Carregando Drosophila terminais nervosos com indicadores de cálcio

Olá, meu nome é Greg McLeod. Meu laboratório estuda a regulação do cálcio em terminais nervosos e seu impacto na neurotransmissão. Fazemos isso em Oph Melanogaster.

A mosca-das-frutas é um modelo atrativo para neurocientistas devido à sua maleabilidade genética e sistema nervoso simples e acessível. Nesse sistema nervoso, indicadores fluorescentes geneticamente codificados estão disponíveis para detectar alterações de cálcio em terminações nervosas. No entanto, esses indicadores possuem sensibilidade limitada ao cálcio e frequentemente exibem uma resposta não linear.

Os indicadores sintéticos são mais adequados para medir as alterações rápidas de cálcio associadas à atividade nervosa. Demonstraremos uma técnica para carregar indicadores sintéticos de cálcio conjugados com dextrina em terminais nervosos vivos em oph lava. A conjugação com dextrina ajuda a impedir que os indicadores de cálcio sejam sequestrados em organelas como as mitocôndrias.

A técnica de carregamento pode ser aplicada igualmente a larvas, embriões e adultos. Vamos dissecar uma larva em um banho pequeno de cigarro sobre uma lâmina de vidro. A cera dental azul irá suportar uma placa de carregamento de vidro.

Retire uma larva errante de terceiro estágio da lateral de um tubo não lotado. Coloque a larva em várias gotas de solução de Schneider gelada e fixe-a pela cabeça e pela cauda, com a linha média dorsal voltada para cima. Utilize um par de tesoura microcirúrgica afiada para fazer um corte.

Uma pequena incisão entre a tra aqui, grande o suficiente para permitir que a lâmina inferior da tesoura penetre. Corte a cutícula ao longo da linha média dorsal entre a traia até alcançar a cabeça. Gire a larva 180 graus e prolongue a incisão até a cauda.

É importante não permitir que a lâmina inferior penetre muito profundamente nas vísceras, mas sim na larva, pois isso danificará os músculos e nervos que se deseja examinar. A maior parte das vísceras será expulsa através da incisão; corte o trato aqui próximo à cauda em um lado, e corte a traqueia subjacente até alcançar a cabeça. Repita do outro lado.

Remova a maior parte da víscera cortando-a e retirando-a do banho. Pare um momento, deixe a tesoura e pegue um segundo par de pinças. Segure a borda cortada da cutícula e fixe-a esticada para um dos lados.

Repita para o outro lado. Prossiga quatro segmentos em direção à cabeça para repetir o procedimento. Corte. Quaisquer vísceras remanescentes nesta etapa. Certifique-se de que nenhum dano tenha sido causado aos músculos 7, 6, 13 ou 12 em nenhum dos segmentos.

Se algum tiver sido danificado, dissecar outro lava, pois esse dano inevitavelmente resulta em contrações geniculadas que tornarão qualquer imagem subsequente problemática. Os hemisférios cerebrais, o gânglio ventral e os nervos segmentares agora estão aparentes nos passos seguintes. Vamos puxar a extremidade cortada sob pressão para dentro do nervo segmentar em uma cama de FOP de vidro e usar um filamento plástico de preenchimento para aplicar um indicador de cálcio na extremidade exposta do nervo.

Mas primeiro, demonstraremos como fazer o filamento de preenchimento e o efeito de preenchimento para produzir o filamento de preenchimento. Uma técnica de puxamento em dois estágios será aplicada a um defeituoso amarelo, aquecendo-se lentamente até a metade do seu comprimento até que o plástico fique macio e transparente. Interrompa o aquecimento neste ponto e imediatamente puxe a ponta para esticá-la, formando um filamento fino.

Isso tem cerca de meio milímetro de diâmetro. Corte o filamento com um comprimento de 50 milímetros. Agora, coloque o filamento sob um microscópio de dissecação e fixe o corte.

Termine com uma miniatura e puxe a outra extremidade para extrair um filamento fino com um centímetro de comprimento. Este deve ser cortado com uma lâmina de barbear nova sobre papel de filtro para evitar amassá-lo e manter sua ponta afiada, a fim de preparar o enchimento. Comece com um capilar de parede fina sem qualquer filamento.

Puxe-o até formar uma ponta fina e afilada em um puxador de micropipetas. Leve esta preparação a um microscópio de dissecação e risque a porção afilada com um pedaço de lixa. Empurre a ponta distal ao entalhe para longe do lado entalhado, de modo que a ponta quebre de forma reta.

O diâmetro interno da ponta rompida deve ser maior que o diâmetro externo. Na extremidade do filamento de enchimento, use uma microponte para aquecer e contrair a ponta rompida dentro do vidro até o efeito, até atingir um diâmetro interno de cerca de 12 mícrons. Use um queimador Bunsen para polir a extremidade romba do efeito.

Pode-se aplicar pressão negativa à extremidade romba do efeito usando um tubo celta de encaixe justo acoplado a um tubo de polilinha rígido e uma seringa. O mesmo tubo e seringa serão usados para aspirar e expelir o indicador de cálcio do filamento. O indicador de cálcio deve ser dissolvido em água destilada até uma concentração de cinco milimolar.

Divida esta solução em alíquotas de cinco microlitros. Aqueça-as em peixe a quatro graus. Não congele esses quatérnios para mantê-los não congelados até o momento do uso.

Agora, aspire um a dois centímetros do indicador de cálcio para dentro do filamento e você estará pronto para prosseguir para a etapa mais crítica desta técnica de carregamento. Pegue sua tesoura e pinça e corte individualmente os nervos do segmento mais anterior, próximos aos gânglios ventrais. O maior feixe de nervos do segmento AOR da região ventral.

Remova todos os detritos. Coloque o filamento de preenchimento sobre a rampa de cera dental com a ponta no centro da larva. Fixe o tubo escolar e a seringa.

Aspire um pouco da solução de Schneider para dentro de uma ponta perfeita. Agora aspire a extremidade do nervo para dentro da ponta. O encaixe deve ser justo, mas não muito apertado.

Deve bloquear a entrada adicional dos Schneiders no protege. Remova geralmente o tubo esclerótico e a seringa e conecte-os ao filamento F. Toque a lateral do filamento nos Schneiders no banho para descarregar qualquer eletricidade estática e insira imediatamente o efeito goma do filamento a uma distância de 50 micrômetros do corte do nervo, sem tocá-lo efetivamente.

É lento ejetar o indicador de cálcio para aumentar o volume do Schneider efetivamente em cerca de um terço. Isso resultará em uma concentração final do indicador de cálcio de pouco menos de dois mili, mantendo o preparo em local escuro, úmido e à temperatura ambiente por cerca de 40 minutos. Gostaria de destacar dois pontos importantes aqui.

Primeiro, uma solução fisiológica deve estar presente na ponta para diluir o indicador de cálcio, já que o indicador de cálcio foi solubilizado apenas em água. A solução fisiológica deve conter cálcio numa concentração de vários milimolares, pois o fechamento do axônio é um processo dependente de cálcio, e o fechamento do axônio é essencial para preservar a saúde dos terminais nervosos.

O segundo ponto é que não devem transcorrer mais de cinco minutos entre o corte dos nervos e a aplicação do corante na extremidade cortada do nervo. Após cinco minutos, as extremidades distais dos axônios excluirão os indicadores de cálcio conjugados à dextrina com pesos moleculares de 10.000. Cumprir esse limite de tempo exigirá alguma prática.

Não tente retardar o teto do axônio reduzindo os níveis de cálcio, pois isso comprometerá apenas a futura função fisiológica do nervo lesionado. Após a incubação de 40 minutos, posicione a preparação em Schneiders agora tocando o lado do filamento de preenchimento na cuba e reinsira-o para remover a maior parte da solução indicadora de cálcio da ponta e do iniciador. Novamente, usando o filamento, aspire Schneiders fresco da cuba e encha completamente o leito com Schneiders.

Não deve haver bolhas no leito, pois a solução de Schneider servirá como um dos condutores isolados do banho enquanto o nervo do copo pet é estimulado; novamente, coloque o preparo em local escuro por pelo menos 60 minutos, mas não mais que quatro horas, e troque os RINs em Schneiders fresco a cada 30 minutos durante a incubação. O indicador de cálcio é transportado para baixo. O axônio se concentra no terminal nervoso 20 minutos antes de você desejar examinar o preparo. Enxágue com solução HL6.

Contenha o nível desejado de cálcio quando o nível de cálcio estiver acima de aproximadamente 0,4 milimolar com glutamato ou ácido L-glutâmico até o HL seis a sete milimolar para interromper a contração muscular evocada pelo nervo. A solução de Schneider não é apropriada para imageamento de cálcio, pois já contém altos níveis de glutamato e cálcio. Esses níveis deverão ser ajustados.

Tate também está presente, tornando possível realizar o carregamento e a imagem autofluorescentes de Schneider em HL seis, desde que o cálcio esteja presente em pelo menos 2 milhões durante o carregamento. Ao preparar a montagem em um microscópio composto para a aquisição de imagens, certifique-se novamente de descarregar toda eletricidade estática do próprio corpo. Em seguida, toque tanto a solução no banho quanto a objetiva com um par de pinças.

Se o objetivo for um objetivo de imersão, abaixe-o até o banho, então momentaneamente conecte a base ao terra estimulando corretamente, ou coloque um no banho e insira o outro para preencher o leito com pulsos CC quadrados de menos de três volts e duração de 300 microssegundos, o que confiavelmente evocará um potencial de ação no nervo. Aqui vemos dois conjuntos de terminais nervosos na fenda entre os músculos seis e sete que foram tornados visíveis por meio da expressão citosólica de GFP. Eles também foram preenchidos anterógradamente com o indicador de cálcio Rod Dextrina, que possui espectros de excitação e emissão diferentes dos do GFP.

Este campo de visão ainda contém os terminais nervosos, mas a Roda Rin possui baixa afinidade pelo cálcio e é quase invisível enquanto o nervo está quiescente. No entanto, é altamente responsiva ao cálcio que entra nos terminais durante potenciais de ação únicos ou breves estímulos em trem de dois segundos. Como mostrado aqui na análise de fluorescência dos estímulos próximos de 80 hertz recém-apresentados, as respostas nos terminais do tipo um S são geralmente maiores do que aquelas nos terminais do tipo um B.

Indicadores de cálcio de baixa afinidade como rododextrina e flu. Uma rododextrina demonstrou resposta quase linear às frequências de estimulação nervosa nestes terminais em uma faixa de 10 a 80 hertz. O exemplo mostrado aqui provém de um terminal nervoso no músculo número quatro, carregado com Rododextrina.