RNAi Interferência por injeção dsRNA em Drosophila Os embriões

O objetivo geral deste procedimento é silenciar a expressão gênica endógena mediante a injeção de RNA de fita dupla em embriões de drosófila, a fim de identificar genes necessários para o desenvolvimento de órgãos. Isso é realizado primeiramente coletando e alinhando os embriões em uma linha reta. Em seguida, agulhas são preparadas e utilizadas para injetar RNA de fita dupla nos embriões.

Por fim, os embriões são colocados em uma câmara úmida para se desenvolverem. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram defeitos na fusão dos ramos traqueais de *Drosophila* por meio de coloração com anticorpos em embriões de estágio tardio, ou pela observação de larvas em microscópio de campo claro. A principal vantagem deste método em relação a técnicas existentes, como a triagem genética direta para identificar genes necessários para o desenvolvimento de órgãos, é que esta é uma abordagem genética reversa relativamente simples e rápida para analisar funções gênicas antes que um mutante para aquele gene esteja disponível.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia do desenvolvimento, como a identificação de genes essenciais necessários para o desenvolvimento do sistema traqueal de D. Este é um excelente modelo para estudar a morfogênese de órgãos de mamíferos, tais como as vias aéreas, sistema circulatório, ductos renais e epitélios exploratórios. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois leva tempo para aprender técnicas como alinhar embriões, quebrar agulhas e injetar RNA de fita simples nos embriões.

A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos envolvendo a quantidade de RNA de fita dupla injetada variam entre embriões, e a demonstração escrita de como são embriões sinciciais e de blastoderme pode ser difícil. Esses passos são difíceis de aprender porque injetar quantidades adequadas de RNA de fita dupla em embriões sinciciais de blastoderme é um passo tão crítico para reduzir efetivamente a expressão de genes endógenos.

Para começar, monte gaiolas a 25 graus Celsius utilizando moscas W 1 1 1 8 com dois a quatro dias de idade e troque as placas de suco de uva a cada hora durante o dia para sincronizar a coleta de ovos ao longo de um período de um a dois dias. Antes da coleta, colete embriões de syn city ou blaster derm por uma hora a 25 graus Celsius; em seguida, corte levemente uma linha no meio de um pedaço retangular de ágar de suco de uva com uma lâmina de barbear.

Use um bastão de metal para transferir embriões da placa de suco de uva para o pedaço de ágar com suco de uva. Alinhe cerca de 50 embriões em uma linha reta, com os eixos mais longos dos embriões em um ângulo de 45 graus em relação à linha no centro do ágar. Certifique-se de que todos os embriões estejam orientados na mesma direção, com suas extremidades posteriores apontando para longe da linha.

Corte um pedaço retangular de fita adesiva dupla face e cole-o em uma lamínula de 18 por 18 milímetros. Pegue os embriões utilizando a fita na lamínula. Coloque a lamínula em uma lâmina de vidro.

Pressione levemente os embriões contra a fita adesiva dupla face e deixe os embriões secarem ao ar por cerca de 10 minutos. Cubra os embriões com uma fina camada de óleo de halo carbono 700. Aguarde cerca de 10 minutos até que os embriões fiquem nítidos ao microscópio.

As agulhas são preparadas para microinjeção puxando tubos capilares de vidro. Utilizamos um puxador de agulhas da World Precision Instruments com as configurações de programa: aquecimento um, atraso quatro, traseiro.

Carregue a agulha com dois microlitros de RNA de fita dupla utilizando uma pipeta Einor P 20 com ponteiras micro loader einor. Prepare uma lâmina com uma lamínula limpa sobre ela e fixe-as juntas com fita adesiva. Posicione a agulha cheia contra a borda da lamínula, formando um ponto afiado.

O RNA de fita dupla vaza pela ponta da agulha. Quando o pedal do pico-bomba for pressionado, prepare uma lâmina com uma gota de óleo no centro. Insira a agulha na gota de óleo.

Ajuste a configuração da bomba de pico para expelir de 100 a 200 picolitros de RNA de fita dupla quando o pedal for pressionado. O RNA de fita dupla pode ser visto como uma pequena gota posicionada.

A ponta da agulha na porção posterior do primeiro embrião pressiona o pedal do pico bomba. O RNA de fita dupla aparecerá como um pequeno volume no local de injeção.

Finalize a injeção de RNA de fita dupla nos embriões sobre a lâmina. Elimine todos os embriões que não forem da linhagem blaster derm. Coloque a lamínula em uma câmara úmida tampada, como uma placa de Petri de plástico, a 18 graus Celsius, até que os embriões desenvolvam até o estágio embrionário ou larval desejado.

Para embriões que desenvolveram até o estágio embrionário desejado, utilize uma sonda para remover os embriões da fita dupla face e empurre-os até a borda da lamínula. Lave os embriões com heptano para um frasco de coleta com malha de náilon no fundo. Lave os embriões três vezes com PB contendo 50% de hipoclorito por cinco minutos e lave os embriões novamente três vezes com PBT.

Transfira os embriões do frasco de coleta para um pedaço de malha de náilon usando uma pipeta; mergulhe o pedaço de malha de náilon na solução fixadora. Fixe os embriões por 30 minutos. Remova a camada inferior da solução fixadora.

Em seguida, fixe os embriões com metanol, transfira-os para um tubo eppendorf e realize imunomarcação com os anticorpos A 12 e difusão, utilizando protocolos-padrão de coloração com anticorpos para embriões que desenvolveram até o estágio larval desejado. Prepare uma lâmina com uma gota de óleo de halo carbono 700 no centro e duas lamínulas pequenas em cada lado da gota de óleo. Transfira uma larva para a lâmina e, em seguida, aplique uma lamínula sobre a gota de óleo.

Observe as larvas ao microscópio de campo claro. Aqui são apresentados resultados representativos tanto da injeção de RNA de fita dupla com difusão quanto de RNA de fita dupla de GFP.

Embriões injetados com RNA de dupla fita de GFP mostram fusão traqueal normal e a proteína de difusão está presente nas células de fusão. As setas indicam as células de fusão positivas para difusão no tronco lateral e o asterisco indica a localização da fusão normal.

No entanto, embriões injetados com RNA de dupla fita mostram falha na fusão dos ramos e as proteínas de difusão não estão presentes nas células de fusão. O triângulo indica o local da falha na fusão dos ramos quando embriões injetados com RNA de dupla fita se desenvolveram até a fase larval. As larvas G-F-P-R-N AI mostram fusão normal dos ramos traqueais, indicada pelo asterisco.

Por outro lado, as larvas RN AI de difusão demonstraram falha na fusão dos ramos, indicada pelos triângulos. Esses resultados mostram o efeito da redução da expressão gênica endógena de difusão mediante injeção de RNA de fita dupla em embriões de drosófila. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de eliminar todos os embriões enseal blaster após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia do desenvolvimento explorarem a função de genes novos no desenvolvimento de órgãos em drosófila. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como silenciar genes endógenos mediante a injeção de RNA de fita dupla em embriões de drosófila.