Técnica heterocário para Análise de Localização Celular Tipo específico

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar o movimento de proteínas expressando uma única proteína com dois fluoróforos diferentes em duas linhagens celulares distintas e fundindo essas linhagens celulares. Isso é realizado primeiramente transfectando plasmídeos contendo o gene de interesse fundido a um dos dois genes diferentes de proteína fluorescente em dois tipos celulares separados. O segundo passo do procedimento consiste em misturar as células e permitir que cada tipo celular acumule a proteína.

O terceiro passo do procedimento é inibir a síntese proteica e, em seguida, fundir as células utilizando polietileno glicol. O passo final do procedimento é visualizar a localização proteica por meio de microscopia de fluorescência. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram alteração na localização proteica ou no comportamento de tráfego por microscopia de fluorescência.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da biologia do câncer, como como as funções e comportamentos proteicos discretos mudam conforme as células se tornam transformadas. Embora este método possa fornecer informações sobre alterações específicas de células transformadas, ele também pode ser aplicado a outros estudos, como diferenciação celular, biologia do desenvolvimento e sinalização celular.

De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois será necessário otimizar as condições de transfeção, bem como as condições de fusão, para cada tipo celular diferente. O primeiro método demonstrado neste protocolo para a introdução de DNA plasmidial em células é o método NU Nuclear Affection, que utiliza a solução efetora nuclear da Lonza para iniciar a lavagem de células recentemente subcultivadas e em crescimento logarítmico com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e coletá-las por centrifugação. Uma vez que as células tenham perdido a aderência, neutralize a tripsina com a adição de meio contendo soro e recolha as células por centrifugação a 1500 ×g durante cinco minutos, enquanto as células estão sendo centrifugadas.

Adicione lamínulas esterilizadas a um poço de uma placa de seis poços na cabine de cultura de tecidos, em seguida pipete 1,5 mililitros de meio de cultura completo em cada poço, cubra a placa e transfira-a para o incubador de cultura celular para equilibrar.

Após a centrifugação, transfira os tubos para a cabine, aspire o sobrenadante e reconstitua os pellets celulares em um volume mínimo de PBS. Em seguida, conte as células e alíquote o volume de suspensão celular em tubos estéreis de microcentrífuga. Isso fornecerá aproximadamente cinco vezes 10 à quinta potência de células por amostra; centrifugue novamente a 1500 ×g por cinco minutos.

Após a conclusão da centrifugação, coloque os tubos na capela de cultura celular, aspire o SNA e ressuspenda cuidadosamente. Suspenda as células de cada tubo com 100 microlitros de solução efetora nuclear à temperatura ambiente. Em seguida, adicione cinco microgramas de DNA plasmidial a cada amostra e transfira a amostra para um tubo Q efetor nuclear e cubra.

Tenha cuidado para evitar bolhas de ar. Insira a qve da amostra no suporte do Q vet. Selecione o programa de efeito nuclear apropriado e inicie-o.

A seleção do programa mais apropriado pode exigir testes prévios para estabelecer a eficiência ideal de transfeção com mortalidade mínima. Em seguida, plaque as células em uma placa de seis poços, em populações mistas ou separadamente como controles. Retorne a placa ao incubador e permita que as células se recuperem por 12 horas.

O segundo método demonstrado para expressão transitória de plasmídeos é a transfeção com reagente afetador kagen. Para começar, adicione 0,8 microgramas de cada amostra de DNA plasmidial a 200 microlitros de tampão EC em um tubo fuge estéril. Em seguida, adicione 6,4 microlitros de reagente potencializador a cada amostra.

Agite brevemente batendo no tubo e incube por dois minutos à temperatura ambiente. Após essa incubação breve, adicione 20 microlitros do reagente ativo a cada amostra. Misture cada tubo batendo levemente e incube por 15 minutos à temperatura ambiente.

Durante a incubação, prepare as duas linhagens celulares que serão utilizadas no experimento. Para a transfeção, as células devem ter sido recentemente repassadas e estar em crescimento logarítmico, com aproximadamente 80% de confluência. Lave as células uma vez com PBS e adicione novamente 1,5 mililitros de DMEM fresco com 10% de FBS.

Agora que os reagentes de transfeção de DNA foram incubados por 15 minutos, adicione 1,2 mililitros de meio DMEM mais 10% de FBS a cada amostra, misturando com pipeta, e transfira imediatamente cerca de 700 microlitros dos complexos, gota a gota, para cada um dos dois poços. Na placa de seis poços, misture suavemente agitando a placa. Deixe as células serem transfectadas por pelo menos três horas no incubador dentro da câmara de cultura celular; se desejar, coloque um lamínula esterilizado por poço em uma placa de seis poços.

Lâminas recobertas podem ser usadas para aumentar a adesão celular. Em seguida, lave as células transfectadas duas vezes com PBS e recolha as células com uma quantidade mínima de tripsina. Isso é realizado adicionando 100 microlitros de solução de tripsina a cada poço, agitando a placa para garantir cobertura completa.

Em seguida, aspire imediatamente a tripsina residual. Neutralize a tripsina remanescente ressuspendendo as células em 1,5 mililitros de DMEM fresco com 10% de FBS e plaque as células em populações mistas ou separadamente como controles. Na placa de seis poços contendo lamínulas, permita que as células recuperem por 12 horas no incubador de cultura celular.

Independentemente do método de transfeção, o procedimento para a geração de infusões heterólogas é o mesmo. Após a transfeção, remova o meio de cultura das placas e lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, recomenda-se tratar as células com cicloheide para inibir a síntese proteica adicional.

Adicione cyclo heide em uma concentração de 100 microgramas por mililitro no meio de cultura para cobrir as células e incube por duas horas no incubador de cultura celular. Após duas horas, remova as células do incubador e lave-as duas vezes com PBS. Para iniciar a fusão, cubra as células com uma solução de 50% polietilenoglicol 1000 em DMEM sem soro e incube por 125 segundos.

À temperatura ambiente, remova a solução de PEG e lave as células com PBS para eliminar o peg residual. Em seguida, adicione dois mililitros de DMEM contendo 10% de FBS aquecido a 37 graus Celsius. Incube as células por 18 a 24 horas no incubador de cultura celular.

Após a incubação de 18 a 24 horas, retire a placa do incubador e lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, pipete um mililitro de paraformaldeído 4% em PBS para cada poço e agite suavemente por 15 minutos.

Durante a incubação, prepare as lâminas de microscópio a serem utilizadas adicionando uma única gota de meio de montagem contendo dpi. Em seguida, lave as células fixadas duas vezes com PBS e remova cuidadosamente cada lamínula com pinça pequena. Remova por capilaridade o PBS residual em um pedaço de papel absorvente antes de colocá-la, com o lado das células voltado para baixo, sobre uma lâmina de microscópio contendo meio de montagem mais tappi.

Remova o meio de montagem em excesso da lâmina com papel de tecido e selar as bordas das lamínulas. Com esmalte de unha, as células podem agora ser visualizadas por microscopia confocal ou de fluorescência epi. Neste fluxograma, o método heterólogo para análise da localização específica de proteínas por tipo celular é mostrado em três etapas básicas.

Transfecção do plasmídeo que expressa uma proteína marcada com fluoróforo com fusão celular utilizando polietileno glicol 1000 e imagem por microscopia fluorescente, conforme observado nestas imagens de fluorescência por epifluorescência: fibroblastos primários de prepúcio, controles autofusos expressando a proteína VP três do vírus da anemia infecciosa de frangos marcada com GFP, mostram principalmente localização citoplasmática da proteína na linhagem de carcinoma de pulmão de células não pequenas H 1299. Controles autofusos com a mesma proteína VP três marcada com DS.RED mostram principalmente localização nuclear. A fusão heterocariótica entre fibroblastos primários de prepúcio e células H 1299 resulta na introdução de material celular transformado nos fibroblastos primários de prepúcio e provoca uma mudança na localização da proteína VP três derivada de células primárias marcada com GFP para o núcleo.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o sucesso dependerá fortemente da eficiência de transfeção nos tipos celulares específicos utilizados, bem como da otimização das condições de fusão para essas células particulares. Após este procedimento, outros métodos, como flip e frap, podem ser realizados para responder perguntas adicionais envolvendo a análise em tempo real da dinâmica de localização. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar localizações proteicas específicas de tipos celulares mediante a introdução de proteínas marcadas com fluoróforos e a geração de fusões celulares.