Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Eu sou Troy Gasai. Vamos falar sobre um ensaio de fatia organotípica que foi aperfeiçoado em meu laboratório nos últimos anos. Ben jacket em meu laboratório demonstrará a você como este ensaio é realizado.

O ensaio de fatia organotípica do cérebro pós-natal é um método poderoso para testar vários fatores e o papel na migração neuronal no cérebro pós-natal e no fluxo migratório TRO. Olá, sou Ben Jakay. Sou pós-doutorando no laboratório Dr.Troy gge na Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Estadual da Carolina do Norte, e estou aqui hoje para mostrar como realizamos o transplante cruzado de tecido entre fatias de cérebro de camundongo organotípicas para visualizar a migração de neuroblastos no cérebro pós-natal.

Todas as técnicas descritas neste vídeo devem ser realizadas em um ambiente estéril, de preferência uma capela de fluxo laminar usando ferramentas esterilizadas. Uma gota de 150 microlitros de meio fatiado é colocada no centro do copo, parte inferior do prato com uma seringa descartável equipada com uma agulha de calibre 23. Vários pontos de cola são colocados fora da lamínula de cobertura de vidro circular, deixando um lado descolado para troca de fluidos Uma membrana de poros nucleares é então colocada suavemente no topo do meio usando micro fórceps, garantindo que as bolhas de ar não fiquem presas sob a membrana.

A pinça curva é então usada para achatar os pontos de cola e prender a membrana no lugar. Um mililitro de fatia média é adicionado no topo da membrana e, finalmente, os pratos são colocados em uma incubadora até a hora de usar. Os melhores resultados são obtidos quando as fatias são preparadas a partir de camundongos pós-natais jovens, P um a P dez primeiro, a cabeça é estabilizada segurando o focinho com micro fórceps.

A pele é excisada longitudinalmente do pescoço ao focinho. O couro cabeludo é arrancado para expor o osso e o crânio é cortado longitudinalmente e anteriormente começando no esterno magna, fazendo um corte medial e dois laterais, um de cada lado. Deve-se tomar cuidado para minimizar o contato com o tecido cortical subjacente.

Como os retalhos cranianos são removidos do cérebro para melhorar a estabilidade do tecido. Durante a secção do vibram, os aspectos laterais e codais do cérebro são removidos com uma lâmina de barbear. Os dois hemisférios são cuidadosamente retirados do crânio e colocados na superfície medial em um molde de incorporação.

Eles são imediatamente cobertos com gel de rosas AGA de grau 3% DNA derretido dissolvido em tampão de preparação de tecido que é mantido a 37 graus Celsius. Após dois minutos de estabilização em uma superfície plana horizontal. Para garantir um endurecimento uniforme das rosas de aga, os moldes são posicionados no gelo para completar a pega.

Uma vez que o gel contendo os hemisférios é definido, ele é removido do molde e aparado ao redor do tecido cerebral. O tecido embebido em gel é então montado no disco de amostra do tom vibratório com uma superfície medial para cima e fixado com adesivo de cianoacrilato. O disco é então instalado na bandeja de amostra de vibração preenchida com meio de preparação de tecido gelado e o cérebro é seccionado com 150 micrômetros de espessura.

Uma vez que as fatias contendo RMS são liberadas da lâmina, elas são cuidadosamente retiradas usando uma pequena espátula de cabeça chata e colocadas no centro das placas de cultura. É fundamental que o manuseio das fatias seja reduzido ao mínimo, pois o tecido é muito frágil. A quantidade de meio nas placas de cultura é ajustada para o nível suficiente para cobrir as seções do cérebro, evitando que elas se movam.

Os pratos são rotulados e transferidos para uma incubadora. Os cérebros dos doadores são preparados de maneira semelhante à dos cérebros dos receptores, exceto que as seções são cortadas em 250. A espessura do micrômetro e as fatias são coletadas no gelo.

Preparação de tecidos frios. As fatias tampão são imediatamente colocadas sob um microscópio de dissecação com capacidade de epifluorescência. O RMS é visível como uma estrutura cinza em forma de U que se estende da zona subependimária até o bulbo olfatório.

O RMS é suavemente microdissecado usando micro fórceps. Uma pinça é usada para estabilizar a fatia, enquanto a outra é usada para fazer pequenos cortes ao redor do RMS até que ela seja liberada da fatia. O RMS excisado é então cortado em pequenas explanações x de aproximadamente 200 a 500 micrômetros de diâmetro.

Neste exemplo, as berinjelas são preparadas a partir de camundongos que expressam a proteína fluorescente vermelha, vidro de tomate TD. Os pratos de fundo contendo fatias de hospedeiro são removidos da incubadora e colocados sob o microscópio de dissecação usando luz visível. Uma pequena incisão é feita no segmento inicial do RMS e, usando um pipeter equipado com uma ponta de 20 microlitros, um único doador RMS Explan é transferido para o local incisado no RMS hospedeiro.

A explicação é gentilmente empurrada para dentro da incisão para estabelecer contato entre os dois tecidos. Para garantir que esse contato seja estável, o explane é empurrado levemente entre a fatia e a membrana nuclear pobre. Os pratos são então devolvidos à incubadora por pelo menos uma hora para permitir que as seções se depositem na membrana.

O neuroblasto deve começar a migrar do explan para o RMS do hospedeiro após aproximadamente uma a duas horas. A migração celular é melhor visualizada usando objetivas de potência de 20 distâncias de trabalho extra longas. Os tecidos cultivados são transferidos da incubadora para uma câmara incubada no microscópio.

O neuroblasto fluorescente pode ser visualizado em intervalos que variam de zero a 10 minutos, dependendo do tipo de análise desejada. Nosso protocolo de cultura de fatias típicas orgânicas foi exaustivamente testado e otimizado nos últimos anos para consistência no padrão de migração e orientação no RMS. Neste exemplo, a análise de células que imigram do explan, obtidas de camundongos nos quais o tomate TD é expresso sob o ninho no promotor, revela uma migração rápida e altamente orientada para o RMS hospedeiro.

Alta ampliação. A análise de lapso de tempo mostra excelente resolução de toda a extensão de um neuroblasto migratório durante uma sessão de imagem de 20 minutos. Uma vez concluída a imagem, as fatias de pele devem ser fixadas com gelo, frio e recém-preparado, 4% de paraforme, aldeído e imunocoloração para diferentes componentes do fluxo de migração.

Neste caso, astrócitos positivos para GFAP em azul e vasos sanguíneos positivos para CD 31 em verde são revelados usando imuno-histoquímica fluorescente, análise de alta ampliação de fatias coradas para as proteínas do citoesqueleto actina em azul e tubulina em verde revelam expressão não uniforme desses componentes por uma célula. Em meio à migração. Nosso protocolo apresenta alguns desafios que exigem paciência, prática e tempo comprometido tanto com a preparação quanto com a análise de seus resultados.

Então, aqui estão algumas sugestões úteis que ajudarão você a obter os melhores resultados de seus experimentos. Em nossa experiência, camundongos na faixa etária de P um a P 10 fornecem os melhores resultados. A correspondência de idade entre os cérebros do doador e do receptor também melhora a reprodutibilidade dos experimentos.

Como a maioria dos reagentes e placas de cultura deve ser preparada na hora, nosso ensaio de fatia requer várias horas de preparação e imagem ininterruptas em um único dia. Uma vez que os cérebros são colhidos, as etapas de consequência devem ser realizadas o mais rápido possível. Entre a decapitação e a preparação das fatias, todas as etapas devem ser realizadas com gelo, reagentes frios e a manipulação do tecido deve ser reduzida ao mínimo para evitar rupturas anatômicas.

As ferramentas utilizadas para essas dissecções devem ser estéreis e reservadas apenas para manipulações de tecidos vivos. Nunca utilize ferramentas que já estiveram em contato com fixadores como formaldeído. As fatias são geralmente viáveis por até 36 horas, com declínio visível na migração, velocidade e orientação entre 24 e 36 horas.

Cuidado com essa limitação ao planejar seus experimentos e análises.