Name: Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprenda a medir a expectativa de vida de Caenorhabditis elegans em placas de 96 poços usando sincronização populacional e triagem de compostos. Este método permite identificar rapidamente moléculas que promovem longevidade.

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Este protocolo foi originalmente desenvolvido no Fred Hutchinson Cancer Research Center em Seattle por Xiaolan Ye e Michael Petrascheck no Laboratório de Linda Buck. A versão detalhada acima foi preparado para fazer todo o procedimento disponível para a comunidade em geral. Agradecemos a Carol Taylor, Sarah e Andy LeBoeuf Tomacelli pela leitura crítica do protocolo. Este é manuscrito # 2866 do The Scripps Research Institute. O Laboratório de Petrascheck é financiado pelo programa ADI Novartis.

Resumo: O protocolo é dividido em quatro partes. Parte 1 descreve como preparar as bactérias alimentação. Parte 2 descreve como preparar a cultura worm. Parte 3 descreve como pontuação vida. Parte 4 mostra alguns resultados representativos, e Parte 5 descreve como preparar as soluções necessárias. Experimentos vida levar várias semanas para ser concluído. Para cada etapa da semana de protocolo, dia e hora do dia está incluído para facilitar o planejamento. O estágio L4 (Dia 0) é usado como ponto de referência para todo o protocolo. 1. Preparação de bactérias que se alimentam Esta seção descreve a preparação das bactérias alimentação. O E. específicas coli cepa utilizada para alimentar C.elegans é chamado OP50. Antes deste protocolo, para evitar a contaminação cruzada da cultura verme com outras bactérias, a cepa OP50 foi feito carbenicilina / Ampicilina resistentes 21. Prepare o OP50 4-5 dias de antecedência. Todos os materiais em contacto com OP50 devem ser estéreis. Dia -7: quinta-feira (1 semana): Inocular 5 ml de TB contendo 100 mcg / ml ampicilina e 0,1 mcg / ml anfotericina B com uma colônia OP50 única e incubar durante a noite a 37 ° C em um agitador bacteriana. Dia -6: sexta-feira (1 semana). 8:30 da manhã. Inocular cedo para dar tempo suficiente para a cultura para atingir a saturação <ol><li> Diluir a cultura da noite para o dia OP50 1:2000 em 300 TB mL contendo 50 mcg / ml ampicilina. Incubar a cultura em um shaker bacteriana por 8-12 horas a 37 ° C até à saturação é atingido. Não permita que a cultura a crescer mais de 14 horas. </li><li> Transferir o OP50 em um tubo de centrifugação estéril, pré-ponderada. Pellet o OP50 por centrifugação por 10 min a 3500 rpm (2200 xg) em uma centrífuga de mesa. </li><li> Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet OP50 em água estéril e re-pellet por centrifugação. Repita esta lavagem duas vezes. </li><li> Depois da segunda lavagem, retire cuidadosamente toda a água restante. Nenhuma água deve ser deixado no tubo. Pesar o tubo de centrifugação contendo o pellet e subtrair o peso do tubo de centrifugação vazia, a fim de determinar o peso do sedimento. </li><li> Completamente re-suspensão do sedimento em S-completa para uma concentração de 100 mg / mL. Não aglomerados deve ser deixado. </li><li> A concentração de 100 mg / mL OP50 deve corresponder a 2 x10 10 bactérias / mL. Use um espectrômetro foto para determinar o número de bactérias por mL, se a relação entre a densidade ótica eo número de bactérias por mL é conhecido. Se necessário, ajustar a concentração da solução de alimentação OP50 a 2 x10 10 bactérias / mL. </li><li> Armazenar os OP50solution a 4 ° C até ser utilizado para a cultura worm. </li></ol> 2. Preparação de uma Cultura Worm Synchronous Esta seção descreve a preparação da cultura worm. Seu objetivo é gerar uma população em idade síncrona de worms. Todos os materiais em contacto com C.elegans após o tratamento de lixívia na etapa 5 devem ser estéreis. Placas são mantidos a 20 ° C salvo indicação em contrário. Dia -6: sexta-feira (1 semana), 16:00: Transfer os animais para um prato fresco <ol><li> Dê uma placa NGM 50-10 dias de idade em que a maioria da população sem-fim consiste de larvas L1 fome. </li><li> Esterilizar uma espátula de metal por pouco tempo de aquecimento é mais um bico de Bunsen. Deixe esfriar. Use a espátula resfriado a cortar pedaços de agar da placa contendo os vermes famintos. Transferência de vários desses pedaços em uma nova placa de 10 centímetros NGM semeados com OP50. Incubar por aprox. 65 horas a 20 ° C até que a maioria da população sem-fim é composto por adultos gravídico. O tempo que leva para os animais L1 fome para crescer em adultos gravid pode variar de cepa para cepa. </li></ol> -3 Dia: segunda-feira (2 semanas) 10:00: Estabelecer uma população síncrona <ol start="3"><li> Coletar worms da placa de 10 cm, lavando-as fora do prato com água mL 10/05 estéril. Transferir a solução worm / água em um tubo cônico de 15 mL. </li><li> Lave os vermes por centrifugação 2 min em uma centrífuga de mesa em 1200 rpm (280 xg). Elimine o sobrenadante e adicionar 10 mL de água. Repetir. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 5 mL de lixívia preparada / solução de NaOH (2,5 lixívia mL, 1 mL de NaOH 10N, 6,5 mL H 2 O). Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente até que os vermes abrir. Certifique-se de vortex suavemente a cada minuto. Monitorar o progresso da reação sob o microscópio de dissecação. </li><li> Assim que todos os adultos se dissolver, adicionar 5 mL de tampão M9 para neutralizar a reação. </li><li> Lave os ovos três vezes com 10 mL tampão M9 por centrifugação 2 min a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Lave os ovos uma vez com 10 mL S-completo por centrifugação 2 min a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Remover o sobrenadante, adicionar 10 mL S-completo e transferir a solução para um tubo cônico de 50 mL fresco. Adicionar 30 mL de S-complete para um volume final de 40 mL. Agite suavemente o tubo durante a noite a temperatura ambiente em um nutator ou dispositivo similar. </li></ol> Dia -2: terça-feira (2 semanas), o meio-dia 12:00: Seed os animais em placas <ol start="10"><li> No âmbito de dissecação, verificar se os vermes nascidos durante a noite. Determinar a concentração de worms na solução S-completo por contagem do número de worms em 10 gotas mL usando um escopo de dissecação. Contar, pelo menos, 10 gotas para cada amostra. </li><li> Re-suspender a worms em uma concentração de 8-10 worms / mL em S-completa. Adicionar carbenicilina (stock 100 mg / mL) a uma concentração final de 50 mcg / mL e anfotericina B (stock 250 mcg / mL) para uma concentração final de 0,1 mg / mL. Agitar em um nutator. Se preparando quantidades maiores de vermes, use um frasco de 600 mL nunclon com tampa de filtro. </li><li> Em 2:30 adicionar o OP50 preparada na parte 1 para uma concentração final de 6 mg / mL (= 1,2 x10 9 bactérias / mL). Devolver o OP50 a 4 ° C. </li><li> Transferência de 120 mL da solução worm/OP50 em cada poço de uma placa de 96 poços. Use 96 placas bem com um fundo transparente. Certifique-se manter os vermes em suspensão, enquanto pipetagem. </li><li> Selar a placa usando uma fita isolante para evitar a contaminação e evaporação. Agite a placa em uma placa de microtitulação shaker por 2 min e incubar por 2 dias a 20 ° C até os animais atingirem o estágio L4. </li></ol> Dia 0: quinta-feira (2 semanas) antes do meio dia: Esterilizar animais adicionando Fluorodeoxyuridine (FUDR) <ol start="15"><li> Para esterilizar os animais adicionar 30 mL de uma solução estoque 0,6 mM FUDR a cada poço. Esta etapa traz o volume final em cada poço a 150 mL e reduz a concentração final de OP50 de 6mg / ml a 5 mg / mL (1x10 9 bactérias / mL). Selar a placa usando fita selantes e agitá-lo por 2-3 min em uma placa de microtitulação shaker. Se o OP50 foi adicionado às 2:30 no dia -2, é importante que o FUDR é adicionado antes do meio dia. Retorno placas para a incubadora de 20 ° C </li></ol> Dia 1: sexta-feira (2 semanas): Adicionar drogas para a cultura <ol start="16"><li> Por 9h00 a maioria dos animais deve ser gravid e contêm vários ovos cada. Adicionar as drogas cujo efeito no tempo de vida é para ser testado na concentração desejada. Se dissolver a droga em DMSO a concentração final de DMSO não deve exceder 0,6%, como DMSO concentrações superiores a 0,6% C.elegans encurtar sua vida útil. Após a adição da droga, selar as placas com fita isolante e agitá-lo por 2-3 min em uma placa de microtitulação shaker. Retorno placas para a incubadora de 20 ° C </li><li> Adicionando as drogas podem, ocasionalmente, matar alguns animais por placa, especialmente se estiver usando um outro solvente que a água. Use um microscópio invertido para verificar se há animais mortos. Geralmente, não deve ser inferior a 10 animais mortos por placa de 96 poços. Retorno pratos para a 20 ° C incubadora. </li></ol> Dia 4: segunda-feira (3 semanas): selantes Alterar <ol start="18"><li> Para permitir que o oxigênio fresco para entrar a cultura remover o selante, espere um minuto e feche o prato. Agite a placa por 2-3 minutos em uma placa de microtitulação shaker. Repita uma vez por semana. </li></ol> Dia 5: terça-feira (3 semanas): Adicionar novo OP50 para evitar a fome <ol start="19"><li> Adicionar 5 mL da 100 mg / mL OP50 solução que foi preparada na parte 1 a cada um dos 96 poços para evitar a fome. </li></ol> 3. Pontuação de Lifespan. Esta seção descreve como a sobrevivência da população sem-fim sincronizado da Parte 2 é monitorada até que os animais morreram. Para observar os animais nos 96 pratos bem, use um microscópio invertido com um objetivo 2x ou 2.5x. Registro de dados de sobrevivência três vezes por semana; segunda, quarta e sexta-feira. Use movimento para determinar se os animais estão vivos ou mortos. Luz forte, luz especial azul, induz os animais a se mover. Não retire os animais mortos a partir do ensaio. Ocasionalmente, os animais que não se moveu e estavam determinados mortos na contagem anterior pode se mover mais tarde. <ol><li> No dia 0, no início do experimento contar o número total de vermes em cada poço. Censor poços que contêm mais de 18 animais a partir da análise como animais nesses poços não terá o suficiente OP50 e irá mostrar os efeitos da restrição alimentar. </li><li> A fim de aumentar a chance de que os animais se movem agitar a placa de 96 poços em uma placa de microtitulação shaker por 2 min. antes da contagem. </li><li> Em cada sessão contando data de registro e número de animais quese movem como animais vivos. Movimento em líquidos é muito mais fácil do que em meios sólidos e pode ser induzida por luz forte. O uso de uma maior ampliação pode ajudar a detectar movimentos muito sutis, como os da ponta da faringe. Tais movimentos sutis são muitas vezes o único movimento observado em animais muito velhos. </li><li> Retorno placas para a incubadora de 20 ° C </li><li> Repita o passo 2-4 a cada dois ou três dias até que todos os animais são mortos. </li></ol> 4. Resultados representante. Esta seção mostra um exemplo de como manter registros dos dados gerados por este tempo de vida do ensaio e alguns resultados representativos. Figura 1A mostra um exemplo de como gravar dados de expectativa de vida durante este ensaio. Uma folha excel é usado para rastrear a sobrevivência das populações em cada poço. Para cada bem, é coordenar na placa, a tensão, a droga, concentração da droga e do número total de animais vivos no dia 0 (X0) é gravada no início do experimento. Data de registo, bem como o número de animais mortos vivos e três vezes por semana a fim de seguir a sobrevivência das diversas populações em cada poço. Para o gráfico dos resultados, calcular a fração de animais vivos para cada dia e enredo como uma função do tempo em dias. P-valores devem ser calculados utilizando pacotes estatísticos como STATA ou software similar. A vida útil média de C.elegans é dependente da temperatura. Figura 1B mostra que as mudanças dependem da temperatura na expectativa de vida são reproduzidas exatamente pela expectativa de vida de microtitulação com base ensaio 22. Da mesma forma, o ensaio de placa de microtitulação reproduz mudanças na vida de mutantes relatado para ter tempo de vida que diferem dos animais tipo selvagem N2 23-24 25 (Figura 1C). O ensaio também pode ser usado para fazer declarações mais quantitativa. Em média Fig1D vida é plotado como uma função da concentração mirtazapina 7. Cada ponto de dados representa a vida útil média de 12/07 população, cada um vivendo de uma forma diferente também. Mesmo que o número de animais por bem é relativamente baixa (5-15 animais) a variação bem-bem é relativamente pequena, como pode ser visto a partir as barras de erro. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A placa de microtitulação com base lifespan ensaio reproduz com precisão as mudanças na expectativa de vida relatadas na literatura. (A) Os dados da amostra coletada em uma planilha excel. Durante cada sessão data de contagem, de coordenadas do bem e do número de animais vivos e mortos foi registrado. No início do experimento, o número total de animais em cada poço foi determinado. (B) Curva de sobrevida de tipo selvagem (N2) animais cultivados a 20 ° C e 25 ° C. (C) As curvas de sobrevida de estirpes portadores de mutações que afetam a vida. Todas as quatro cepas foram testadas em paralelo a 20 ° C. (D) curva de resposta da dose de mirtazapina N2 animais tratados. A média de expectativa de vida é plotado como uma função da concentração de mirtazapina. Barras de erro indicam o EPM de 8 poços por condição. 5. Materiais. M9 buffer, 1000 mL <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g de NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> Adicione água deionizada para 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> PH Potassiumphosphate tampão 6.0, 1000 mL <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Adicionar água deionizada até 900 mL </li><li> Ajustar o pH para 6,0 com KOH 5M </li><li> Adicione água deionizada para 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> Traço solução de metal <ul><li> 1,86 g Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0,016 g CuSO 4 </li><li> 1000 mL de água deionizada </li><li> Autoclave e armazenar no escuro. </li></ul> S-basal média, 1000 mL <ul><li> 5,9 g NaCl </li><li> 50 mL de fosfato de potássio 1M, pH 6,0 </li><li> 1000 mL de água deionizada </li><li> Autoclave </li><li> Deixe a solução arrefecer e adicionar 1 mL de colesterol 5mg / mL (dissolvido em Et-OH). </li></ul> 1M citrato de potássio, 1000 mL <ul><li> 268,8 g de citrato tripotássio </li><li> 26,3 ácido cítrico </li><li> Adicionar 900 mL de água deionizada </li><li> Ajustar o pH para 6,0 com KOH 5M </li><li> Adicione água deionizada para 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> S-médio completo, 1000 mL <ul><li> 977 mL S-basal </li><li> 10 mL de citrato pH 1M de potássio 6 (estéril) </li><li> Rastreamento 10 mL de solução de metais (estéril) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (estéril) </li><li> 3 mL 1M MgSO 4 (estéril) </li></ul> Agar NGM <ul><li> 3.0G NaCl </li><li> 2,5 g peptona(Pancreático de caseína, digerir) </li><li> Agar 17g </li><li> Adicionar água deionizada para 975 mL e uma barra de agitação </li><li> Autoclave </li><li> Após autoclavagem arrefecer a 55 ° C e adicionar os seguintes componentes: <ul><li> 0,5 mL de CaCl 2 1M (estéril) </li><li> 1 mL de Colesterol 5mg / mL em etanol </li><li> 1 mL de 1M MgSO 4 (estéril) </li><li> 25 tampão Potassiumphosphate mL, pH 6,0 (estéril) </li></ul></li></ul> TB, 1000 mL <ul><li> 12g Bacto Triptona </li><li> Extrato de levedura 24 g </li><li> 4 mL de glicerol </li><li> Adicionar 900 mL de água deionizada </li><li> Autoclave </li><li> Após autoclavagem arrefecer a 55 ° C e adicione o componente seguinte: <ul><li> adicionar 100 mL de 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma # cat F0503), 1000 mL <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Dissolver em 670 mL estéreis S-completar, fazer 10 mL ou 45 mL alíquotas. </li><li> Armazenar a -20 ° C. </li></ul> 100 mg / mL carbenicilina, 10 mL <ul><li> 1 g carbenicilina </li><li> 10 mL de água deionizada estéril </li><li> Estéril filtrado e alíquota </li><li> Armazenar a -20 ° C. </li><li> Use a uma concentração final de 50 mcg / mL </li></ul> 250ug / ml anfotericina B, 4 mL <ul><li> 1mg anfotericina B </li><li> 4 mL Et-OH </li><li> Armazenar a -20 ° C </li><li> Use a uma concentração final de 0,1 mg / mL </li></ul>

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<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo apresentado permite a medição de C.elegans vida em 96 placas de microtitulação. Como mostrado nos resultados representante seção, de forma confiável replica achados prévios e fornece informações quantitativas. Com este ensaio conseguimos exibido mais de 89.000 moléculas para o seu efeito sobre C.elegans vida. Para efeitos de drogas-triagem, medindo vida em um formato de placa de 96 poços de microtitulação tem várias vantagens sobre o ensaio de mídia clássica sólido. Ele reduz o trabalho necessário para a preparação de mídia, a quantidade de espaço de incubação, ea quantidade de droga necessária. O formato de 96 poços ea instalação de microscopia permitem a automação do ensaio inteiro para exames de alto throughput. Durante o desenvolvimento do ensaio vários valores para cada variável e suas combinações foram testadas para os seus efeitos sobre C.elegans vida. Estes testes incluíram concentração OP50 diferentes variando de 3 a 10 mg / mL (3, 4, 6, 8, 10 mg / mL), número diferente de worms por poço variando de 7 a 45 (7, 10, 15, 22, 45 worms / poço), os volumes de cultura diferentes que variam de 40-150 mL por poço (40, 60, 80, 100, 120, 150 mL), e mudanças na composição buffer. Se alimentado com uma OP50 carbenicilina resistente, nem carbenicilina nem anfotericina B nas concentrações indicadas foram encontrados para afetar C.elegans vida. Agitação suave contínuo de placas, como é frequentemente recomendada em C.elegans cultura líquida, foi encontrado dispensável para os pequenos volumes utilizados neste ensaio. Agitação suave, porém, é necessário se placas de microtitulação com poços maiores devem ser usados. Os valores indicados neste protocolo foram cuidadosamente selecionados com base na comparação estatística das diferentes condições testadas. A característica mais surpreendente deste ensaio é provavelmente o fato de que C.elegans pode ser mantida em 96 placas de bem que são seladas com fita adesiva. Side-by-side comparações não revelaram qualquer diferença na expectativa de vida de animais cultivadas em placas sem lacre, em placas seladas com um selante plástico, ou em placas vedadas com selantes que permitem troca de ar. Em todas as três condições, os animais desenvolveram muito homogênea de L1 a adultos gravid no prazo de 65 horas e mostrou expectativa de vida muito semelhantes. Animais cresceu em paralelo em NGM desenvolveu um pouco mais rápido, mas esta diferença foi independente da ausência ou presença de um selador. O protocolo apresentado é baseado em bactérias vivas, mas pode ser adaptado para as bactérias mortas. No entanto, em um ensaio de líquidos uma única bactéria pode sobreviver e se multiplicar rapidamente re-popular a cultura. Em nossas mãos, a única maneira confiável para matar as bactérias na medida em que eles podem ser usados ​​para a cultura líquido é de tratamento prolongado das bactérias com radiação gama. Um ponto importante a considerar no planejamento de um experimento de vida é o poder de detecção. Depende do tamanho do efeito, o efeito da droga de interesse devem ser testados em poços múltiplos. Em um ensaio típico de 4 tratados com o fármaco e 4 poços de controlo, que corresponde aproximadamente a 40-50 animais cada, deveria ser suficiente para detectar um aumento de 30% na expectativa de vida em mais de 95% dos experimentos. Aumenta de 14% só são detectados em 60% dos casos e, portanto, exigem mais poços replicar. A riqueza de dados gerados por este tempo de vida do ensaio pode ser usado para desenvolver experiência ou cepa específica modelos Gompertz paramétricos 1. Estes modelos Gompertz são úteis para determinar o poder de detecção e para estimar o número de falsos positivos e negativos para grandes telas. Verificou-se as previsões destes modelos em experimentos cegos e os usou para estimar o número de falsos negativos em telas de grandes dimensões (resultados não publicados). Em resumo, nós antecipamos que o ensaio apresentados serão de grande utilidade para identificar as moléculas pequenas que estender o tempo de C.elegans e estudar os mecanismos subjacentes.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Anfotericina B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Também chamada Fungizone</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>O FUDR é inativado pelo calor, descongele em água fria</td></tr><tr><td>Mianserina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>Utilizar como controle positivo na concentração final de 50&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Ciproheptadina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>Controle positivo alternativo na concentração final de 10 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Fita de vedação</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>Poliéster, não estéril</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>Não tratada, transparente, embalada individualmente, em poliestireno, estéril</td></tr><tr><td>Frasco Nunclon</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>Utilizado para grandes volumes</td></tr></tbody></table>

medição caenorhabditis elegans expectativa de vida em 96 placas de microtitulação bem

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Expectativa de vida é um processo biológico regulado por várias vias genéticas. Uma estratégia para investigar a biologia do envelhecimento é estudar os animais que as mutações em componentes porto de idade-regulação caminhos. Se essas mutações perturbam a função da via idade-regulação e, portanto, alterar a vida útil de todo o organismo, eles oferecem importantes perspectivas mecanicistas 1-3. Outra estratégia para investigar a regulação da vida útil é a utilização de pequenas moléculas para perturbar a idade regulamentar caminhos. Até à data, um número de moléculas são conhecidos por prolongar sua vida útil em vários organismos modelo e são utilizados como ferramentas para estudar a biologia do envelhecimento 16/04. O número de moléculas identificadas até agora é pequeno se comparado ao &quot;conjunto de ferramentas&quot; genético que está disponível para estudar a biologia do envelhecimento. Caenorhabditis elegans é um dos modelos princípio usado para estudar o envelhecimento devido à sua genética excelente e curta duração de três semanas. Mais recentemente, C.elegans tem emergido como um organismo modelo para telas de fenótipo baseado drogas 5,7,16-20 por causa de seu pequeno tamanho e sua capacidade de crescer em placas de microtitulação. Aqui apresentamos um ensaio para medir C.elegans vida em 96 placas de microtitulação. O ensaio foi desenvolvido e utilizado com sucesso para a tela de grandes bibliotecas de moléculas que se estendem C.elegans vida 7. A confiabilidade do ensaio foi avaliada em testes de múltipla: primeiro, através da medição do tempo de vida de animais de tipo selvagem crescidas em diferentes temperaturas, em segundo lugar, através da medição do tempo de vida dos mutantes, com expectativa de vida alterado, em terceiro lugar, medindo mudanças na expectativa de vida em resposta a diferentes concentrações da mirtazapina antidepressivo. A mirtazapina tem sido mostrado previamente para estender o tempo em C.elegans 7. Os resultados destes testes mostram que o ensaio é capaz de reproduzir os achados anteriores de outros ensaios e quantitativa. O formato de microtitulação também faz esse ensaio vida compatível com sistemas de tratamento automatizado líquido e permite a integração em plataformas automatizadas.

Neste protocolo, apresentamos um método para medir<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Tempo de vida em 96 placas de microtitulação.

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

A longevidade é um processo biológico regulado por diversas vias genéticas. Uma estratégia para investigar a biologia do envelhecimento consiste em estudar animais que apresentam...

O objetivo geral deste procedimento é medir a longevidade de vermes nematoides do mar tratados com fármacos de interesse. Isso é realizado primeiramente preparando OP 50, uma linhagem bacteriana, que é usada para alimentar os vermes. Em seguida, é gerada uma população de vermes sincronizada por idade, que é semada em placas de 96 poços juntamente com as bactérias alimentares OP 50.Nos dois dias seguintes, os vermes crescem até o estágio larval L4 e o fármaco FUDR é adicionado para impedir a reprodução. No dia seguinte, os vermes atingem a fase adulta e os fármacos de interesse são adicionados aos poços individuais. A partir desse momento, o número de vermes vivos e mortos é determinado a cada dois ou três dias, até que todos os vermes tenham morrido.A observação é realizada utilizando um microscópio invertido e o número de vermes mortos e vivos é registrado em cada sessão. Olá, sou Greg Solis. Estou no Laboratório Petro, no Departamento de Fisiologia Química do Instituto de Pesquisa Scripps.Hoje vou mostrar como sincronizar vermes e distribuí-los em placas de microtitulação de 96 poços. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela permite a identificação rápida de moléculas que prolongam a longevidade em C. elegans. Então, vamos começar.Para preparar as bactérias para alimentação de C. elegans, comece no dia menos sete inoculando cinco mililitros de TB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina e 0,1 microgramas por mililitro de tetraciclina com uma única colônia OP50. Incube durante a noite a 37 graus Celsius em um agitador bacteriano. Na manhã seguinte, dilua a cultura de OP50 em 2000 em 300 mililitros de TB contendo 50 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube a cultura em um agitador bacteriano por oito a 12 horas a 37 graus Celsius até atingir a saturação. Não permita que a cultura cresça por mais de 14 horas.Transfira o OP 50 para um tubo de centrífuga estéril previamente pesado. Peliculize o OP 50 por centrifugação durante 10 minutos a 3.500 RPM ou 2.200 × g em uma centrífuga de bancada. Descarte o sobrenadante S, ressuspenda o pellet de OP 50 em água estéril e repeliculize por centrifugação. Repita essa lavagem duas vezes após a segunda lavagem.Lave cuidadosamente e remova completamente toda a água remanescente. Pese o tubo de centrifugação contendo o pellet e subtraia o peso do tubo de centrifugação vazio para determinar a massa do pellet. Em seguida, reconstitua completamente o pellet em S Complete até uma concentração de 100 miligramas por mililitro.Não devem restar aglomerados. A concentração de 100 miligramas por mililitro de OP 50 deve corresponder a duas vezes 10 elevado a 10 bactérias por mililitro. Utilize o espectrofotômetro para determinar o número de bactérias por mililitro, caso a relação entre a densidade óptica e o número de bactérias por mililitro seja conhecida.Se necessário, ajuste a concentração da solução alimentícia OP 50 para duas vezes 10 à potência de 10 bactérias por mililitro. Por fim, armazene a solução OP 50 a quatro graus Celsius até que seja utilizada para o cultivo de vermes, a fim de gerar uma população de vermes com idade sincronizada. Inicie na tarde do dia menos seis com uma placa NGM com cinco a 10 dias de idade, na qual a população de vermes consiste principalmente em larvas L1 desnutridas.Esterilize uma espátula de metal aquecendo-a brevemente sobre um bico de Bunsen. Deixe esfriar. Em seguida, use a espátula fria para cortar pedaços de ágar da placa contendo os vermes em jejum.Transfira vários desses fragmentos para uma nova placa NGM de 10 centímetros semeados com OP50. Incube os vermes por aproximadamente 65 horas a 20 graus Celsius até que a maioria da população de vermes consista em adultos maduros. O tempo necessário para que os animais L1 em jejum cresçam até se tornarem adultos maduros pode variar de linhagem para linhagem.Após a incubação, colete os vermes da placa de 10 centímetros lavando-os da placa com cinco a 10 mililitros de água estéril. Transfira a solução de vermes para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave os vermes centrifugando por dois minutos em uma centrífuga de bancada a 1.200 RPM ou 280 vezes G. Descarte o sobrenadante e adicione 10 mililitros de água.Repita a etapa de lavagem, remova o sobrenadante SUP e adicione cinco mililitros de hipoclorito recém-preparado. Incube com solução de hidróxido de sódio por cinco minutos à temperatura ambiente até que os vermes se abram. Certifique-se de fazer vortex suavemente a cada minuto.Monitore o progresso da reação ao microscópio estereoscópico assim que todos os adultos se dissolverem. Adicione cinco mililitros de tampão M nove para neutralizar a reação. Lave os ovos três vezes com 10 mililitros de tampão M nove por centrifugação durante dois minutos a 2.500 RPM ou 1.100 × g. Em seguida, lave os ovos uma vez com 10 mililitros de S completo por centrifugação durante dois minutos a 2.500 RPM ou 1.100 × g. Remova o sobrenadante.Adicione 10 mililitros de S completo e transfira a solução para um tubo cônico novo de 50 mililitros. Adicione 30 mililitros de S completo para um volume final de 40 mililitros. Agite suavemente o tubo durante a noite à temperatura ambiente em um agitador ou dispositivo semelhante para semear as placas de animais no dia seguinte por volta do meio-dia.Sob um microscópio estereoscópico, verifique se as larvas eclodiram durante a noite. Determine a concentração de larvas na solução S completa contando o número de larvas em gotas de 10 microlitros. Usando um microscópio estereoscópico, conte pelo menos 10 gotas para cada amostra.Resus.Suspenda os vermes numa concentração de 80 a 100 vermes por mililitro. No meio S completo, adicione carbenicilina até uma concentração final de 50 microgramas por mililitro e anfotericina B até uma concentração final de 0,1 micrograma por mililitro. Agite em um agitador. Se estiver preparando quantidades maiores de vermes, use um frasco não clônico de 600 mililitros com tampa com filtro. Às 14h30, adicione o OP 50 preparado na parte um até uma concentração final de seis miligramas por mililitro. Retorne o OP 50 a quatro graus Celsius. Transfira 120 microlitros da solução de vermes com OP 50 para cada poço de uma placa de 96 poços com fundo transparente.Certifique-se de manter os vermes e a suspensão enquanto pipeta; feche a placa usando um selador adesivo para evitar contaminação e evaporação. Agite a placa em um agitador para microplacas durante dois minutos e incube por dois dias a 20 graus Celsius até que os animais atinjam o estágio L4. Em seguida, para esterilizar os animais, adicione 30 microlitros de uma solução estoque de FUDR 0,6 milimolar a cada poço.Esta etapa leva o volume final em cada poço a 150 microlitros e reduz a concentração final de OP 50 de seis miligramas por mililitro para cinco miligramas por mililitro. Selle a placa usando seladores adesivos e agite-a por dois a três minutos em um agitador de microplacas. Se o OP 50 foi adicionado às 2h30 do dia anterior a dois dias, é importante que o FUDR seja adicionado antes do meio-dia e que as placas sejam devolvidas ao incubador a 20 graus Celsius até as 9h00 do dia seguinte.A maioria dos animais deve estar grave e conter vários ovos. Adicione a cada um os fármacos cujo efeito sobre a longevidade deve ser testado, na concentração desejada. Se os fármacos forem dissolvidos em DMSO, as concentrações finais de DMSO não devem exceder 0,6%, pois concentrações de DMSO superiores a 0,6% encurtam a longevidade de *C. elegans* após a adição do fármaco.Selar as placas com selador adesivo e agitá-las por dois a três minutos em um agitador para placas microtituladoras. Devolver as placas ao incubador a 20 graus Celsius. A adição dos fármacos pode ocasionalmente matar alguns animais por placa, especialmente se for utilizado um solvente diferente da água.Utilize um microscópio invertido para verificar a presença de animais mortos. Geralmente, deve haver menos de 10 animais mortos por placa de 96 poços. Retorne as placas ao incubador a 20 graus Celsius por dois dias para permitir que oxigênio fresco entre na cultura. Remova o selante.Aguarde um minuto e resele a placa. Agite a placa por dois a três minutos em um agitador de placas microtitulador, repita uma vez por semana no quinto dia da vida adulta. Adicione cinco microlitros da solução de OP50 a 100 miligramas por mililitro preparada anteriormente a cada uma das 96 poças para prevenir a inanição. Os vermes são avaliados quanto à longevidade com base em seu movimento três vezes por semana desde o início do experimento até a morte.Utilize um microscópio invertido com uma objetiva de 2x ou 2,5x para observar os vermes em placas de 96 poços no dia zero, no início do experimento. Conte o número total de vermes em cada poço.Poços do sensor que contêm mais de 18 animais a partir da análise, pois animais nesses poços não terão OP 50 suficiente e mostrarão efeitos de restrição dietética em cada sessão de contagem. Registre a data e o número de animais que se movem como animais vivos. O movimento e o líquido são muito mais fáceis do que em meio sólido e podem ser induzidos por luzes intensas.O uso de uma maior ampliação pode ajudar a detectar movimentos muito sutis, como os na ponta da faringe. Tais movimentos sutis são frequentemente os únicos observados em animais muito velhos. Retorne as placas ao incubador a 20 graus Celsius.Repita as sessões de contagem a cada dois ou três dias até que todos os animais estejam mortos. Este é um modelo de planilha do Excel para registrar os dados de longevidade de cada poço. Suas coordenadas na placa incluem a linhagem, a concentração do fármaco, e o número total de animais vivos no dia zero, registrado no início do experimento.Registre a data, bem como o número de animais vivos e mortos três vezes por semana, a fim de acompanhar a sobrevivência das várias populações em cada poço. Esta figura mostra os resultados de *C. elegans*, curvas de longevidade registradas a 20 graus Celsius e 25 graus Celsius. O ensaio de longevidade baseado em microplacas reproduz com precisão as alterações dependentes da temperatura na longevidade.Da mesma forma, como mostrado aqui, o ensaio em placa de microtitulação reproduz alterações na longevidade de mutantes relatados como tendo longevidades diferentes das do tipo selvagem N dois animais. Esta figura mostra como doses crescentes de mirtazapina afetam a longevidade média de sea elegance. Os dados obtidos pelo ensaio em placa de microtitulação são quantitativos o suficiente para determinar relações de resposta à dose. Uma vez dominada, esta técnica pode ser usada para triar grandes bibliotecas químicas em busca de moléculas que prolonguem a longevidade e see elegance.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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