Name: Carregando Drosophila terminais nervosos com indicadores de cálcio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Aprenda a técnica de carregamento de indicadores de cálcio em terminais nervosos de Drosophila para estudar sinalização neuronal. Este método permite investigar dinâmicas de cálcio em neurotransmissão com precisão.

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<ol><li> Selecione um prato de dissecação limpa que não tenha sido exposto a qualquer fixadores. </li><li> Dissecar um errante 3 º instar larva Drosophila em Meio Schneider Drosophila contendo Ca 2 + e L-glutamina, (não cortar qualquer nervos ou fibras musculares danos n º s 7, 6, 13 ou 12). </li><li> Selecione um copo de enchimento da pipeta com uma ponta de 12 mícrons (diâmetro interno). </li><li> Usando uma seringa e tubos (para aplicar pressão negativa para a pipeta) garantir que a ponta da pipeta não está obstruído. </li><li> Selecione um plástico fino filamento de enchimento que podem ser inseridos ao longo do comprimento da pipeta de vidro. </li><li> Desenhe ~ 1 cm de 5 mM dextran-conjugados Ca 2 +-indicador para o filamento de plástico. </li><li> Cortar todos os nervos segmento. </li><li> Apoio a pipeta em uma rampa que irá permitir a ponta da pipeta a abordagem da linha média ventral da larva dissecados. </li><li> Desenhe o corte final de um nervo para o segmento No.4, sem comprimindo o nervo, na extremidade da pipeta (incluir uma pequena quantidade de meio Schneider). </li><li> Remova o tubo e insira o filamento de plástico para a pipeta até o final do filamento é dentro de 50 microns do fim do corte do nervo (evitar tocar o nervo). </li><li> Eject suficiente Ca 2 +-indicador para a terminação nervosa para aumentar o volume de meio a Schneider em cerca de 33% (concentração final deve ser &lt;2mm). Importante - Este deve ser concluída dentro de 5 minutos de cortar o nervo. </li><li> Coloque a preparação no escuro à temperatura ambiente, enquanto as cargas do nervo. </li><li> Após 40 minutos retire o Ca 2 + indicador usando o filamento. </li><li> Deixe a pipeta no lugar e preenchê-lo completamente com o meio Schneider fresca, como isto será usado para aplicar pulsos estimulantes para o nervo. </li><li> Permitir que o Ca 2 + indicador de equilibrar no nervo por pelo menos 60 minutos, mas não mais do que 4 horas, antes de iniciar Ca 2 +-imagem. </li><li> Lavar a preparação com meio fresco Schneider cada 30 minutos enquanto ele é equilibrante. </li><li> 20 minutos antes de substituir o meio de imagens Schneider com hemolinfa-Like solução No.6 (HL6; Macleod et al 2002;. 2003). </li><li> L-ácido glutâmico ou glutamato podem ser adicionados a HL6 solução a 7mm para dessensibilizar os receptores pós-sinápticos do glutamato para evitar nervo evocadas contração muscular (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005). </li></ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+activity+in+the+Drosophila+larval+CNS+detected+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators.</a> J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).</li>
<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+active+zone+density+during+long-term+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

<table><tbody><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Insect Medium</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>deve conter L-glutamina e cálcio</td></tr><tr><td>sal monossódico de ácido L-glutâmico hidratado</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr></tbody></table>

carregando drosophila terminais nervosos com indicadores de cálcio

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Cálcio desempenha muitas funções no sistema nervoso, mas nenhum mais impressionante do que como o gatilho para a liberação do neurotransmissor, e ninguém mais profundo do que como o mensageiro essencial para a plasticidade sináptica que apoie a aprendizagem e memória. Para melhor elucidar as bases moleculares de Ca 2 + dependentes de mecanismos sinápticos, um sistema modelo é necessário que seja geneticamente maleável e fisiologicamente acessível. Drosophila melanogaster fornece um modelo desse tipo. Neste sistema, geneticamente codificados indicadores fluorescentes estão disponíveis para detectar Ca 2 + mudanças nas terminações nervosas. No entanto, estes indicadores têm limitada sensibilidade ao Ca 2 + e muitas vezes mostram uma resposta não linear. Sintética indicadores fluorescentes são mais adequadas para medir a rápida Ca 2 + mudanças associadas com a atividade do nervo. Aqui nós demonstramos uma técnica para carregar dextran-conjugados sintéticos Ca 2 + indicadores em terminais nervosos viver em larvas de Drosophila. Ênfase particular é colocada sobre os aspectos do protocolo mais críticos para o sucesso da técnica, como forma de evitar descargas de eletricidade estática ao longo dos nervos isolados, manter a saúde da preparação durante os períodos de carga estendida, e garantindo a sobrevivência do axônio, fornecendo Ca 2 + para promover a vedação de terminações dos axônios cortados. Baixa afinidade dextran-conjugados Ca 2 +-indicadores, como a fluo-4 e Rhod, estão disponíveis, que mostram uma relação sinal-ruído alta, enquanto minimamente perturbar Ca 2 + pré-sináptica dinâmica. Dextran conjugação-ajuda a prevenir Ca 2 + indicadores sendo seqüestrado em organelas como as mitocôndrias. A técnica de carregamento pode ser aplicado igualmente para as larvas, os embriões e adultos.

O cálcio é um mensageiro onipresente no sistema nervoso, essencial para desencadear a liberação de neurotransmissores e as alterações na força sináptica. Aqui nós demonstramos uma técnica para carregar Ca 2 +-indicadores em terminais nervosos Drosophila. Nós também demonstram a fabricação dos aparelhos necessários e enfatizar os pontos críticos para o sucesso da técnica.

Carregando Drosophila terminais nervosos com indicadores de cálcio

O cálcio desempenha diversas funções no sistema nervoso, mas nenhuma mais impressionante do que como o gatilho para a liberação de neurotransmissores, e nenhuma mais profunda do que como...

Olá, meu nome é Greg McLeod. Meu laboratório estuda a regulação do cálcio em terminais nervosos e seu impacto na neurotransmissão. Fazemos isso em Oph Melanogaster.A mosca-das-frutas é um modelo atrativo para neurocientistas devido à sua maleabilidade genética e sistema nervoso simples e acessível. Nesse sistema nervoso, indicadores fluorescentes geneticamente codificados estão disponíveis para detectar alterações de cálcio em terminações nervosas. No entanto, esses indicadores possuem sensibilidade limitada ao cálcio e frequentemente exibem uma resposta não linear.Os indicadores sintéticos são mais adequados para medir as alterações rápidas de cálcio associadas à atividade nervosa. Demonstraremos uma técnica para carregar indicadores sintéticos de cálcio conjugados com dextrina em terminais nervosos vivos em oph lava. A conjugação com dextrina ajuda a impedir que os indicadores de cálcio sejam sequestrados em organelas como as mitocôndrias.A técnica de carregamento pode ser aplicada igualmente a larvas, embriões e adultos. Vamos dissecar uma larva em um banho pequeno de cigarro sobre uma lâmina de vidro. A cera dental azul irá suportar uma placa de carregamento de vidro.Retire uma

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos as características estruturais das sinapses Glia-neuromuscular em um romance de preparação dos tecidos dentro para fora-de larvas de moscas ao vivo usando corantes fluorescentes com microscopia confocal. Nós rotulados terminais de neurônios fluorescentes viver com anticorpos primários para HRP, e também visualizar o espaço perisynaptic com Dextranos fluorescente.

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Nós descrevemos uma técnica estabelecida para medir e analisar odor evocadas respostas de cálcio no lobo antenal de...

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

Este vídeo descreve imagens de cálcio in vivo em neurônios de Drosophila usando GCaMP. O clipe de protocolo em destaque mostra como registrar alterações na fluorescência do GCaMP dos neurônios do corpo do cogumelo durante um experimento de condicionamento olfativo.

Drosophila In Vivo Imagem de cálcio: um método para imagem funcional da atividade neuronal

Neste vídeo, as fibras nervosas das larvas de Drosophila são imersas em corante FM, que se liga aos lipídios da membrana celular. O microeletrodo de sucção e os pulsos elétricos estimulam o processo de endocitose, incorporando o corante FM em vesículas endocíticas recém-formadas. Este método, que visualiza estágios pré-sinápticos de neurotransmissão, é útil para estudar a função sináptica e a liberação de neurotransmissores.

Carga e descarga de corante FM mediada por microeletrodo em células nervosas de larvas de Drosophila

Este vídeo demonstra um protocolo para estudar a reciclagem de vesículas sinápticas em junções neuromusculares em larvas de Drosophila que expressam channelrodopsina usando um corante fluorescente. A luz azul ativa as channelrodopsinas, causando influxo de cálcio e exocitose de vesículas sinápticas. O corante se integra às membranas neuronais e é internalizado durante a endocitose, resultando em maior fluorescência. A estimulação adicional da luz azul induz exocitose e liberação de corante, o...

Analisando a reciclagem de vesículas sinápticas e a absorção de corantes fluorescentes em larvas de Drosophila

Este vídeo demonstra um método para imagens de cálcio in vivo usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em moscas. Ele descreve as etapas para preparar as moscas para microscopia, conduzir o condicionamento olfativo e visualizar o influxo de cálcio induzido por odor.

in vivo Imagens de cálcio usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em Drosophila melanogaster

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Este vídeo demonstra imagens de cálcio para estudo Drosophila respostas cerebrais a neuropeptídeos. Os neurônios que expressam um indicador fluorescente de cálcio revelam a dinâmica do cálcio intracelular e as respostas funcionais às moléculas de sinalização.

Imagens de cálcio ex vivo para estudar as respostas cerebrais de Drosophila a neuropeptídeos

As patas dianteiras e a tromba de Drosophila contêm um rico repertório de neurônios sensoriais gustativos. Aqui, apresentamos um método usando imagens de cálcio para medir as respostas fisiológicas de neurônios sensoriais na perna dianteira e na tromba de moscas vivas após a aplicação exógena de um feromônio gustativo.

Medindo respostas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios sensoriais para Lipid feromonas Usando Imagem de cálcio ao vivo

Aqui, descrevemos um método para carregar um corante sensível ao cálcio através do coto nervoso do sapo nas terminações nervosas. Também apresentamos um protocolo para a gravação e análise de transientes de cálcio rápidos nas terminações nervosas periféricas.

Carregando uma tintura de cálcio em terminação de nervo de sapo através do coto nervoso: Registro de transientes de cálcio na união neuromuscular de sapo

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Este protocolo avalia a atividade sináptica funcional entre parceiros neuronais definidos in vivo no sistema nervoso central das larvas de Drosophila melanogaster , utilizando ferramentas geneticamente codificadas. Estimulação optogenética mediada por CsChrimson de neurônios sensoriais cIVda pré-sinápticos induz fotoconversão dependente de cálcio do CaMPARI em interneurônios pós-sinápticos da Bacia-4.

Caracterização funcional de parceiros pré e pós-sinápticos individuais no sistema nervoso central larvar de Drosophila usando CaMPARI

Aprenda a técnica de carregamento de indicadores de cálcio em terminais nervosos de Drosophila para estudar sinalização neuronal. Este método permite investigar dinâmicas de cálcio em neurotransmissão com precisão.

Carregando Drosophila terminais nervosos com indicadores de cálcio

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