Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

O objetivo geral deste procedimento é medir a longevidade de vermes nematoides do mar tratados com fármacos de interesse. Isso é realizado primeiramente preparando OP 50, uma linhagem bacteriana, que é usada para alimentar os vermes. Em seguida, é gerada uma população de vermes sincronizada por idade, que é semada em placas de 96 poços juntamente com as bactérias alimentares OP 50.

Nos dois dias seguintes, os vermes crescem até o estágio larval L4 e o fármaco FUDR é adicionado para impedir a reprodução. No dia seguinte, os vermes atingem a fase adulta e os fármacos de interesse são adicionados aos poços individuais. A partir desse momento, o número de vermes vivos e mortos é determinado a cada dois ou três dias, até que todos os vermes tenham morrido.

A observação é realizada utilizando um microscópio invertido e o número de vermes mortos e vivos é registrado em cada sessão. Olá, sou Greg Solis. Estou no Laboratório Petro, no Departamento de Fisiologia Química do Instituto de Pesquisa Scripps.

Hoje vou mostrar como sincronizar vermes e distribuí-los em placas de microtitulação de 96 poços. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela permite a identificação rápida de moléculas que prolongam a longevidade em C. elegans. Então, vamos começar.

Para preparar as bactérias para alimentação de C. elegans, comece no dia menos sete inoculando cinco mililitros de TB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina e 0,1 microgramas por mililitro de tetraciclina com uma única colônia OP50. Incube durante a noite a 37 graus Celsius em um agitador bacteriano. Na manhã seguinte, dilua a cultura de OP50 em 2000 em 300 mililitros de TB contendo 50 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube a cultura em um agitador bacteriano por oito a 12 horas a 37 graus Celsius até atingir a saturação. Não permita que a cultura cresça por mais de 14 horas.

Transfira o OP 50 para um tubo de centrífuga estéril previamente pesado. Peliculize o OP 50 por centrifugação durante 10 minutos a 3.500 RPM ou 2.200 × g em uma centrífuga de bancada. Descarte o sobrenadante S, ressuspenda o pellet de OP 50 em água estéril e repeliculize por centrifugação. Repita essa lavagem duas vezes após a segunda lavagem.

Lave cuidadosamente e remova completamente toda a água remanescente. Pese o tubo de centrifugação contendo o pellet e subtraia o peso do tubo de centrifugação vazio para determinar a massa do pellet. Em seguida, reconstitua completamente o pellet em S Complete até uma concentração de 100 miligramas por mililitro.

Não devem restar aglomerados. A concentração de 100 miligramas por mililitro de OP 50 deve corresponder a duas vezes 10 elevado a 10 bactérias por mililitro. Utilize o espectrofotômetro para determinar o número de bactérias por mililitro, caso a relação entre a densidade óptica e o número de bactérias por mililitro seja conhecida.

Se necessário, ajuste a concentração da solução alimentícia OP 50 para duas vezes 10 à potência de 10 bactérias por mililitro. Por fim, armazene a solução OP 50 a quatro graus Celsius até que seja utilizada para o cultivo de vermes, a fim de gerar uma população de vermes com idade sincronizada. Inicie na tarde do dia menos seis com uma placa NGM com cinco a 10 dias de idade, na qual a população de vermes consiste principalmente em larvas L1 desnutridas.

Esterilize uma espátula de metal aquecendo-a brevemente sobre um bico de Bunsen. Deixe esfriar. Em seguida, use a espátula fria para cortar pedaços de ágar da placa contendo os vermes em jejum.

Transfira vários desses fragmentos para uma nova placa NGM de 10 centímetros semeados com OP50. Incube os vermes por aproximadamente 65 horas a 20 graus Celsius até que a maioria da população de vermes consista em adultos maduros. O tempo necessário para que os animais L1 em jejum cresçam até se tornarem adultos maduros pode variar de linhagem para linhagem.

Após a incubação, colete os vermes da placa de 10 centímetros lavando-os da placa com cinco a 10 mililitros de água estéril. Transfira a solução de vermes para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave os vermes centrifugando por dois minutos em uma centrífuga de bancada a 1.200 RPM ou 280 vezes G. Descarte o sobrenadante e adicione 10 mililitros de água.

Repita a etapa de lavagem, remova o sobrenadante SUP e adicione cinco mililitros de hipoclorito recém-preparado. Incube com solução de hidróxido de sódio por cinco minutos à temperatura ambiente até que os vermes se abram. Certifique-se de fazer vortex suavemente a cada minuto.

Monitore o progresso da reação ao microscópio estereoscópico assim que todos os adultos se dissolverem. Adicione cinco mililitros de tampão M nove para neutralizar a reação. Lave os ovos três vezes com 10 mililitros de tampão M nove por centrifugação durante dois minutos a 2.500 RPM ou 1.100 × g. Em seguida, lave os ovos uma vez com 10 mililitros de S completo por centrifugação durante dois minutos a 2.500 RPM ou 1.100 × g. Remova o sobrenadante.

Adicione 10 mililitros de S completo e transfira a solução para um tubo cônico novo de 50 mililitros. Adicione 30 mililitros de S completo para um volume final de 40 mililitros. Agite suavemente o tubo durante a noite à temperatura ambiente em um agitador ou dispositivo semelhante para semear as placas de animais no dia seguinte por volta do meio-dia.

Sob um microscópio estereoscópico, verifique se as larvas eclodiram durante a noite. Determine a concentração de larvas na solução S completa contando o número de larvas em gotas de 10 microlitros. Usando um microscópio estereoscópico, conte pelo menos 10 gotas para cada amostra.Resus.

Suspenda os vermes numa concentração de 80 a 100 vermes por mililitro. No meio S completo, adicione carbenicilina até uma concentração final de 50 microgramas por mililitro e anfotericina B até uma concentração final de 0,1 micrograma por mililitro. Agite em um agitador.

Se estiver preparando quantidades maiores de vermes, use um frasco não clônico de 600 mililitros com tampa com filtro. Às 14h30, adicione o OP 50 preparado na parte um até uma concentração final de seis miligramas por mililitro. Retorne o OP 50 a quatro graus Celsius. Transfira 120 microlitros da solução de vermes com OP 50 para cada poço de uma placa de 96 poços com fundo transparente.

Certifique-se de manter os vermes e a suspensão enquanto pipeta; feche a placa usando um selador adesivo para evitar contaminação e evaporação. Agite a placa em um agitador para microplacas durante dois minutos e incube por dois dias a 20 graus Celsius até que os animais atinjam o estágio L4. Em seguida, para esterilizar os animais, adicione 30 microlitros de uma solução estoque de FUDR 0,6 milimolar a cada poço.

Esta etapa leva o volume final em cada poço a 150 microlitros e reduz a concentração final de OP 50 de seis miligramas por mililitro para cinco miligramas por mililitro. Selle a placa usando seladores adesivos e agite-a por dois a três minutos em um agitador de microplacas. Se o OP 50 foi adicionado às 2h30 do dia anterior a dois dias, é importante que o FUDR seja adicionado antes do meio-dia e que as placas sejam devolvidas ao incubador a 20 graus Celsius até as 9h00 do dia seguinte.

A maioria dos animais deve estar grave e conter vários ovos. Adicione a cada um os fármacos cujo efeito sobre a longevidade deve ser testado, na concentração desejada. Se os fármacos forem dissolvidos em DMSO, as concentrações finais de DMSO não devem exceder 0,6%, pois concentrações de DMSO superiores a 0,6% encurtam a longevidade de *C. elegans* após a adição do fármaco.

Selar as placas com selador adesivo e agitá-las por dois a três minutos em um agitador para placas microtituladoras. Devolver as placas ao incubador a 20 graus Celsius. A adição dos fármacos pode ocasionalmente matar alguns animais por placa, especialmente se for utilizado um solvente diferente da água.

Utilize um microscópio invertido para verificar a presença de animais mortos. Geralmente, deve haver menos de 10 animais mortos por placa de 96 poços. Retorne as placas ao incubador a 20 graus Celsius por dois dias para permitir que oxigênio fresco entre na cultura. Remova o selante.

Aguarde um minuto e resele a placa. Agite a placa por dois a três minutos em um agitador de placas microtitulador, repita uma vez por semana no quinto dia da vida adulta. Adicione cinco microlitros da solução de OP50 a 100 miligramas por mililitro preparada anteriormente a cada uma das 96 poças para prevenir a inanição. Os vermes são avaliados quanto à longevidade com base em seu movimento três vezes por semana desde o início do experimento até a morte.

Utilize um microscópio invertido com uma objetiva de 2x ou 2,5x para observar os vermes em placas de 96 poços no dia zero, no início do experimento. Conte o número total de vermes em cada poço.

Poços do sensor que contêm mais de 18 animais a partir da análise, pois animais nesses poços não terão OP 50 suficiente e mostrarão efeitos de restrição dietética em cada sessão de contagem. Registre a data e o número de animais que se movem como animais vivos. O movimento e o líquido são muito mais fáceis do que em meio sólido e podem ser induzidos por luzes intensas.

O uso de uma maior ampliação pode ajudar a detectar movimentos muito sutis, como os na ponta da faringe. Tais movimentos sutis são frequentemente os únicos observados em animais muito velhos. Retorne as placas ao incubador a 20 graus Celsius.

Repita as sessões de contagem a cada dois ou três dias até que todos os animais estejam mortos. Este é um modelo de planilha do Excel para registrar os dados de longevidade de cada poço. Suas coordenadas na placa incluem a linhagem, a concentração do fármaco, e o número total de animais vivos no dia zero, registrado no início do experimento.

Registre a data, bem como o número de animais vivos e mortos três vezes por semana, a fim de acompanhar a sobrevivência das várias populações em cada poço. Esta figura mostra os resultados de *C. elegans*, curvas de longevidade registradas a 20 graus Celsius e 25 graus Celsius. O ensaio de longevidade baseado em microplacas reproduz com precisão as alterações dependentes da temperatura na longevidade.

Da mesma forma, como mostrado aqui, o ensaio em placa de microtitulação reproduz alterações na longevidade de mutantes relatados como tendo longevidades diferentes das do tipo selvagem N dois animais. Esta figura mostra como doses crescentes de mirtazapina afetam a longevidade média de sea elegance. Os dados obtidos pelo ensaio em placa de microtitulação são quantitativos o suficiente para determinar relações de resposta à dose. Uma vez dominada, esta técnica pode ser usada para triar grandes bibliotecas químicas em busca de moléculas que prolonguem a longevidade e see elegance.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.