Proteína localização em Cultura de Células-tronco neurais 3D: uma Metodologia de visualização híbrida

Quando cultivadas em suspensão, as células progenitoras neurais isoladas de nichos neurogênicos do cérebro proliferam formando neuroesferas. Aqui, demonstramos o isolamento e o corte seriado de neuroesferas derivadas do hipocampo pós-natal em flutuação livre, para localizar a expressão proteica dentro da neuroesfera tridimensional. Realizaremos imunomarcação para uma proteína de interesse, neste caso, Conexina 29, seguida pela montagem e reconstrução de imagens microscópicas bidimensionais em uma representação tridimensional da neuroesfera.

A visualização de proteínas no contexto de suas estruturas tridimensionais nativas, como uma neuroesfera livre ou um tecido, permite uma melhor compreensão da função proteica com base na localização dentro dessas estruturas, além de permitir a inferência de possíveis regras para proteínas com localização conhecida, mas funções desconhecidas. Olá, sou Sophia Ambo do Laboratório de Regeneração Neural da Universidade de Ottawa. E sou Nicholas Valenzuela do Carlton Immersive Media Studio da Universidade Carleton em Ottawa.

Hoje demonstraremos como isolar, expandir e seccionar seriamente células progenitoras neurais pós-natais derivadas do hipocampo na forma de esferas neurais. A fim de localizar a expressão proteica por meio de imunomarcação, utilizaremos imagens bidimensionais dos cortes seriados de esferas neurais obtidos após a imunomarcação para ilustrar um método de reconstrução da localização celular e proteica na estrutura tridimensional e, assim, avaliar a organização espacial da expressão proteica ao longo das esferas neurais. Então, vamos começar.

Uma vez que os cérebros tenham sido coletados, prepare-os para colocá-los no porta-blocos, criando uma superfície plana para que os cérebros repousem adequadamente. Isso é chamado de bloco. Seccione o cerebelo usando uma lâmina de barbear e pinça.

Em seguida, coloque uma gota de cola instantânea sobre o mandril e fixe o primeiro cérebro a ela, com o lado anterior voltado para cima e o lado dorsal voltado para você. Prossiga da mesma forma com os demais cérebros; no caso do último cérebro, é prudente posicionar o lado dorsal afastado de você, pois o corte às vezes é incompleto nessa direção. Caso ocorra corte incompleto, use um bisturi para cortar e coletar a seção.

A velocidade é essencial na etapa de colagem, pois os cérebros não podem ficar expostos ao ar por muito tempo. Assim que todos os cérebros forem colados, o porta-blocos é colocado no vibrátomo e o suporte é preenchido com LCR gelado.

Defina o vibrátomo para uma frequência de 8,5 e uma velocidade de 3,5 a 4,5. Coloque a lâmina em contato com o LCR e configure o corte automático. Agora, cortaremos fatias de 500 mícrons.

Guarde as fatias que contêm o hipocampo. Coloque-as em um recipiente contendo A CSF gelada e descarte as demais fatias. Após a coleta de todas as fatias, prossiga para a dissecação do hipocampo.

Utilizando um microscópio estereoscópico, coletamos apenas o hipocampo dorsal aproximadamente entre bgma menos 1,65 milímetros e menos 2,10 milímetros. Coloque os hipocampos em uma placa vazia gelada. Quando todos os hipocampos tiverem sido coletados dos cortes, é hora de levá-los para a câmara de fluxo laminar para dissociação mecânica.

Usando um bisturi, pulverize a lâmina do bisturi com etanol 70% e flameje para esterilizar. Corte o tecido com o bisturi até que pareça líquido. Agora, utilizando meio de dissociação já contendo pepana DNAs e protease neural, colete o tecido por pipetagem e coloque em um tubo de 15 mililitros.

Para a digestão enzimática, coloque o tubo em uma estufa rotativa ajustada a 37 graus e deixe a digestão ocorrer por 45 minutos a uma hora. Após a conclusão da digestão, adicione 10 mililitros de PBS estéril para cultura de tecidos para interromper a reação enzimática e centrifugue as células a 300 × g por cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet.

Em cinco mililitros de PBS, use uma pipeta de Pasteur e pipete a amostra para dissociar ainda mais o tecido. Continue pipetando até que os pedaços de tecido não diminuam mais de tamanho. Nesse momento, reencapsule as células novamente.

Remova o PBS e ressuspenda o pellet em três mililitros de meio de manutenção. Depois de bem triturar a amostra, retire uma alíquota de 15 microlitros e misture-a com um volume igual de azul de trian.

Retire duas amostras de 10 microlitros e carregue um hemocitômetro para contagem celular. Conte as células de três campos em cada seção, perfazendo um total de seis campos. Faça a média dos números para calcular a densidade celular.

Levando em consideração que a amostra é diluída. Em placa de azul de tripano, semeie as células em placas de baixa aderência numa densidade de 2,5 × 10⁵ células por placa, em um volume final de cinco mililitros de meio de manutenção. Se placas de baixa aderência não estiverem disponíveis, você pode usar placas de Petri.

Neste caso, será necessário agitar suavemente as neuroesferas pela manhã e à tarde todos os dias durante os primeiros seis dias para que as neuroesferas não adiram ao fundo da placa. Adicione EG, F e FGF antes de colocar as placas no incubador. Esses fatores de crescimento precisarão ser repostos a cada dois dias durante todo o período de cultura. No dia 14 in vitro, fixe as neuroesferas utilizando formaldeído em uma concentração final de aproximadamente 4%, adicionando-o diretamente à cultura e incubando à temperatura ambiente por 20 minutos.

Com agitação, pelotize as células por centrifugação a 300 × g durante cinco minutos. Lave as células duas vezes com PBS e re-suspenda em uma solução de sacarose a 15-20% preparada em tampão fosfato 10 milimolar. Deixe em proteção crioprotetora a quatro graus por pelo menos 24 horas antes do corte em criostato.

Retire os neuroesferoides crioprotegidos do refrigerador e coloque-os em uma placa de 60 milímetros. Para o corte em série, no qual a coleta de cada única seção é essencial, verifiquei que o ideal é selecionar neuroesferoides de bom tamanho e forma usando um microscópio estereoscópico; com uma pipeta, coloque um neuroesferoide em um molde criogênico preenchido com composto OCT. Marque o local onde o neuroesferoide foi posicionado no molde criogênico.

Esta etapa ajudará a localizar a neuroesfera durante o corte. Após colocar rapidamente cinco a 10 esferas no molde, congele-as usando CO2. Usando as indicações no molde criogênico, marque diretamente no bloco congelado de OTC a localização das neuroesferas.

Remova o bloco de OCT do molde e coloque-o sobre o porta-objeto do criostato. Fixe o molde ao porta-objeto utilizando CO₂ e coloque-o no criostato. Deixe as amostras equilibrarem por pelo menos 30 minutos.

Uma vez feito isso, corte rapidamente nos marcos feitos no molde, então comece a coletar todas as seções a partir desse ponto. Verifique onde os cortes das neuroesferas começam usando um microscópio de luz. Após a conclusão do corte, guarde as lâminas em um congelador até que você esteja pronto para realizar a imunocitoquímica. Para esta etapa, retire as lâminas contendo uma das neuroesferas cortadas em série e inclua as lâminas com cinco seções anteriores e cinco seções subsequentes.

Isso garantirá que você visualize toda a neuroesfera. O uso de uma coloração nuclear de contraste será essencial para identificar todas as seções da sua neuroesfera. Tenha isso em mente ao planejar sua imunocoloração, enquanto aplica PBS nas lâminas e as deixa aquecerem até a temperatura ambiente por pelo menos cinco minutos; utilizamos um tampão de anticorpo que contém 0,3% de Triton X-100 para permeabilização e 3% de albumina sérica bovina para bloqueio.

Dilua seu anticorpo primário adequadamente neste tampão e incube na câmara humana durante a noite a quatro graus. Use PBS para fazer flutuar o paraforma dos neuroesferas e remova-o cuidadosamente com pinça. Esta é a primeira de quatro lavagens com PBS de cinco minutos.

Adicione o anticorpo secundário às lâminas e incube-as à temperatura ambiente por uma hora. Como antes, remova o paraforma da lâmina usando PBS e retire-o com pinça. Novamente, esta é a primeira de quatro lavagens com PBS de cinco minutos cada.

No terceiro lavagem, incluímos o HOS 3 3 2, 5 8 como contracoloração nuclear, que é diluído para 0,5 microgramas por mililitro. Em PBS, realiza-se mais uma lavagem de cinco minutos após a lavagem com hos. Após a conclusão de todas as lavagens, aplique uma quantidade generosa de meio de montagem na parte inferior da lâmina e cubra com uma lamínula de vidro.

Fixe os cantos com esmalte. Depois que todas as lâminas estiverem com lamínulas, fixe as demais bordas das lamínulas. Imagem a lâmina imediatamente ou armazene-as a menos 20 até que esteja pronto para fazê-lo.

Ao realizar a imagem, encontrar as células no lâmina é a parte mais difícil; será fácil detectar as células pertencentes à esfera se você procurá-las utilizando a coloração nuclear de contraste. Uma vez que encontrar o início da neuroesfera, que pode compor apenas algumas poucas células, realize a imagem de todas as seções a partir desse ponto. Tire imagens da coloração nuclear, da sua proteína ou proteínas de interesse e uma imagem de contraste de fase.

Esta imagem de contraste de fase será muito importante nas etapas de modelagem. Imagens com barras de escala residentes de 10 micrômetros e 50 micrômetros estabelecidas no software open lab 3.56 são importadas para o Photoshop CS4 usando um tamanho padrão de tela de 3.300 por 2.550 pixels.

Todas as imagens de cortes seriados são salvas como arquivos TIFF, mantendo o tamanho padrão da tela. Abra as imagens de contraste das fases primeira e segunda dos cortes seriados de neuroesferas. Aumente a transparência da segunda seção na guia imagem, abra a rotação da imagem e escolha arbitrário.

Gire a segunda seção até conseguir identificar pontos de continuidade geométrica e estrutural entre as imagens. Repita para todas as seções seriadas, salvando cada seção como uma camada separada. Certifique-se de que cada camada de imagem correspondente à fase e à expressão proteica esteja vinculada, de modo que todas as rotações para cada canal sejam realizadas simultaneamente.

Crie um plano no Maya com as mesmas proporções do arquivo do Photoshop, conforme indicado na linha de status da interface do usuário do Maya. Altere a barra de menus da configuração padrão de animação para superfícies. Use uma esfera de subdivisão primitiva para criar o corpo celular com a esfera selecionada.

Comece a manipular seus vértices clicando com o botão direito do mouse sobre o objeto e selecionando vértice no menu de marcação. Além disso, refine a superfície da esfera alterando o nível de exibição no menu de marcação, na aba de superfícies de subdivisão do menu principal. Abra a caixa de opções de colapso da hierarquia e defina o número de níveis para dois.

Recolha a esfera. Altere a barra de menu de superfícies para polígonos com a esfera selecionada. Abra a ferramenta de escultura de geometria na aba de malha do menu principal.

Aprimore a superfície da célula até sua forma final. Utilize o conjunto de ferramentas de escultura de geometria na guia de configurações de ferramentas. Repita este processo para cada célula da sua tipologia para simular a variedade de células progenitoras presentes nos neuroesferas.

Nesta demonstração, 10 células progenitoras diferentes formarão a base da neuroesfera. Selecione a tipologia celular e congele as transformações com as células da sua tipologia. Dois shaders de superfície serão estabelecidos para representar tanto as células que expressam a proteína conectina em 29 quanto as células onde a proteína está ausente.

Abra a janela hyper shade a partir da guia editor de renderização de janelas do menu principal. Escolha um shader de rampa na guia materiais de superfície. Abra o editor de atributos e defina os atributos de cor do shader, cor ambiente incandescente, mapa de relevo e cor especular.

Atribua uma textura Browniana 3D ao nó de cor ambiente e uma textura fractal 2D ao nó de mapeamento de relevo. Selecione as conexões de entrada e saída do shader resultante e exporte a rede selecionada. Selecione a tipologia celular e abra a caixa de opções de exportação da seleção.

Escolha o tipo de arquivo Maya A-S-C-I-I e desmarque a caixa incluir essas entradas para exportar a seleção. Abra o arquivo de seções seriadas alinhadas no Adobe Photoshop. Estabeleça uma chave de traços a lápis para marcar a localização de cada célula progenitora nas seções seriadas.

Nesta demonstração, uma chave de três traços. Um quadrado sólido. Um quadrado com uma linha tracejada e um quadrado com uma cruz serão usados para indicar se uma célula está localizada em uma, duas ou três seções.

Esta chave de traços é ainda definida pela cor vermelha representando células que expressam Conexion 29 e pela cor branca representando células que não expressam Conexion 29. Ative a camada de fase e comece a marcar o centro de cada célula progenitora com um traço de lápis branco. Utilize uma camada separada dentro da pasta da seção para construir seus mapas.

Alterne entre as seções para localizar a posição da célula, garantindo que as células em mais de uma seção sejam adequadamente indicadas. Com a camada CX 29 ativada, selecione as células que estão nas regiões onde CX 29 é expresso positivamente.

Escolha o comando preencher na guia editar da barra de menu principal do Photoshop e altere os traços brancos para vermelho com os mapas concluídos. Salve cada seção como uma imagem JPEG separada na pasta de imagens de origem do projeto Maya. Para isso, um novo projeto Maya precisará ser criado primeiro a partir da linha de status da interface do usuário do Maya.

Altere a barra de menu da configuração de animação padrão para polígonos e importe os planos. Faça ma e barra de escala. Arquivos ma da pasta projetos vistos com o plano selecionado.

Atribua um shader Lambert clicando com o botão direito do mouse no objeto e abrindo a guia atribuir novo material no editor de atributos. Clique na caixa quadriculada à direita do atributo de cor do material no menu pop-up. Escolha arquivo na seção de textura 2D sob a seção de atributo de arquivo no editor de atributos.

Clique no ícone de arquivo à direita do atributo do nome da imagem. Escolha a primeira seção da pasta de imagens de origem. Altere a câmera da janela de trabalho da vista perspectiva para a vista superior ortográfica padrão abrindo a guia desse painel.

Selecione a ferramenta criar polígono na guia de malha do menu principal e trace o contorno da seção. Escolha o primeiro mapa da pasta de imagens de origem e atribua-o ao plano de polígono recém-criado. Após seguir os passos estabelecidos para criar o plano de polígono com o objeto selecionado, escolha UV no menu de marcação clicando com o botão direito do mouse sobre o plano.

Selecione todos os pontos UV dos planos e abra o editor de textura UV a partir da guia janelas do menu principal; redimensione os UVs proporcionalmente para ajustá-los ao plano da seção. Repita este processo para cada seção da esfera neuros, garantindo que os espaços entre cada seção correspondam à altura da barra de escala da linha de status da interface do usuário do Maya. Altere a barra de menus da configuração padrão de animação para dinâmica, deixando visível apenas a primeira seção da esfera neuros.

Oculte todas as outras seções alterando as configurações de exibição na guia de exibição do menu principal com a caixa de opções das ferramentas de curva CV aberta, selecione uma opção linear nas configurações da curva CV. Visualizando a cena pela câmera de vista superior, comece a atribuir pontos aos mapas celulares, criando uma curva para as células negativas para CX 29 e outra para as células positivas para CX 29. As curvas resultantes são planas quando vistas pela câmera de vista lateral.

Aproxime a espessura das seções deslocando os pontos da curva no eixo Y, utilizando a barra de escala como referência. Repita este processo para cada seção da neuroesfera.

Importe o arquivo de tipologia celular. ma da pasta de cenas do projeto e duplique a tipologia celular para os progenitores CX 29 negativos e CX 29 positivos. Abra a janela hyper shade a partir da aba editores de renderização do menu principal.

Importe os shaders previamente criados, atribuindo-os às células da tipologia a partir da janela de estrutura. Remova o nome do arquivo do início dos objetos importados. Isso se tornará importante nas etapas posteriores do processo de modelagem.

Selecione a guia partículas no menu principal e crie um emissor de partículas para a primeira curva CV. Abra a guia forma da partícula um e, em atributos de emissão, altere a contagem máxima de menos um para o número de pontos na sua primeira curva. Na guia atributos de renderização, mude o tipo de renderização da partícula para superfície agregada.

Clique na caixa do tipo de renderização atual abaixo e altere o raio das partículas para 0,01. Anexe as partículas aos vértices da curva selecionando primeiro as partículas e, em seguida, mantendo a tecla Shift pressionada enquanto seleciona a curva.

Abra as opções de objetivo dentro da guia partículas do menu principal e defina o peso do objetivo como um. Clique em criar. Selecione as células da número um a 10 em ordem na janela de estrutura e abra a caixa de opções de substituição instantânea na guia partículas do menu principal.

Na caixa de objetos de instância, todas as 10 células devem ser listadas em ordem. Escolha o nome correto da forma da partícula na lista suspensa da guia de objeto de partícula para instância. Clique em criar. Por padrão, apenas a primeira célula selecionada substituirá as partículas ao longo da curva; para fazer com que todas as 10 apareçam e se alternem aleatoriamente entre as partículas, é necessária uma expressão.

Uma segunda expressão garantirá que as células emitam de forma aleatória da mesma maneira a cada vez. O controle deslizante de intervalo é reposicionado com o emissor selecionado. Abra o editor de atributos na aba de forma de partícula, em adicionar atributo dinâmico.

Clique na caixa geral abaixo do nome longo. Escreva índice_sorte na caixa de tipo de atributo, alterne de escalar para matriz por partícula e clique em adicionar na aba de atributos de matriz por partícula. Uma caixa índice_sorte foi adicionada.

Clique com o botão direito do mouse sobre o espaço vazio e selecione criar expressão na caixa de seleção. Digite o seguinte texto na caixa de expressão para concluir a expressão. Abra a guia de substituição de geometria de pesquisa instantânea no editor de atributos e na opção geral índice do objeto.

Selecione um índice sublinhado aleatório na lista suspensa. Posicione o controle deslizante de tempo no primeiro quadro e clique em reproduzir. Os tipos celulares agora estão distribuídos aleatoriamente entre as partículas.

Repita este processo para cada seção da neuroesfera. Certifique-se de que cada nova instância de emissor e índice aleatório seja diferenciada por nome e organizada adequadamente na janela de estruturação no renderizador. Na seção da janela de configurações de renderização, altere o renderizador de Maya Software para Mental Ray.

Abra a guia qualidade e, em rastreamento de raios, altere a configuração de reflexão para zero. Abra a guia buffer de quadros e mude o recorte de cor de bruto para alfa e desmarque Pré-multiplicar.

Abra o editor de camadas da caixa de canais e altere as configurações do editor de camadas de exibição para renderização. Selecione as células importadas da tipologia e clique no ícone criar nova camada e atribuir objetos selecionados. Renomeie a camada como oclusão ambiente.

Clique com o botão direito do mouse sobre a camada recém-criada, selecione atributos no menu à direita da caixa de camada de renderização. Clique no botão de predefinições e selecione oclusão na lista suspensa. Selecione a aba MIB_amb_occlusion1 e altere as amostras de 16 para 256.

Reabra o editor de camadas da caixa de canais e, na guia opções, abra a caixa de opções renderizar todas as camadas, selecione composição e mantenha as camadas com a camada de oclusão ambiental selecionada. Altere de normal para multiplicar na caixa suspensa logo acima da lista de camadas, renderize duas passagens da neuroesfera, uma vez com a camada de oclusão ambiental ativada e outra vez com a camada mestra ativada. Salve as imagens como arquivos IFF na pasta de imagens do projeto.

Abra ambas as imagens no Adobe Photoshop. Posicione a camada de oclusão ambiental acima da camada mestre e defina-a como multiplicar. Crie um plano de fundo e aplique achatamento à imagem.

Acabamos de mostrar como cultivar células neurogênicas derivadas do hipocampo na forma de neuroesferas, como seccionar serialmente culturas de neuroesferas utilizando um criostato e como realizar a imunomarcação para uma proteína de interesse. Também mostramos como modelar a localização espacial da expressão dessa proteína em três dimensões, utilizando uma combinação de registro de cultura celular e software de modelagem tridimensional.

Esperamos que isso ajude você e boa sorte em seus experimentos.