, o que significa que não há seleção sobre a população celular, a população celular pode ser analisada em nível molecular para observar as diferentes etapas pelas quais as células passam durante o processo de regeneração in vivo. Assim, essa técnica pode ajudar a responder uma questão fundamental no campo da regeneração tecidual, e em particular, qual o papel de cada tipo celular durante a regeneração in vivo e como esses tipos celulares interagem entre si para reconstruir um tecido saudável? As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia de doenças como a distrofia muscular.Como o estudo desses progenitores pode vir a viabilizar estratégias regenerativas para esse tipo de doença. Além disso, as implicações dessa técnica se estendem a diversos outros tecidos, desde o cardíaco até o adiposo, pois pelo menos os progenitores fibroadipogênicos foram encontrados em todos os tecidos que testamos até agora. Em geral, iniciantes nessa técnica enfrentarão dificuldades, pois técnicas de dissociação agressivas reduzirão a viabilidade celular e gerarão muito debris, o que posteriormente interferirá na separação limpa das células.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando decidimos aplicar a citometria de fluxo, que normalmente é usada em células APOE, ao estudo de células-tronco em tecidos sólidos. A demonstração visual desta técnica é importante, pois os passos de dissociação tecidual são difíceis de aprender, já que é muito complicado descrevê-los adequadamente. A técnica será demonstrada hoje por linky, uma assistente de pesquisa do meu laboratório que a desenvolveu e otimizou inicialmente. Para este procedimento, são necessários pelo menos dois camundongos.Um camundongo é utilizado para fornecer as células necessárias aos controles de cor única e isotipo de anticorpo para os fatos, e o outro fornecerá a amostra a ser classificada. Para começar, obtenha camundongos entre sete e 12 semanas de idade que tenham sido previamente eutanasiados em uma capela de laboratório estéril. Coloque o camundongo eutanasiado sobre uma toalha de papel estéril, com a face voltada para cima, e pulverize abundantemente o pelo com etanol a 70% para prevenir contaminação, segurando uma pinça com uma das mãos e uma tesoura afiada com a outra.Eleva a pele na região abdominal e faz uma pequena incisão longitudinal. Segura a pele em cada lado da incisão e puxa-a para trás para expor completamente os músculos da pata traseira. Em seguida, excisa o tecido muscular inserindo a tesoura fechada sob o músculo e acima da tíbia, e depois abrindo a tesoura.A borda traseira das lâminas forçará suavemente a separação do músculo da tíbia. Repita para ambos os lados da tíbia e coloque o tecido em uma placa de Petri de 60 milímetros. Agora, excise o tecido muscular do fêmur da mesma maneira e adicione o tecido à placa de Petri.Repita para cada camundongo, utilizando um recipiente de Petri por camundongo. Em seguida, dissocie o tecido em células individuais. Adicione dois mililitros ou 1000 unidades de colagenase, dois e 20 microlitros de solução estoque de cloreto de cálcio 250 milimolar a cada recipiente de Petri contendo tecido muscular.Em seguida, trabalhe rapidamente e com cuidado. Use duas pinças cinzas, uma serrilhada e outra com dois dentes, para rasgar o tecido em pedaços de um milímetro cúbico. Remova e descarte o máximo possível de tecido não muscular.Cubra as placas de Petri e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, retire as placas e retorne-as para a câmara de segurança biológica. Remova o êmbolo de uma seringa de três mililitros e use-o para esmagar o tecido.Use um êmbolo por placa para evitar contaminação cruzada. Adicione aproximadamente cinco mililitros de PBS frio e estéril a cada placa de Petri e transfira o conteúdo da placa para um tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue com mais cinco mililitros de PBS para recuperar todo o tecido e adicione ao tubo cônico.Lave e centrifugue as amostras três vezes de acordo com o protocolo. Em seguida, adicione um mililitro de uma solução composta por colagenase D dys space dois e cloreto de cálcio a cada tubo e incube a 37 graus Celsius com rotação por uma hora. Após a incubação, adicione cinco mililitros de PBS estéril frio aos tubos, vortexe brevemente e tri-ture várias vezes para dissociar os agregados.Encha os tubos com PBS, misture bem e coloque no gelo. Para remover quaisquer pedaços remanescentes de tecido, posicione um filtro celular de 40 micrômetros sobre um tubo cônico de 50 mililitros em gelo e filtre a suspensão celular. Divida o filtrado igualmente em três tubos cônicos de 50 mililitros contendo PBS frio e estéril e centrifugue a 1600 RPM por cinco minutos a oito graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante e coloque as células no gelo para coloração e separação de células progenitoras miogênicas e adipogênicas.Primeiro, prepare os seis controles mistos de coloração simples conforme o protocolo escrito fornecido. Esses controles incluem a coloração sem corante, corante Hulk, iodeto de propídio, anticorpos marcados com FSE para CD31 e CD45, anticorpo marcado com SC one P size seven e anticorpo marcado com alpha seven A PC. Em seguida, prepare as três misturas de controles de isotipos de anticorpos conforme o protocolo escrito.Uma vez que as misturas de coloração tenham sido preparadas, rotule nove tubos einor de 1,5 mililitro para as amostras de controle monocromático e de isotipo. Re-suspenda e combine as células dos três tubos cônicos em um volume total de um mililitro de tampão fax. Em seguida, distribua 100 microlitros das células para cada tubo einor de controle rotulado e pipete de cinco a 10 microlitros das misturas de coloração, dependendo da concentração dos anticorpos, para os tubos de controle correspondentes.Re-suspenda as células do camundongo da amostra em 200 microlitros de tampão fax e combine em um dos tubos cónicos de 50 mililitros. Em seguida, adicione 800 microlitros do coquetel de anticorpos. Misture cada um dos tubos controle e tubos da amostra.Incube bem as amostras no gelo durante uma hora. Após a incubação, lave as células adicionando um mililitro de tampão fax a cada um dos nove tubos controle e aproximadamente 20 mililitros de tampão fax ao tubo da amostra. Centrifugue os tubos einor controle a 3000 RPM durante cinco minutos.Centrifugue o tubo cônico da amostra a 1600 RPM durante cinco minutos. Em seguida, aspire e descarte o sobrenadante após a centrifugação. Re-suspenda as células controle em cada tubo Eppendorf com um mililitro de tampão fax e re-suspenda as células da amostra em quatro mililitros de tampão fax.Adicione iodeto de propídio às células da amostra, aos controles isotípicos e ao controle de cor única de PI. Pipete as células em tubos para citometria através da tampa com peneira celular para remover agregados remanescentes que possam afetar o citômetro.Configure o instrumento de fax com um corante único e controles de isotipos. Separe as células da amostra de acordo com o protocolo escrito fornecido e colete cada população separadamente. Em um tubo de coleta de 3,5 mL, os progenitores miogênicos viáveis são a população que é FSC elevado, alfa sete integrina positivo, PI negativo, CD31 negativo, CD45 negativo e Sca-1 positivo.Um progenitor adipogênico viável negativo para PE tamanho sete é isolado e triagem para positividade para PE tamanho sete e negatividade para CD31, CD45 e alfa sete a PC. Um único camundongo selvagem pode fornecer cerca de 1 × 10⁵ progenitores adipogênicos e 1,5 a 2 × 10⁵ progenitores miogênicos com viabilidade superior a 95%.Para preparar as células para transplante em camundongos hospedeiros, as células são lavadas. Primeiro, centrifugue as células deformadas a 1500 RPM durante cinco minutos. Remova o sobrenadante, re-suspenda as células em 500 microlitros de PBS e transfira-as para tubos einor.Centrifugue os tubos a 3000 RPM por cinco minutos e remova o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda os progenitores miogênicos em PBS ou os progenitores adipogênicos em matrigel na concentração aproximada de 10 elevado a seis células por mililitro. Após preparar os camundongos hospedeiros anestesiados para cada tipo de célula doadora, de acordo com o protocolo escrito, utilize uma seringa de insulina de três décimos de centímetro cúbico para injetar 20 microlitros (aproximadamente 20.000 células) de progenitores miogênicos ou adipogênicos.Permita o tempo apropriado para que as células transplantadas se diferenciem, geralmente cerca de três semanas. Em seguida, isole o tecido-alvo e prepare-o para crioseccionamento conforme descrito no protocolo. Nesta figura, a estratégia de separação é demonstrada para isolar os progenitores adipogênicos e miogênicos: células viáveis foram identificadas com base no espalhamento para frente e no espalhamento lateral; a coloração com hawk foi utilizada para excluir detritos nucleares e a coloração com iodeto de propídio ou PI foi usada para excluir células mortas; células hematopoéticas e endoteliais, ou células CD45 e CD31, respectivamente, foram então excluídas dos portões de separação. Por fim, o subconjunto que é positivo para alfa sete.SKA um negativo contém todos os progenitores miogênicos e a população que é alfa sete negativa. SKA um positivo contém todos os progenitores adipogênicos. Controles de fluorescência menos um de isotipos confirmam a especificidade da coloração. Além disso, foram realizadas verificações de pureza dos subconjuntos adipogênicos e miogênicos.Após a triagem neste exemplo representativo, células doadoras progenitoras adipogênicas que expressam fosfatase alcalina humana transgênica injetadas por via subcutânea podem ser identificadas no tecido hospedeiro por histoquímica, conforme indicado pela coloração marrom. Células doadoras progenitoras miogênicas que expressam fosfatase alcalina humana transgênica injetadas por via intramuscular foram identificadas nesta seção de tecido, conforme mostrado em marrom.Usando a histoquímica, uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco horas, se for executada corretamente. Se mais amostras estiverem em processamento, o tempo aumentará. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente e com delicadeza.Portanto, evite processar muitas amostras ao mesmo tempo. Prolongar o tempo de processamento reduzirá significativamente a variabilidade celular após este procedimento. Outros métodos, como a análise da expressão de colono SC OG por R-T-P-C-R quantitativo, também podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como: como essas células pro respondem ao dano in vivo após seu desenvolvimento?Essa técnica abriu caminho para outros pesquisadores na área de regeneração tecidual explorarem a comunicação entre as células progenitoras em tecidos danificados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como dissociar esses tecidos sem causar danos. As células progenitoras identificam as células progenitoras com base em seus marcadores superficiais e analisam seu potencial de desenvolvimento in vivo.Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O isolamento e cultura de uma população pura de células satélites quiescentes, uma população de células estaminais musculares, é essencial para a compreensão da haste músculo biologia celular e regeneração, bem como o transplante de células estaminais para terapias em distrofia muscular e outras doenças degenerativas.

Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Vasos sanguíneos dentro do porto músculo esquelético várias populações precursoras multi-linhagem humana que são ideais para aplicações de regeneração. Este método de isolamento permite purificação simultânea de três populações de células multipotentes precursor, respectivamente, de três camadas estruturais de vasos sanguíneos: as células endoteliais de miogênica íntima, pericitos de mídia e células adventícias de adventícia.

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

A cultura in vitro sistemas provaram indispensável para a nossa compreensão de myogenesis vertebrados. No entanto, ainda há muito a ser aprendido sobre o desenvolvimento do músculo esquelético não Mamífero e crescimento, particularmente na taxa basal. De uma forma eficiente e robusta para isolar as células estaminais de adultos deste tecido, as células precursoras miogénicos (PPM), e manter a sua auto-renovação, a proliferação e diferenciação de uma configuração de cultura primária permite a...

Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens

Os principais tipos de células aderentes derivadas do músculo humano são células miogênicas e fibroblastos. Aqui, as populações de células são enriquecidas usando classificação de células ativadas por magnetismo com base no antígeno CD56. A imunomarcação subsequente com anticorpos específicos e o uso de técnicas de análise de imagem permitem a quantificação das características citoplasmáticas e nucleares em células individuais.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

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Preparação e cultivo de células precursoras Miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de Adulto e Idoso Humanos

Aqui, descrevemos uma metodologia para obter uma população pura de mioblastos humanos a partir do tecido muscular adulto. Essas células são usadas para estudar a diferenciação do músculo esquelético in vitro e, em particular, para estudar proteínas envolvidas na sinalização de Ca 2+ .

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Nós apresentamos técnicas para isolar-se, cultivando, caracterizando, e diferenciando pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) obtidas do tecido esqueletal da biópsia do músculo.  os hmpcs obtidos e caracterizados através destes métodos podem ser usados para abordar subseqüentemente as perguntas da pesquisa relativas à miogenesis humana e à regeneração do músculo esqueletal.

Isolamento, cultura, caracterização e diferenciação de células progenitoras do músculo humano do procedimento de biópsia do músculo esquelético

A identificação precisa de células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) e células-tronco musculares (MuSCs) é fundamental para estudar sua função biológica em condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo fornece diretrizes para o isolamento, purificação e cultura de FAPs e MuSCs de músculos de camundongos adultos.

FACS-isolamento e Cultura de Progenitores Fibro-Adipogênicos e Células-Tronco Musculares de Músculo Esquelético não perturbado e lesionado

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco musculares e progenitores fibroadipogênicos de músculos esqueléticos individuais em camundongos. O protocolo envolve dissecção muscular única, isolamento de células-tronco por classificação de células ativadas por fluorescência, avaliação da pureza por coloração de imunofluorescência e medição quantitativa da entrada da fase S pelo ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Isolamento de Populações de Células-Tronco Quiescentes de Músculos Esqueléticos Individuais

Esse protocolo fornece um método padronizado para isolar e enriquecer mioblastos primários do músculo esquelético de camundongos adultos e neonatos por meio de dissociação tecidual, filtração sequencial, pré-placagem e condições definidas de cultura, possibilitando o estabelecimento e manutenção de culturas de mioblastas derivadas de células satélite para aplicações experimentais posteriores.

Isolamento de Células Satélites do Músculo Esquelético para Estudos de Miogênese In Vitro

Aprenda a purificar progenitores miogênicos e adipogênicos do músculo esquelético murino usando digestão enzimática e citometria de fluxo. Este método permite analisar viabilidade celular e regeneração tecidual in vivo.

Purificação de Progenitores do músculo esquelético

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