Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Sou Troy Gasai. Vamos falar sobre um ensaio com fatias organotípicas que foi aperfeiçoado no meu laboratório ao longo dos últimos anos. Ben Jacket, do meu laboratório, mostrará a você como este ensaio é realizado.

O ensaio com fatias organotípicas do cérebro pós-natal é um método poderoso para testar diversos fatores e o papel deles na migração neuronal no cérebro pós-natal e na via migratória TRO. Olá, sou Ben Jakay. Sou pesquisador pós-doutorando no laboratório da Dra. Troy GGE no Colegiado de Medicina Veterinária da Universidade Estadual do Norte da Carolina, e estou aqui hoje para mostrar como realizamos transplantes cruzados de tecido entre fatias organotípicas do cérebro de camundongos, com o objetivo de visualizar neuroblastos em migração no cérebro pós-natal.

Todas as técnicas descritas neste vídeo devem ser realizadas em um ambiente estéril, preferencialmente em uma cabine de fluxo laminar utilizando instrumentos esterilizados. Uma gota de 150 microlitros de meio para fatias é colocada no centro da parte de vidro, na base do recipiente, com uma seringa descartável equipada com agulha de 23 graus. Vários pontos de cola são colocados fora do círculo da lamínula de vidro, deixando um lado sem cola para permitir a troca de fluido. Uma membrana de poros nucleares é então cuidadosamente colocada sobre o meio com pinça microcirúrgica, garantindo que bolhas de ar não fiquem aprisionadas sob a membrana.

A pinça curva é então usada para aplainar as gotas de cola e fixar a membrana no lugar. Um mililitro de meio para fatias é adicionado sobre a membrana, e, por fim, as placas são colocadas em uma incubadora até o momento de uso. Os melhores resultados são obtidos quando as fatias são preparadas a partir de camundongos pós-natais jovens, do P um ao P dez; primeiramente, a cabeça é estabilizada segurando-se o focinho com pinças microcirúrgicas.

A pele é excisada longitudinalmente do pescoço até o focinho. O couro cabeludo é destacado para expor o osso, e o crânio é cortado longitudinal e anteriormente, começando na crista sagital, realizando um corte mediano e dois cortes laterais, um em cada lado. Deve-se ter cuidado para minimizar o contato com o tecido cortical subjacente.

À medida que as abas cranianas são removidas do cérebro para melhorar a estabilidade do tecido. Durante o corte com vibrotesoura, as regiões laterais e caudais do cérebro são removidas com uma lâmina de barbear. Os dois hemisférios são cuidadosamente retirados do crânio e colocados com a superfície medial voltada para baixo em um molde de inclusão.

Eles são imediatamente cobertos com gel de AGA roses a 3% grau DNA derretido, dissolvido em tampão de preparação tecidual mantido a 37 graus Celsius. Após dois minutos de estabilização sobre uma superfície plana e horizontal. Para garantir a solidificação uniforme do AGA roses, as formas são posicionadas sobre gelo para completar a cura.

Uma vez que o gel contendo os hemisférios esteja solidificado, ele é removido do molde e aparado ao redor do tecido cerebral. O tecido embutido em gel é então montado no disco de espécime do vibrátomo com a superfície medial voltada para cima e fixado com adesivo de cianoacrilato. O disco é então instalado na bandeja de espécimes do vibrátomo, preenchida com meio de preparação de tecidos gelado, e o cérebro é seccionado com espessura de 150 micrômetros.

Uma vez que os fragmentos contendo a ZMS são liberados da lâmina, eles são cuidadosamente recolhidos com uma espátula plana pequena e colocados horizontalmente no centro das placas de cultura. É fundamental que o manuseio dos fragmentos seja mantido no mínimo, pois o tecido é muito frágil. A quantidade de meio nas placas de cultura é ajustada a um nível suficiente para cobrir as secções cerebrais, ao mesmo tempo que evita que elas se movimentem.

As lâminas são identificadas e transferidas para uma estufa. Os cérebros de doador são preparados de maneira semelhante à dos cérebros de receptor, exceto pelo fato de que os cortes são feitos com espessura de 250 µm e as fatias são coletadas em gelo.

Preparação de tecido frio. Os cortes são imediatamente colocados sob um microscópio estereoscópico com capacidade de fluorescência epiluminescente. A RMS é visível como uma estrutura cinza em forma de U que se estende da zona subependimária até o bulbo olfativo.

O SMS é delicadamente microdisssecado usando pinças microcirúrgicas. Uma pinça é usada para estabilizar a fatia enquanto a outra é utilizada para fazer pequenos cortes ao redor do SMS até que ele seja liberado da fatia. O SMS excisado é então cortado em pequenos explantes de aproximadamente 200 a 500 micrômetros de diâmetro.

Neste exemplo, os "explanos" de berinjela são preparados a partir de camundongos que expressam a proteína fluorescente vermelha TD-tomate. As placas inferiores contendo fatias de hospedeiro são retiradas do incubador e colocadas sob o microscópio estereoscópico utilizando luz visível. Uma pequena incisão é feita no segmento inicial da RMS e, com uma pipeta equipada com ponteira de 20 microlitros, um único explante de RMS doador é transferido para o local incisado na RMS do hospedeiro.

O explante é suavemente empurrado para dentro da incisão para estabelecer o contato entre os dois tecidos. Para garantir que esse contato seja estável, os explantes são empurrados levemente entre a fatia e a membrana pobre em núcleos. Em seguida, as placas são devolvidas ao incubador por pelo menos uma hora para permitir que as seções assentem sobre a membrana.

O neuroblasto deve começar a migrar do explante para a RMS do hospedeiro após aproximadamente uma a duas horas. A migração celular é melhor visualizada utilizando objetivas de 20 vezes com distância de trabalho extra longa. Os tecidos cultivados são transferidos do incubador para uma câmara aquecida no microscópio.

Neuroblastos fluorescentes podem ser imagiados em intervalos que variam de zero a 10 minutos, dependendo do tipo de análise desejada. Nosso protocolo de cultura de fatias orgânicas típicas foi amplamente testado e otimizado nos últimos anos quanto à consistência no padrão e orientação da migração na RMS. Neste exemplo, a análise de células que imigram a partir do explante, obtido de camundongos nos quais o TD-tomate é expresso sob o promotor nestina, revela migração altamente orientada e rápida para dentro da RMS do hospedeiro.

Alta ampliação. A análise de lapso de tempo mostra excelente resolução de todo o comprimento de um neuroblasto migratório durante uma sessão de imageamento de 20 minutos. Após a conclusão do imageamento, as fatias podem ser fixadas com paraformaldeído a 4%, recém-preparado e gelado, e submetidas à imuno-histoquímica para diferentes componentes do fluxo de migração.

Neste caso, astrócitos positivos para GFAP em azul e vasos sanguíneos positivos para CD31 em verde são revelados por meio de imunohistoquímica fluorescente; a análise em alta magnificação de cortes corados para as proteínas do citoesqueleto actina em azul e tubulina em verde revela expressão não uniforme desses componentes por uma célula em plena migração. Nosso protocolo apresenta alguns desafios que exigem paciência, prática e dedicação de tempo tanto para a preparação quanto para a análise dos seus resultados.

Aqui estão algumas sugestões úteis que ajudarão você a obter os melhores resultados em seus experimentos. Em nossa experiência, camundongos na faixa etária de P1 a P10 fornecem os melhores resultados. O emparelhamento etário entre cérebros de doador e receptor também melhora a reprodutibilidade dos experimentos.

Como a maioria dos reagentes e placas de cultura precisa ser preparada recentemente, nosso ensaio com fatias exige várias horas de preparação e aquisição de imagens ininterruptas em um único dia. Assim que os cérebros forem coletados, os passos subsequentes devem ser realizados o mais rapidamente possível. Entre a decapitação e o preparo das fatias, todos os procedimentos devem ser feitos com gelo, reagentes frios, e a manipulação do tecido deve ser mantida no mínimo para evitar perturbações anatômicas.

As ferramentas utilizadas para essas dissecações devem ser estéreis e reservadas exclusivamente para manipulações de tecidos vivos. Nunca utilize ferramentas que tenham entrado em contato com fixadores como o formaldeído. Os fragmentos geralmente permanecem viáveis por até 36 horas, com declínio visível na migração, velocidade e orientação entre 24 e 36 horas.

Atente-se a esta limitação ao planejar seus experimentos e análises.