Medidas eletrofisiológicas partir de um sistema olfativo Traça
29 de março de 2011
Inseto sistemas olfativos fornecem oportunidades únicas para a gravação odorant induzida por respostas nas formas de electroantennograms (EAG) e gravações sensillum simples (SSR), que são somadas as respostas de todos os neurônios olfativos receptor (ORNS), localizado na antena e daqueles alojados em individuais sensilla, respectivamente.
O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar a facilidade de registrar respostas olfativas do sistema nervoso de insetos. Isso é conseguido imobilizando uma mariposa viva e conectando eletrodos à antena ou a um neurônio individual para registrar respostas induzidas por odoríferos. Como primeiro passo, um eletrodo de vidro preenchido com solução salina é inserido no olho como referência; como segundo passo, qualquer uma das mariposas imobilizadas é inserida em um eletrodo de vidro preenchido com solução salina, o que permite o registro de respostas elétricas na forma de um eletroantenograma para gravação de respostas de unidade única de um neurônio receptor olfativo.
O eletrodo de gravação é introduzido na base de um raio solar. Em seguida, o sinal da antena é amplificado e enviado a um conversor analógico-digital para gravação e armazenamento dos sinais. São obtidos resultados que mostram respostas induzidas pelo odorante e dependentes da dose, com base no sinal elétrico registrado na forma de um sinal EAG ou um pico.
Desenvolvemos um novo método de registro do Enterograma a partir da mariposa viva e imobilizada de laranja-navel. A principal vantagem dessa técnica é que a preparação dura muito tempo, e a mesma mariposa pode ser usada múltiplas vezes para registrar diversas respostas, além de também poder ser utilizada para registrar respostas de unidade única a partir de um sensor individual do antena. Concentramo-nos na laranja-navel porque é uma cultura agrícola importante na Califórnia.
No entanto, este método pode ser utilizado para outros insetos sugadores de folhas, não apenas para abordar questões fundamentais na função olfativa, mas também para o desenvolvimento de novos atrativos. Este estudo do sistema olfativo de mariposa utiliza a traça-da-laranja. Ullo Ella.
A colônia de insetos é mantida com uma dieta à base de farelo de trigo em câmaras ambientais a aproximadamente 28 graus Celsius, aproximadamente 75% de umidade relativa e sob um regime fotoperiódico de 16 para 8 horas de luz para escuro. Crie recipientes para mariposas recém-emergidas colocando até 10 camadas de toalhas de papel embebidas em água dentro de uma caixa de plástico. Colete e determine o sexo das mariposas emergentes diariamente, depois transfira-as para a caixa de plástico. Cubra a caixa com uma tampa perfurada para permitir a circulação de ar, a fim de se preparar para os registros eletrofisiológicos.
Primeiro, faça um suporte para a mariposa cortando a ponta de uma pipeta de 200 microlitros para que tenha um diâmetro de cerca de dois milímetros. Para EAG ou SSR, selecione uma mariposa com dois a quatro dias pós-emergência. Insira a mariposa na pipeta pelo extremo oposto à ponta, utilizando um pequeno pedaço de papel-toalha umedecido, empurrando suavemente a mariposa em direção à ponta da pipeta.
Continue empurrando a mariposa até que as antenas e parte da cabeça saiam pela ponta; imobilize a cabeça exposta cobrindo-a com argila não secante, deixando exposta uma pequena parte de um olho e as duas antenas. Coloque a preparação da mariposa sobre a plataforma do micromanipulador do eletrograma entre os dois suportes de eletrodo, utilizando eletrodos de vidro com diâmetros de ponta menores que um mícron. Preencha os eletrodos por trás com ringer de centum limb.
Olhando pelo microscópio, impale a área exposta do olho com um eletrodo. Este serve como eletrodo de referência. O próximo passo é posicionar eletrodos de gravação nas antenas.
A antena do mariposa macho de caruncho-laranjeira é multissegmentada, e cada segmento possui um grande número de estruturas semelhantes a pelos. A ilha, o detalhe é uma micrografia eletrônica de varredura mostrando detalhes da ilha para facilitar a gravação das antenas. Corte um a dois segmentos terminais distais.
Em seguida, insira ambas as antenas no eletrodo de gravação. Alternativamente, para gravações de um único sensílio, insira o eletrodo de gravação na base de um sensílio. Os potenciais de ação provenientes do sensílio são amplificados por um pré-amplificador de alta impedância e enviados a um conversor digital-analógico inteligente USB para serem analisados offline com o software autos spike.
O próximo passo é preparar o estímulo químico utilizando o ZZ 1113 HEXA deca Now, que é um constituinte principal da mistura de feromônio feminino da traça da laranja-naval, diluindo o composto com hexano para obter diluições DIC. Carregue 10 microlitros de uma solução de estímulo em um papel-filtro Watman. Remova o solvente por evaporação, agitando suavemente por 10 segundos.
Sob uma capela de exaustão, coloque a tira em uma seringa de polipropileno de cinco mililitros, hexano puro e uma seringa vazia como controles do procedimento. O EAG ou SSR é mantido em uma corrente de ar umidificada fornecida pelo controlador de estímulo sintaxe a 20 mililitros por segundo. Conecte a seringa contendo o estímulo químico ao controlador de corrente de ar.
Registre dois segundos de sinais elétricos de linha de base. Em seguida, adicione um pulso de estímulo de quatro mililitros por segundo ao fluxo de ar por 500 milissegundos. Continue registrando os sinais elétricos por mais oito segundos.
Deixe pelo menos um minuto entre as estimulações. Esta figura mostra uma resposta robusta dependente da dose nas antenas de uma mariposa macho imobilizada. Estimulada com o componente do feromônio feminino, CZ 1113 hexaco.
A resposta ao hexano. O controle do veículo é mostrado pela linha azul sucessivamente. Doses maiores do feromônio geram gravações eletrográficas sucessivamente maiores.
Esta figura mostra as gravações extracelulares de unidade única de um tric andum em resposta à estimulação pelo componente do feromônio feminino. Essas gravações mostram uma resposta excitatória dependente da dose. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em algumas horas se feita corretamente.
Ao utilizar este método, certifique-se de evitar a contaminação e use produtos químicos o mais puros possível.
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Visão Geral
Este artigo demonstra o processo de registro de respostas olfativas do sistema nervoso de insetos, especificamente utilizando mariposas. A metodologia envolve imobilizar uma mariposa viva e utilizar eletrodos para captar respostas induzidas por odorizantes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Sistemas Olfativos
Contexto
- Os insetos possuem sistemas olfativos complexos.
- Os eletroantenogramas (EAG) e os registros de único sensílio (SSR) são técnicas fundamentais.
- Esses métodos permitem o estudo de neurônios receptores de odorantes (ORNs).
- Compreender a olfação em insetos pode fornecer insights sobre o processamento sensorial.
Objetivo do Estudo
- Ilustrar a facilidade de registro de respostas olfativas em insetos.
- Demonstrar o uso de eletrodos para capturar sinais elétricos.
- Analisar respostas dependentes da dose a diferentes odorizantes.
Métodos Utilizados
- Restringir uma mariposa viva para experimentação.
- Utilizar eletrodos de vidro preenchidos com solução salina para registro.
- Introduzir um eletrodo no olho para aterramento.
- Amplificar os sinais da antena e convertê-los para análise.
Resultados Principais
- Gravações bem-sucedidas de respostas elétricas de neurônios olfativos.
- Respostas demonstradas dependentes da dose aos odorantes.
- Sinais gravados na forma de EAG e respostas de disparo.
Conclusões
- A metodologia é eficaz para estudar respostas olfativas.
- Os resultados contribuem para a compreensão do processamento olfativo em insetos.
- Pesquisas futuras podem expandir essas descobertas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Medições eletrofisiológicas de sistemas olfativos de insetos permitem a detecção de alta fidelidade de respostas neurais induzidas por odoríferos, apoiando a validação de alvos no manejo de pragas e na descoberta de agroquímicos. A abordagem fornece leituras quantitativas e dependentes da dose que facilitam a desvinculação mecanicista de vias sensoriais e a confiança preditiva na triagem de compostos líderes. Este método aprimora a continuidade translacional ao associar o engajamento do alvo molecular a saídas funcionais comportamentais em espécies relevantes para a agricultura.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da função dos neurônios receptores de odorantes para validar alvos moleculares envolvidos na sinalização quimiossensorial.
- Valor Operacional: Apoia a desconsideração de riscos biológicos ao confirmar o engajamento do alvo por meio de leituras eletrofisiológicas diretas.
- Valor Preditivo: Respostas dependentes da dose permitem a avaliação da relação estrutura-atividade e a priorização de compostos promissores.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas olfativos validados para triagem reprodutível e de alta sensibilidade de bibliotecas de odorantes.
- Saída Quantitativa: Gera sinais de eletroantennograma (EAG) e gravação de sensilo único (SSR) como pontos finais mensuráveis para avaliação de compostos.
- Escalabilidade: Permite o uso repetido de preparações individuais, apoiando campanhas de triagem longitudinais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Sistema Relevante para Doenças: Utiliza a traça-laranjeira, uma praga agrícola importante, para modelar comportamentos mediados por quimiossensibilidade relevantes para a eficácia em campo.
- Alinhamento de Biomarcadores Translacionais: Relaciona respostas eletrofisiológicas a resultados comportamentais, como atração ou repelência.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de prosseguir ou não com base na validação funcional de alvos sensoriais em contextos ecologicamente relevantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer validação funcional de alvos olfativos antes da triagem de compostos e da otimização de candidatos promissores.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre mecanismos de receptores de odorantes e a elucidação de vias na quimiossensibilidade de insetos.
- Triagem: Fornece saídas eletrofisiológicas padronizadas e reprodutíveis para triagem de bibliotecas de compostos frente a sistemas sensoriais nativos.
- Análise: Permite a comparação quantitativa de relações dose-resposta para apoiar a identificação de compostos líderes e a classificação de potência.
- Pesquisa Translacional: Conecta a atividade neural a fenótipos comportamentais, apoiando a validação pré-clínica de estratégias de controle de pragas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem cruzada de projetos envolvendo semioquímicos e modificadores comportamentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece uma compreensão mecanicista da detecção de odorantes, reduzindo a ambiguidade na validação de alvos.
- Valor Operacional: Garante a padronização do ensaio e a durabilidade do preparo, permitindo gravações de múltiplos dias e múltiplas condições a partir de espécimes individuais.
- Valor Estratégico: Aumenta a confiança na seleção de alvos, reduzindo a desistência em estágios avançados do desenvolvimento de agroquímicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização orientada por dados de compostos com base em respostas sensoriais funcionais.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia, microcirurgia e manipulação de insetos.
- Depende de amplificadores de alta impedância, conversores analógico-digitais e sistemas de entrega de estímulos.
- Necessita de protocolos padronizados de preparação de estímulos e evaporação de solventes para evitar variáveis confundidoras.
- A adaptação entre espécies exige ajustes na colocação dos eletrodos e nos parâmetros do estímulo com base na morfologia antenal.
- As limitações práticas incluem a estabilidade da preparação ao longo do tempo e a suscetibilidade ao ruído ambiental durante a gravação.
