Name: Técnica heterocário para Análise de Localização Celular Tipo específico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a técnica heterocário para analisar a localização de proteínas específicas de tipos celulares usando fusão com polietilenoglicol e microscopia de fluorescência. Este método permite estudar dinâmicas nucleocitoplasmáticas em biologia celular e do câncer.

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Gostaríamos de agradecer ao Worcester Polytechnic Institute Departamento de Química e Bioquímica para financiamento.

1. Transfecção de linhas celulares Método transfecção 1 (Lonza Nucleofection para a eficiência de transfecção de células primárias aumentada) <ol><li> As células devem ser de passagem recente e em crescimento log fase anterior à transfecção. Lavar as células em tampão fosfato salina (PBS) e células de colheita por tripsinização. </li><li> Coletar células por centrifugação a 1500 xg por 5 minutos. </li><li> Adicionar lamínulas esterilizadas a uma placa de seis poços. Lamínulas podem ser revestidos para a adesão celular reforçada. Coloque 1,5 mL de meios de cultura (neste caso, meio modificado Dulbecco Águia (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS)) em cada poço e equilibrar os meios de comunicação na incubadora. </li><li> Colher as células por tripsinização e ressuspender em um volume mínimo de tampão fosfato (PBS). </li><li> Contar as células e centrifugar a quantidade correta de ressuspensão de fornecer ~ 5x10 5 células por amostra. </li><li> Ressuspender as células com cuidado em 100 mL de solução Nucleofector temperatura ambiente por amostra. </li><li> Combine 100 L da suspensão de células com 5 mg DNA plasmidial e transferência da amostra para um Cuvette Nucleofector tomando cuidado para não incluir bolhas de ar. </li><li> Selecione o programa apropriado Nucleofector (isso pode exigir testes anteriores para estabelecer a eficiência de transfecção ótima com a mortalidade mínima). </li><li> Inserir a cubeta contendo a suspensão de células / DNA para o Titular Cuvette Nucleofector e iniciar o programa selecionado. </li><li> Após a conclusão, remova a cubeta e adicione ~ 500 mL dos meios de comunicação pré-equilibradas cultura a ele (retirado da placa de 6 poços). </li><li> Transferir imediatamente a amostra no prato 6-bem com volume final de 1,5 mL por poço. Células deve ser banhado em qualquer populações mistas ou separadamente, para os controles. </li></ol> Método 2 transfecção (Qiagen Effectene transfecção de linhas celulares) <ol><li> Prepare complexos transfecção usando o reagente Qiagen Effectene pela primeira adição de 0,8 mg de cada amostra de DNA plasmidial a 200 mL de buffer CE. </li><li> Adicionar 6,4 mL de reagente potenciador para cada amostra, misturar brevemente sacudindo o tubo e incubar por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 20 mL de reagente Effectene a cada amostra de mistura, sacudindo o tubo e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Durante esta incubação, preparar a duas linhas de células de interesse para transfecção. Lave as células recentemente várias passagens (&lt;confluência de 80%) uma vez em tampão fosfato salino (PBS). Adicionar 1,5 mL de volta meio de crescimento fresco aquecido e equilibrado (neste caso, meio modificado Dulbecco Águia (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS)). </li><li> Uma vez que os complexos de transfecção têm incubadas por 15 minutos, transferir 1,2 mL de mídia para cada amostra. Mix por pipetagem, e transferir imediatamente 700 mL ~ dos complexos a cada um dos dois poços na placa de 6 poços. Adicione gota a gota, e misture suavemente agitando o prato. Permitir que as células transfectar por pelo menos 3 horas (pode variar com o tipo de célula). </li><li> Adicionar lamínulas esterilizadas a uma placa de 6-novo poço. Lamínulas podem ser revestidos para a adesão celular reforçada. </li><li> Depois que as células têm transfectadas, lave as células duas vezes com PBS e colher as células por trysinization mínima, adicionando cerca de 100 mL de solução de tripsina a cada poço, agitar brevemente a placa de revestimento totalmente cada poço, e imediatamente aspiração fora da tripsina. Uma vez que as células têm levantado, adicionar 1,5 mL de mídia fresco. </li><li> Neste ponto, as células devem ser banhado em populações mistos ou separados (para controles) para o lamínulas estéreis. </li><li> Permitem que as células para recuperar por 12 horas. </li></ol> 2. Fusão celular <ol><li> Remova a mídia de cultura de células e lavar duas vezes com PBS. </li><li> Neste ponto, é recomendado para tratar as células com cicloheximida (100 mcg / mL) para inibir a síntese de proteínas. Permitir que as células para incubar por 2 horas e depois lave as células duas vezes com PBS. </li><li> Células fusível, expondo-os a uma solução de 50% de polietileno glicol 1000 (PEG 1000) no soro livre de DMEM para 125 segundo a temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com PBS para remover a solução de PEG 1000, e adicionar 2 mL recém-aquecido e media equilibrada. </li><li> Permitir que as células incubar por 18-24 horas. </li></ol> Microscopia de fluorescência <ol><li> Remova a mídia, cultura e lave as células duas vezes em PBS. </li><li> Fix células adicionando 1 mL de uma solução de paraformaldeído a 4% (em PBS) a cada poço. Agite suavemente por 15 minutos. </li><li> Lave as células fixas duas vezes em PBS. </li><li> Remova cuidadosamente a lamínulas da placa, pavio off PBS excesso. Inverter para microscópio slides carregado com uma gota de meio de montagem (90% de glicerol, 100mM Tris pH 7,5, DABCO 2% (1,4-diazabicoyclo octanagem) contendo DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole). </li><li> Retire o excesso de meio de montagem das lâminas, e selar cover desliza com unha polonês. </li><li> Visualize as células através de microscopia confocal ou epifluorescência. </li></ol> 3. Resultados representante A Figura 2 mostra um experimento heterocário exemplo usando fibroblastos primários e H1299 de células não pequenas células de carcinoma de pulmão. A proteína de interesse neste experimento (Chicken Anemia Virus-VP3) exibe a localização citoplasmática principalmente em tipos de células primárias e localização nuclear em tipos de células transformadas como visualizado por microscopia de epifluorescência. A proteína é expressa como uma fusão ou GFP (pEGFP-N1 vetor, Clontech) em fibroblastos prepúcio primária (PFF) ou dsRed (dsRed-N1 vetor, Clontech) em células H1299. Amostras de controle que envolve auto-fusão (duas primeiras linhas) exibir células multinucleadas, sem qualquer alteração nos padrões de steady-state de localização. Tais mudanças poderiam ocorrer devido a sensibilidade às condições de fusão ou a formação de syncitia. Fusões heterocário (linha inferior) demonstram entrada nuclear da proteína GFP-fundidas derivadas de células-primária e co-localização com a proteína dsRed fundida em resposta à introdução de material celular transformada. O exemplo mostrado é uma fusão heterocário relativamente rara, resultante de apenas duas células, uma de cada tipo, como demonstrado pela presença de ambos os sinais fluoroprotein. Além de detectar estes tipos de transições de localização, atividade shuttling nucleocytoplasmic pode ser facilmente detectada pela presença de um fluoróforo única em ambos os núcleos. Este tipo de determinação é clara quando se examina 01:01 fusão de células e dependeria de inibição da tradução. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma do método heterocário usando fibroblastos primários e H1299 não-pequenas células de carcinoma de células. O gene de interesse é clonado para produzir uma fusão em frame-a um dos dois genes da proteína fluorescente. Linhas de células são, então, transitoriamente transfectadas com tanto construir e tempo para se recuperar. Heterocário formação é induzida pelo tratamento breve com polietileno glicol (PEG), seguido por incubação adicional. Finalmente, a localização sub-celular da proteína de interesse é observado usando várias formas de microscopia de fluorescência. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Tráfico Nucleocytoplasmic e shuttling atividade da proteína Anemia Virus Chicken VP3 visualizado por fusão heterocário. Linha superior: Imagens representativas de auto-fusão H1299 células que expressam dsRed-VP3 linha Médio:.. Representante imagens de epifluorescência das células do prepúcio primárias de fibroblastos (PFF) expressando GFP-VP3 após a fusão PEG Linha inferior: a fusão heterocário de PFF e H1299 células. Amarelo indica co-localização de GFP e sinais dsRed. As células foram fotografadas usando um microscópio de fluorescência Leica AF6000E Leica e software de imagem.

<ol><li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li>
<li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li>
<li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP%2FNXF1%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li>
<li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li>
<li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+Hormone+Receptor+%CE%B11+Follows+a+Cooperative+CRM1%2FCalreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li>
<li>Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptin+Nucleocytoplasmic+Shuttling+Is+Required+for+Cell+Type-Specific+Localization%2C+Apoptosis%2C+and+Recruitment+of+the+Anaphase-Promoting+Complex%2FCyclosome+to+PML+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies.</a> J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).</li>
<li>Jeffries, S., Capobianco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+by+Notch+requires+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization.</a> Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).</li>
<li>Keaton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+trafficking+of+G2%2FM+regulators+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).</li>
<li>Ling, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-Cytoplasmic+Shuttling+Is+Not+Required+for+the+Epstein-Barr+Virus+EBNA-LP+Transcriptional+Coactivation+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function.</a> J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).</li>
<li>Lin, X. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RXR%CE%B1+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li>
<li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li>
<li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo heterocário apresentado aqui fornece um método eficiente e facilmente interpretável para a caracterização de células comportamento de localização de tipo específico, assim como a atividade shuttling nucleocytoplasmic. Este método aproveita a sensibilidade de análise de fluorescência, bem como a capacidade de células de imagem ao vivo e realizar estudos da dinâmica de proteínas. A técnica é facilmente adaptado para vários tipos de células diferentes e é passível de ambas as imagens de células vivas e fixas. Por exemplo, a microscopia de fluorescência invertido pode ser usado para geração de imagens ao vivo e captura de vídeo em tempo lapso. Em contraste, as células montado pode ser utilizado em qualquer microscopia de epifluorescência, para determinação do estado estacionário ou localizações mais detalhada imagem confocal de localizações discretas. Além disso, técnicas como a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP), ou perda de fluorescência em fotobranqueamento (FLIP) pode ser usado na determinação da cinética de localização 1. A incorporação de fluoróforos alternativo no protocolo permitiria experimentos de interação de proteínas como a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), a ser realizada em conjunto 2. Vários inibidores de tráfico de celulares, tais como B leptomycin ou negativo dominante Ran constrói GTPase pode ser usada para estabelecer a dependência de importação particular ou vias de exportação 5,6,9. <ul><li> Em certos experimentos envolvendo shuttling atividade, os cuidados devem ser tomados para evitar os efeitos de localização, devido à síntese de novas proteínas. Nestes casos, os inibidores da tradução ou pontos de tempo limitado deve ser usado. No entanto, artefatos devido à inibição traducional continuam a ser uma possibilidade. Fusão de células que contêm um de cada tipo de célula são mais desejados para a interpretação clara do shuttling e comportamento de localização. Otimização do número de células e as condições de fusão (tempo e concentração) pode ser necessário para promover tais eventos de fusão favoráveis ​​01:01. </li><li> É importante notar que a otimização de determinadas etapas no protocolo serão necessários dependendo dos tipos de célula em particular usados. Aspectos do procedimento experimental, como a eficiência de fusão, a eficiência de transfecção e viabilidade após a fusão pode variar muito entre os tipos de células. Em particular, os tipos de célula primária pode ser um desafio para gerenciar devido às condições de cultura complexa e eficiências de transfecção baixo. Uso de tecnologias como o dispositivo Nucleofector Lonza pode permitir o processamento rápido de células, bem como a eficiência de transfecção aumentou dramaticamente. Além disso, os métodos de eletroporação permitir a fácil transferência de células em suspensão para as etapas de fusão que se seguem. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>reagente Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023602</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modificado de Eagle&amp;rsquo;meio s (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td>Glicose alta</td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Soro Hyclone (bovino fetal)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Placas Falcon de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>528875-25GM</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector HDF kit</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

técnica heterocário para análise de localização celular tipo específico

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Um número significativo de proteínas são reguladas pelo tráfico ou subcelular nucleocytolasmic shuttling. Estas proteínas exibir uma gama diversificada de funções celulares, incluindo a importação nuclear / exportação de RNA e proteínas, regulação da transcrição e apoptose. Curiosamente, os principais reorganizações celulares, incluindo a divisão celular, diferenciação e transformação, muitas vezes envolvem tais atividades 3,4,8,10. O estudo detalhado destas proteínas e seus respectivos mecanismos de regulação pode ser um desafio como estímulo para essas mudanças de localização pode ser fugaz, e os próprios movimentos pode ser bastante dinâmico e difícil de controlar. Estudos envolvendo oncogênese celular, por exemplo, continuar a beneficiar do entendimento caminhos e atividades de proteínas que diferem entre normal pilhas e células transformadas 6,7,11,12. Como muitas proteínas mostrar a localização alterada durante a transformação ou como resultado de transformação, os métodos de forma eficiente caracterizar estas proteínas e as vias em que participam têm a melhorar a compreensão das oncogênese e abrir novas áreas para a droga segmentação. Aqui apresentamos um método para a análise de proteínas e tráfico shuttling atividade entre primário e transformado em células de mamíferos. Este método combina a geração de fusões heterocário com microscopia de fluorescência para fornecer um protocolo flexível que pode ser usado para detectar proteínas localizações de estado estacionário ou dinâmico. Conforme mostrado na Figura 1, dois tipos de células são separadas transitoriamente transfectadas com construções plasmídeo carregando um gene fluoroprotein ligado ao gene de interesse. Depois de expressão, as células são fundidas usando polietileno glicol, e localizações proteína pode então ser fotografada usando uma variedade de métodos. O protocolo aqui apresentado é uma abordagem fundamental para que técnicas especializadas podem ser adicionados.

Um método flexível e eficiente para a caracterização de células localização de proteínas específicas do tipo e nucleocytoplasmic shuttling é descrito. Esta abordagem heterocário usa proteínas de fusão fluorescente marcado para localizações de proteína imagem após a fusão celular. O protocolo é passível de steady-state localizações ou mais determinações dinâmicas baseadas em imagens de células vivas.

Técnica heterocário para Análise de Localização Celular Tipo específico

Um número significativo de proteínas é regulado pelo tráfego subcelular ou pelo transporte nucleocitoplasmático. Essas proteínas apresentam uma gama diversificada de...

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar o movimento de proteínas expressando uma única proteína com dois fluoróforos diferentes em duas linhagens celulares distintas e fundindo essas linhagens celulares. Isso é realizado primeiramente transfectando plasmídeos contendo o gene de interesse fundido a um dos dois genes diferentes de proteína fluorescente em dois tipos celulares separados. O segundo passo do procedimento consiste em misturar as células e permitir que cada tipo celular acumule a proteína.O terceiro passo do procedimento é inibir a síntese proteica e, em seguida, fundir as células utilizando polietileno glicol. O passo final do procedimento é visualizar a localização proteica por meio de microscopia de fluorescência. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram alteração na localização proteica ou no comportamento de tráfego por microscopia de fluorescência.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da biologia do câncer, como como as funções e comportamentos proteicos discretos mudam conforme as células se tornam transformadas. Embora este método possa fornecer informações sobre alterações específicas de células transformadas, ele também pode ser aplicado a outros estudos, como diferenciação celular, biologia do desenvolvimento e sinalização celular.De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois será necessário otimizar as condições de transfeção, bem como as condições de fusão, para cada tipo celular diferente. O primeiro método demonstrado neste protocolo para a introdução de DNA plasmidial em células é o método NU Nuclear Affection, que utiliza a solução efetora nuclear da Lonza para iniciar a lavagem de células recentemente subcultivadas e em crescimento logarítmico com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e coletá-las por centrifugação. Uma vez que as células tenham perdido a aderência, neutralize a tripsina com a adição de meio contendo soro e recolha as células por centrifugação a 1500 ×g durante cinco minutos, enquanto as células estão sendo centrifugadas.Adicione lamínulas esterilizadas a um poço de uma placa de seis poços na cabine de cultura de tecidos, em seguida pipete 1,5 mililitros de meio de cultura completo em cada poço, cubra a placa e transfira-a para o incubador de cultura celular para equilibrar.Após a centrifugação, transfira os tubos para a cabine, aspire o sobrenadante e reconstitua os pellets celulares em um volume mínimo de PBS. Em seguida, conte as células e alíquote o volume de suspensão celular em tubos estéreis de microcentrífuga. Isso fornecerá aproximadamente cinco vezes 10 à quinta potência de células por amostra; centrifugue novamente a 1500 ×g por cinco minutos.Após a conclusão da centrifugação, coloque os tubos na capela de cultura celular, aspire o SNA e ressuspenda cuidadosamente. Suspenda as células de cada tubo com 100 microlitros de solução efetora nuclear à temperatura ambiente. Em seguida, adicione cinco microgramas de DNA plasmidial a cada amostra e transfira a amostra para um tubo Q efetor nuclear e cubra.Tenha cuidado para evitar bolhas de ar. Insira a qve da amostra no suporte do Q vet. Selecione o programa de efeito nuclear apropriado e inicie-o.A seleção do programa mais apropriado pode exigir testes prévios para estabelecer a eficiência ideal de transfeção com mortalidade mínima. Em seguida, plaque as células em uma placa de seis poços, em populações mistas ou separadamente como controles. Retorne a placa ao incubador e permita que as células se recuperem por 12 horas.O segundo método demonstrado para expressão transitória de plasmídeos é a transfeção com reagente afetador kagen. Para começar, adicione 0,8 microgramas de cada amostra de DNA plasmidial a 200 microlitros de tampão EC em um tubo fuge estéril. Em seguida, adicione 6,4 microlitros de reagente potencializador a cada amostra.Agite brevemente batendo no tubo e incube por dois minutos à temperatura ambiente. Após essa incubação breve, adicione 20 microlitros do reagente ativo a cada amostra. Misture cada tubo batendo levemente e incube por 15 minutos à temperatura ambiente.Durante a incubação, prepare as duas linhagens celulares que serão utilizadas no experimento. Para a transfeção, as células devem ter sido recentemente repassadas e estar em crescimento logarítmico, com aproximadamente 80% de confluência. Lave as células uma vez com PBS e adicione novamente 1,5 mililitros de DMEM fresco com 10% de FBS.Agora que os reagentes de transfeção de DNA foram incubados por 15 minutos, adicione 1,2 mililitros de meio DMEM mais 10% de FBS a cada amostra, misturando com pipeta, e transfira imediatamente cerca de 700 microlitros dos complexos, gota a gota, para cada um dos dois poços. Na placa de seis poços, misture suavemente agitando a placa. Deixe as células serem transfectadas por pelo menos três horas no incubador dentro da câmara de cultura celular; se desejar, coloque um lamínula esterilizado por poço em uma placa de seis poços.Lâminas recobertas podem ser usadas para aumentar a adesão celular. Em seguida, lave as células transfectadas duas vezes com PBS e recolha as células com uma quantidade mínima de tripsina. Isso é realizado adicionando 100 microlitros de solução de tripsina a cada poço, agitando a placa para garantir cobertura completa.Em seguida, aspire imediatamente a tripsina residual. Neutralize a tripsina remanescente ressuspendendo as células em 1,5 mililitros de DMEM fresco com 10% de FBS e plaque as células em populações mistas ou separadamente como controles. Na placa de seis poços contendo lamínulas, permita que as células recuperem por 12 horas no incubador de cultura celular.Independentemente do método de transfeção, o procedimento para a geração de infusões heterólogas é o mesmo. Após a transfeção, remova o meio de cultura das placas e lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, recomenda-se tratar as células com cicloheide para inibir a síntese proteica adicional.Adicione cyclo heide em uma concentração de 100 microgramas por mililitro no meio de cultura para cobrir as células e incube por duas horas no incubador de cultura celular. Após duas horas, remova as células do incubador e lave-as duas vezes com PBS. Para iniciar a fusão, cubra as células com uma solução de 50% polietilenoglicol 1000 em DMEM sem soro e incube por 125 segundos.À temperatura ambiente, remova a solução de PEG e lave as células com PBS para eliminar o peg residual. Em seguida, adicione dois mililitros de DMEM contendo 10% de FBS aquecido a 37 graus Celsius. Incube as células por 18 a 24 horas no incubador de cultura celular.Após a incubação de 18 a 24 horas, retire a placa do incubador e lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, pipete um mililitro de paraformaldeído 4% em PBS para cada poço e agite suavemente por 15 minutos.Durante a incubação, prepare as lâminas de microscópio a serem utilizadas adicionando uma única gota de meio de montagem contendo dpi. Em seguida, lave as células fixadas duas vezes com PBS e remova cuidadosamente cada lamínula com pinça pequena. Remova por capilaridade o PBS residual em um pedaço de papel absorvente antes de colocá-la, com o lado das células voltado para baixo, sobre uma lâmina de microscópio contendo meio de montagem mais tappi.Remova o meio de montagem em excesso da lâmina com papel de tecido e selar as bordas das lamínulas. Com esmalte de unha, as células podem agora ser visualizadas por microscopia confocal ou de fluorescência epi. Neste fluxograma, o método heterólogo para análise da localização específica de proteínas por tipo celular é mostrado em três etapas básicas.Transfecção do plasmídeo que expressa uma proteína marcada com fluoróforo com fusão celular utilizando polietileno glicol 1000 e imagem por microscopia fluorescente, conforme observado nestas imagens de fluorescência por epifluorescência: fibroblastos primários de prepúcio, controles autofusos expressando a proteína VP três do vírus da anemia infecciosa de frangos marcada com GFP, mostram principalmente localização citoplasmática da proteína na linhagem de carcinoma de pulmão de células não pequenas H 1299. Controles autofusos com a mesma proteína VP três marcada com DS.RED mostram principalmente localização nuclear. A fusão heterocariótica entre fibroblastos primários de prepúcio e células H 1299 resulta na introdução de material celular transformado nos fibroblastos primários de prepúcio e provoca uma mudança na localização da proteína VP três derivada de células primárias marcada com GFP para o núcleo.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o sucesso dependerá fortemente da eficiência de transfeção nos tipos celulares específicos utilizados, bem como da otimização das condições de fusão para essas células particulares. Após este procedimento, outros métodos, como flip e frap, podem ser realizados para responder perguntas adicionais envolvendo a análise em tempo real da dinâmica de localização. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar localizações proteicas específicas de tipos celulares mediante a introdução de proteínas marcadas com fluoróforos e a geração de fusões celulares.

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Biology

Biologia

Neste artigo descrevemos um método simples para a colheita de células isoladas de ratos culturas primárias neuronais e análise de transcriptoma subsequentes usando a amplificação ARNA. Esta abordagem é generalizável a qualquer tipo de célula.

Análise do transcriptoma de uma única célula

Tecidos de Drosophila contêm muitas vezes uma mistura heterogénea de tipos celulares. Para examinar a expressão de genes em tipos específicos de células a partir de um tecido em particular, os núcleos podem ser geneticamente marcado e, subsequentemente, isolado usando uma abordagem baseada em afinidade. Isolado núcleos pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a análise de expressão génica e imunoprecipitação da cromatina.

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

O objetivo deste protocolo é usar a técnica de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para classificar tipos específicos de células neurais para análise subsequente da expressão gênica específica do tipo de célula, marcadores epigenéticos e/ou expressão de proteínas.

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

Aqui relatamos protocolos para detectar proteínas endógenas e exógenas de centrômero-cinetócoro em células humanas e quantificar esses níveis de proteína em centrômeros-cinetocoros por coloração imunofluorescente indireta através do uso de fixação (fixação de paraformaldeído, acetona ou metanol).

Proteínas Análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos Centromere-cinetócoro

Aqui, apresentamos uma abordagem combinatória para classificar tipos de células neuronais antes do isolamento e para a caracterização subsequente de transcriptomas de célula única. Este protocolo otimiza a preparação de amostras para o bem sucedido RNA Sequencing (RNA-Seq) e descreve uma metodologia projetada especificamente para a compreensão melhorada da diversidade celular.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

Este protocolo descreve um método fácil e conveniente para rotular e Visualizar ao vivo cromossomos em células mitóticas usando Histone2B-GFP BacMam 2.0 label e um sistema de microscopia confocal de disco girando.

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Aqui, apresentamos um protocolo para multi cor localização das proteínas de membrana única em organelas de células vivas. Para anexar fluorophores, auto rotulação de proteínas são utilizadas. Proteínas, localizadas em compartimentos diferentes membranas da organela a mesma, podem ser localizadas com precisão de ~ 18 nm.

Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas

Granel gene expressão medições nuvem célula individual diferenças nas populações de células heterogêneas. Aqui, descrevemos um protocolo para análise de expressão do gene como unicelular e índice classificação por Florescence ativado celular classificação (FACS) pode ser combinado para delinear a heterogeneidade e immunophenotypically caracterizam populações de células molecularmente distinta.

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

O objetivo deste protocolo é fundir dois tipos de células diferentes para criar células híbridas. A análise da microscopia da fluorescência de pilhas fundidas é usada para seguir a pilha da origem de organelas celulares. Este ensaio pode ser usado para explorar como a estrutura celular e função responder à perturbação por fusão celular.

Fusão célula-célula de linhas celulares editados do genoma para perturbação da estrutura celular e função

O sucesso da transcriptômica de célula única/núcleo único e multi-ômica depende em grande parte da qualidade das células/núcleos. Portanto, o isolamento de células/núcleos do tecido e sua purificação devem ser altamente padronizados. Este protocolo descreve a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea para o ensaio de multioma de núcleo único a jusante.

Preparação de Núcleos Cerebrais e de Medula Óssea de Alta Qualidade para Ensaios Multioma de Núcleos Únicos

Apresentamos um protocolo de microscopia de localização de molécula única em três cores (SMLM) que permite o mapeamento reprodutível de eucromatina, heterocromatina e RNAP II para análise espacial. Esse protocolo permite a marcação eficiente de multicor em ambientes nucleares densos, incluindo alvos associados à cromatina, possibilitando detecção simultânea e confiável.

Um Protocolo de Microscopia de Localização de Molécula Única Multirótulo para Investigação da Cromatina em Ambiente Nuclear Denso

Aprenda a técnica heterocário para analisar a localização de proteínas específicas de tipos celulares usando fusão com polietilenoglicol e microscopia de fluorescência. Este método permite estudar dinâmicas nucleocitoplasmáticas em biologia celular e do câncer.

Técnica heterocário para Análise de Localização Celular Tipo específico

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