Name: Todo Recordings celular do cérebro de adultos Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda a técnica de registro de célula inteira em neurônios isolados de cérebros de Drosophila adultos. Este método permite analisar a atividade elétrica de neurônios marcados com GFP em neurociência.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa NIH NS27501 para DKOD. Suporte adicional para este trabalho foi fornecida por um Grant Programa HHMI Professor para DKOD.

I. Dissecção de cérebros da mosca adulta <ol><li> Coloque uma pequena gota (~ mL 100) de dissecar solução no centro de uma placa de Petri 35 mm. </li><li> Pegar fêmea adulta utilizando aspirador. Sob microscópio de dissecação, use duas agulhas de seringa para decapitar a voar. </li><li> Cabeça no lugar uma pequena gota de solução salina de dissecação (com papaína adicionados) numa placa de Petri. </li><li> Posição com cabeça com tromba de frente para fundo do prato. </li><li> Segure a cutícula que cobre o olho composto esquerdo com agulha 1. Faça um corte diagonal que se estende desde o dorsal para a superfície ventral com agulha 2, apenas medial a agulha 1. </li><li> Segure o aparelho bucal com agulha e usar uma agulha de 2 para fazer um corte horizontal que se estende desde a superfície ventral do olho esquerdo para o olho direito, ao nível da base da tromba. </li><li> Segure a cutícula que cobre o olho composto direito, com agulha 1. Faça um corte diagonal que se estende desde o dorsal para a superfície ventral com agulha 2, apenas medial da agulha 1. </li><li> Gire a cabeça para que o lado rostral está na superfície placa de Petri. Insira a agulha 1 entre a cutícula rostral e cérebro, e usar agulhas de 2 a seguir o mesmo caminho como a primeira agulha. Idealmente, a cápsula será se desfazer do cérebro com ambos os lobos óptica anexada uma vez que estes são importantes na estabilização do cérebro para a gravação. </li><li> Traquéia, sacos de ar, e outros tecidos conectivos são cuidadosamente removidos com duas pinças de ponta fina. </li><li> Dissecção todo deve tomar 30-10 minutos </li></ol> II. Montagem do CNS <ol><li> O cérebro é transferido para a câmara de gravação usando uma pipeta de ponta amarela. </li><li> Na câmara de gravação, o cérebro é estabilizado pela colocação do quadro de platina de forma que dois mira bem fazer contato com o tecido na junção entre os lobos ópticos e região do cérebro central. </li><li> Cada cérebro é permitido descansar na câmara de gravação com perfusão contínua com solução salina oxigenada (95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5%) durante pelo menos 10 minutos. Perfusão da câmara com solução salina oxigenada é continuado durante todo o período de gravação. Preparação é visualizada utilizando um microscópio vertical (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Alemanha), com um palco fixo e uma objetiva de imersão 40x de água (Achroplan; abertura numérica, 0,8; Zeiss) e Nomarski óptica. GFP foi visto com um 505-530 BP de filtros de fluorescência. </li></ol> III. Eletrofisiologia <ol><li> Pipetas de 14/08 Mohms são usados ​​para gravações de células inteiras </li><li> Gravações braçadeira de tensão e corrente-clamp são realizadas usando uma Lista de EPC7 ou um amplificador Axopatch 200B, a Digidata 1322A DA conversor (dispositivos Molecular, Foster City, CA), um Dell Dimension 8200 computador (Dell Computer, Round Rock, TX), e pClamp 9 software (dispositivos Molecular). </li></ol>

<ol><li>Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+synaptic+transmission+in+Adult+Drosophila+Kenyon+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ.</a> Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).</li>
<li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li>
</ol>

A preparação do cérebro isolado todo ilustramos neste vídeo permite a avaliação dos mecanismos celulares subjacentes a excitabilidade ea transmissão sináptica em neurônios identificados, incluindo aqueles em vias de processamento olfativo, no adulto Drosophila cérebro (Gu e O Dowd, 2006). Esta abordagem é complementar ao estudo da atividade neuronal no cérebro de adultos intactos Drosophila (Wilson et all, 2004), em grande parte as gravações mesma forma dos neurônios em uma fatia do cérebro de mamíferos são complementares às gravações em ma...

<table><tbody><tr><td>#5 Pinça</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>N.º 11251-10</td><td>Tenha cuidado, nunca danifique as pontas finas da pinça</td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Reagente</td><td>Worthington Biochemical</td><td>3126</td><td>20 U/ml ativada por 1 mM de L-cisteína</td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Modelo SMZ-2B: C-PS</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Equipado com luzes de fibra óptica de pescoço de ganso posicionadas em um ângulo baixo</td></tr><tr><td>Agulha &amp;& Seringa </td><td></td><td>PrecisionGlide&amp;#174;?, Becton Dickinson & Co</td><td>305175 &amp;& 309602</td><td>Barato e durável</td></tr><tr><td>Microscópio ereto</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Equipado com platina fixa, objetiva de imersão em água de 40X, óptica Nomarski e lâmpada de fluorescência</td></tr><tr><td>Amplificador de grampo de membrana</td><td>200 B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conversor D-A Digidata </td><td>1322A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

todo recordings celular do cérebro de adultos drosophila

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para isolar toda cérebros de adultos Drosophila em preparação para gravar a partir de neurônios individuais. Começamos por descrever a solução de dissecação e captura das fêmeas adultas usadas em nossos estudos. O procedimento para a remoção de todo o cérebro intacto, incluindo ambos os lobos óptica, é ilustrado. Dissecção da traquéia sobrejacente também é mostrada. O cérebro isolado não é apenas pequena, mas necessita de cuidados especiais no manuseio, nesta fase, para evitar danos aos neurônios, muitos dos quais estão perto da superfície externa do tecido. Mostramos como um suporte especial que desenvolvemos é usado para estabilizar o cérebro na câmara de gravação. A eletrofisiologia padrão criado é usado para gravar a partir de neurônios individuais ou pares de neurônios. Uma imagem fluorescente, vistos através do microscópio de gravação, de uma linha de condução GAL4 expressão GFP (GH146) ilustra como os neurônios de projeção (PNs) são identificados no cérebro vivo. A imagem de alta potência Nomarski mostra uma visão de um único neurônio que está sendo alvo para gravação de células inteiras. Quando o cérebro é removido com sucesso sem danos, a maioria dos neurônios são espontaneamente ativos, disparando potenciais de ação e / ou exibindo entrada sináptica espontânea. Esta em preparação local, em que a gravação de células inteiras de neurônios identificados em todo o cérebro pode ser combinado com manipulações genéticas e farmacológicas, é um modelo útil para explorar fisiologia celular e plasticidade no SNC adulto.

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar toda cérebros de adultos Drosophila em preparação para gravar a partir de neurônios individuais usando a tecnologia de célula padrão todo. Inclui imagens de células GFP rotulados e neurônios visto durante a gravação.

Todo Recordings celular do cérebro de adultos Drosophila

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para isolar cérebros inteiros de Drosophila adultas em preparação para o registro de neurônios individuais. Começamos por...

Meu nome é, sou especialista assistente do Departamento de Anatomia e Neurobiologia na uc R one. E hoje vou explicar o procedimento, como realizar o registro integral no cérebro de PHA, sendo o procedimento-chave dessa preparação a forma de imobilizar a cabeça, como remover o cérebro e como remover o sistema TRICARE e o tecido G claro da superfície do cérebro. Hoje vou apresentar como preparar uma solução de dissecção para o registro de células inteiras no cérebro adulto de soft lab.O primeiro passo é preparar a solução; a segunda solução é realmente importante, sendo a chave para um bom preparo do cérebro adulto. Primeiro, colocarei cinco mililitros da solução coletada neste tubo de centrífuga. E então aqui tenho outro tubo pequeno.Vou adicionar um mililitro da solução preparada neste tubo ali, adicionar um pouco de sal e, em seguida, prepararei esta solução salina. Vou pipetar para cima e para baixo para obter uma boa solução salina. Depois, vou retirar 100 unidades de pepase deste frasco.Em seguida, colocarei esta pepana neste tubo de centrífuga. Como podem ver aqui, a solução está turva; então, adicionarei mais 100 µL de citrato e misturarei bem. Dez minutos depois, a solução f

whole-cell-recordings-from-brain-of-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

Este vídeo descreve como dissecar e isolar o cérebro adulto de Drosophila – um procedimento necessário para visualizar o órgão, que é obscurecido pela cutícula, olho e tecido traqueal. O protocolo de exemplo mostra uma demonstração detalhada produzindo preparações de alta qualidade que podem ser usadas para imunocoloração e métodos de imagem em neurobiologia de Drosophila.

drosófila Dissecção do cérebro adulto: um método em neurobiologia de moscas

O vídeo demonstra o registro extracelular da atividade neuronal do sistema nervoso central (SNC) de larvas de Drosophila. O SNC seccionado é posicionado em uma câmara de registro e a atividade elétrica de um nervo descendente é registrada para estabelecer a frequência de disparo da linha de base. Um agente de teste é então introduzido e a mudança na frequência de disparo é registrada para determinar o efeito excitatório ou inibitório do agente.

Registro extracelular da atividade elétrica no sistema nervoso central da drosófila

Os microeletrodos afiados permitem a caracterização eletrofisiológica precisa da saída de fotorreceptores e interneurônios visuais em Drosophila viva. Aqui, mostramos como usar esse método para registrar respostas de voltagem de alta qualidade de células individuais à estimulação de luz controlada. Este método é ideal para estudar o processamento de informações neurais em olhos compostos de insetos.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

As gravações de células inteiras dos fotorreceptores Drosophila melanogaster permitem a medição de solavancos escuros espontâneos, colisões quânticas, respostas macroscópicas à luz e relações tensão-tensão em várias condições. Em combinação com as ferramentas de manipulação genética de D. melanogaster , este método permite o estudo da via de sinalização inositol-lipídico ubíqua e seu alvo, o canal TRP.

Método eletrofisiológico para gravações de tensão de célula inteira de<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

O objetivo do presente protocolo é estabelecer ex vivo da drosófila cultura larval cérebro otimizada para monitorar circadianos ritmos moleculares com imagem de lapso de tempo a longo prazo da fluorescência. A aplicação deste método de ensaios farmacológicos também é discutida.

Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

Este artigo apresenta um método para testar as monosynaptic conexões entre neurônios empregando tetrodotoxina e o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac.

Examinando Monosynaptic conexões em drosófila usando os canais de sódio tetrodotoxina resistente

Este protocolo descreve um método para registrar a atividade elétrica descendente do sistema nervoso central Drosophila melanogaster para permitir que o custo-eficiente e conveniente de teste de agentes farmacológicos, mutações genéticas das proteínas neurais, e/ou o papel das vias fisiológicas inexploradas.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

Apresentamos um método especificamente adaptado para a imagem de todo o cérebro da Drosophila adulta durante o comportamento e em resposta a estímulos. A cabeça está posicionada para permitir acesso óptico a todo o cérebro, enquanto a mosca pode mover suas pernas e antenas, a ponta do proboscis, e os olhos podem receber estímulos sensoriais.

Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

Uma barreira significativa para o estudo da atividade celular durante processos cognitivos como aprendizado e memória é o uso de anestésicos para preparação de imagens in vivo . A anestesia prejudica a memória de curto prazo e a cognição em vários modelos, incluindo Drosophila. Este estudo apresenta um método único para preparar Drosophila adulta para imagens in vivo sem anestesia.

In vivo Imagem da atividade neural em moscas adultas Drosophila não anestesiadas

Aprenda a técnica de registro de célula inteira em neurônios isolados de cérebros de Drosophila adultos. Este método permite analisar a atividade elétrica de neurônios marcados com GFP em neurociência.

Todo Recordings celular do cérebro de adultos Drosophila

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