Name: Locomotor ensaio, Aprendizagem e Memória Os déficits no Drosophila Modelos de neurodegeneração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda ensaios comportamentais para avaliar funções locomotoras, aprendizado e memória em Drosophila melanogaster. Este método utiliza geotaxia negativa e fototaxia aversiva para estudar neurodegeneração.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Charles Luetje para fornecer o T-maze e da sala de comportamento. Este trabalho é apoiado pela American Heart Association (a YA), o Instituto Nacional de distúrbio neurológico e Grant Curso R01NS64269 (para RGZ), ea Fundação Pew Charitable (para RGZ).

1. Introdução Neste vídeo, vamos demonstrar dois ensaios comportamentais utilizando Drosophila para demonstrar a medição de locomoção e funções de aprendizagem e de memória que estão comprometidos em doenças neurodegenerativas. Primeiro, vamos mostrar como o comportamento locomotor pode ser medida utilizando o ensaio geotaxis negativo. Em segundo lugar, iremos avaliar o aprendizado ea memória habilidades usando moscas positivamente fototáxico que são treinados para associar luz com um sabor amargo aversivo e depois testados seis horas mais tarde para avaliar as funções de memória. Finalmente, discutiremos as implicações e limitações destes ensaios comportamento. 2. Equipamentos e reagentes <ol><li> Fly trabalho <ul><li> Âmbito estéreo (Zeiss) </li><li> Pequenos pincéis para empurrar moscas </li><li> Drosophila dióxido de carbono (CO 2) aparelho de anestesia (Geneseesci, Inc) </li></ul></li><li> Ensaio Geotaxis negativo <ul><li> 28,5 x 95 Vial Poliestireno mm (Vial Capitol, Inc.) </li><li> Mini Alarme-Timer / Cronômetro (VWR International) </li><li> Canetas Sharpie </li><li> Fita adesiva </li></ul></li><li> Aversivo Assay Supressão fototaxia <ul><li> Cloridrato de quinino (Sigma Aldrich; CAS Number: 6119-47-7) </li><li> Água destilada </li><li> Escala de medição digital para diluição precisos em peso </li><li> Quick Disconnect Connectors, polietileno de alta densidade (Nalgene VWR Catalog No. 62868-021) </li><li> 15 tubo de centrifugação mL (VWR International), corte na marca de 2 mL da extremidade fechada para se encaixar com o adaptador Rápida Conector Disconnect para fonte de luz </li><li> Single-channel pipeta 200 mL de solução de quinino carga em papel filtro de revestimento da câmara </li><li> T-Maze (Simple Sistemas comportamental; Figura 1) </li><li> Folha de alumínio </li><li> Fonte de luz (Zeiss) </li><li> Uma lâmpada com luz vermelha. </li><li> Papel de filtro </li><li> Mini Alarme-Timer / Cronômetro (VWR International) </li></ul></li></ol> 3. Preparando o Flies <ul><li> Moscas são mantidos em meio ágar-fubá-melaço de levedura-padrão a 25 ° C em um 12 hr ciclo claro / escuro. </li><li> Moscas virgem são isolados sob anestesia de dióxido de carbono no dia da eclosão. Para estudos de envelhecimento, as moscas são mantidos em grupos de vinte por frasco e transferido para um frasco de doce a cada 3 dias. É importante o uso de moscas irmão da cruz mesmo dos pais para os estudos de envelhecimento, para minimizar as diferenças decorrentes da base genética. </li><li> Para ambos os ensaios, as moscas são sexados e mantidos em grupos de dez moscas por frasco. A diferença de gênero no comportamento é significativo e é aconselhável não misturar as moscas macho e fêmea em um estudo de como os dados podem ser difíceis de interpretar e reproduzir 6. </li><li> Para o ensaio geotaxis negativo, as moscas são classificados em grupos de dez por frasco e testado uma hora após a anestesia. É importante para moscas para recuperar totalmente da anestesia, pois isso pode ter um efeito sobre as atividades locomotor. </li><li> Para o ensaio APS, moscas de cada grupo são colocadas em um tubo de poliestireno vazio com água papel de filtro umedecido para seis horas antes do ensaio é realizado. Isso garante que as moscas estão famintos antes do ensaio e será mais perceptiva ao gosto aversivo. Pouco antes de o ensaio é realizado, cada voar a partir de um grupo de dez é colocado em um tubo de centrífuga de 15mL vazio, que é então tampado frouxamente, para evitar a fuga. </li></ul> 4. Ensaio Geotaxis negativo <ul><li> Geotaxis geralmente é medido para 10-20 grupos de dez indivíduos de mesmo genótipo ou tratamento (100-200 moscas total para cada genótipo / tratamento) 7. Classificar grupos de dez moscas feminino ou masculino em um aparelho de anestesia CO 2 e colocar cada grupo em um frasco separado. Permitir que pelo menos uma hora para as moscas para recuperar da anestesia. </li><li> Prepare o aparelho de escalada para cada grupo, tanto que dois frascos de poliestireno vazias são unidos por fita vertical frente para o outro. É importante certificar-se que as aberturas dos frascos estão perfeitamente alinhados entre si para fornecer uma superfície uniforme escalada para as moscas. </li><li> Para a parte inferior do frasco, medir uma distância vertical de 8 cm acima da superfície do fundo e marcar cada frasco desenhando um círculo ao redor de toda a circunferência do frasco. </li><li> Transferência de um grupo de dez moscas no menor frasco com cuidado evitando a fuga de qualquer voar. Cobrir imediatamente o menor com o frasco superior e fita de segurança perto da aberturas de contato. Permitir que as moscas que se acostumar com o novo cenário para um minuto antes de realizar o ensaio. </li><li> Bata suavemente as moscas até o fundo do frasco e medir o número de moscas que pode subir acima da marca de 8 cm em 10 segundos após o toque. </li><li> Repita este teste para o mesmo grupo de dez vezes, permitindo um período de descanso de minutos entre cada teste. </li><li> Registrar o número de moscas por grupo que ultrapassou a marca de 8 cm, comopercentual de moscas total. </li></ul> 5. Aversivo Assay Supressão fototaxia (APS Assay) Originalmente adaptado de Le Bourg e Buecher (2002) 4, este ensaio explora o comportamento positivo em fototáxico voa para treiná-los para associar luz com estímulos aversivos (neste caso, gosto amargo do quinino). Após uma fase de formação / condicionado, as moscas do tipo selvagem será capaz de associar a área iluminada com sabor aversivo e evitá-lo. Voa com capacidades de aprendizagem comprometido vai deixar de fazer essa associação. Além disso, o ensaio APS também pode ser usado para medir a função de memória de curto prazo de moscas 5 submetendo já voa treinados para o mesmo teste 6 horas pós-condicionado para testar sua habilidade em se lembrar da tarefa aprendida. <ol><li> Preparar a Solução de Quinina <ul><li> Dissolver cloridrato de quinino em água destilada para fazer uma solução estoque 0,1 M (1.98g em 50 mL de água destilada). A solução de reserva podem ser mantidos a -20 ° C por até um ano, em pequenas alíquotas </li><li> Prepare uma solução de trabalho de 1 M por diluição da solução estoque em água destilada. </li></ul></li><li> Preparando o T-Maze <ul><li> T-maze consiste na coluna central com o alçapão e duas câmaras independentes, uma câmara de "dark" e uma câmara de "iluminado" (Figura 1). </li><li> Preparação de câmara: tomar dois tubos de centrífuga 15mL de plástico e corte em dois marca mL do fundo foi encerrada no final com um manual de serra. Fit os adaptadores de conector em cada extremidade, e selar a conexão com parafilme. O adaptador no final do tubo serve como abertura de entrada para a fonte de luz gooseneck. Conectar um tubo com a fonte de luz e este tubo será a câmara de "iluminado". Enrole a outro tubo com papel alumínio para servir de câmara de "dark". </li><li> Adicione 180uL de qualquer água destilada ou solução de quinina para filtro de papel e lugar na câmara de luz. </li><li> Montar o T-maze apertando as câmaras iluminado e escuro em cada lado da coluna central, com a porta da armadilha no meio fechado (Figura 1). </li><li> Inserir a fonte de luz para dentro da câmara iluminada. </li></ul></li><li> Treinamento voa para suprimir fototaxia com estímulos aversivos <ul><li> Desapertar a câmara escura do T-maze e transferência de uma única mosca para essa câmara e imediatamente o parafuso do tubo escuro de volta para o labirinto. </li><li> Desligue as luzes na sala e acender a luz vermelha. </li><li> Permitir a voar para aclimatar na câmara escura por 30 segundos e, lentamente, ligar a fonte de luz que ilumina a câmara iluminada. Abrir lentamente a porta da armadilha que separa as duas câmaras. </li><li> Se a mosca anda à câmara iluminada dentro de 10 segundos, considera-se positivamente fototáxico e está pronto para ser treinado para o ensaio. Falha na fototaxia indica problemas no sistema visual e voa com fototaxia negativos precisam ser excluídos do ensaio. </li><li> Aversivos para Supressão fototaxia formação (APS), toque a mosca que demonstrou fototaxia positivo de volta para a câmara escura, feche a porta da armadilha e desligar a luz. Aguarde 30 segundos de aclimatação. Durante esse tempo, colocar papel de filtro com a solução de quinino na câmara iluminada. Abrir lentamente a porta do alçapão e acenda a luz. Permitir a caminhada voar para o quinino câmara revestida iluminado. Após um minuto, toque no voar de volta para a câmara escura e repetir este 9 vezes mais. (Normalmente, as moscas do tipo selvagem evitar a câmara iluminada após 3-5 testes de formação.) </li><li> Imediatamente após o treinamento, cinco ensaios de teste será realizado. Em cada ensaio, permitem 10 segundos após a luz é acesa para a mosca treinados para andar para a câmara iluminada. Incapacidade de caminhar até o frasco iluminado será registrado como "Pass", que é equivalente a "tarefa aprendida através de reforço". A taxa de passagem ao longo de cinco provas consecutivas é gravado e mostrado abaixo na Figura 2 como PC0 (0 condicionado pós hr). </li></ul></li><li> Avaliação de Curto Prazo Função Memória em Flies <ul><li> Após o treinamento inicial e PC0 gravações, cada mosca é colocado de volta em seu frasco original e alimentos mantidos à parte durante seis horas. </li><li> Seis horas após a formação, cada assunto voar para cinco ensaios novamente da mesma maneira como antes, e registrar o número de vezes que o fly evita (passe) ou vai para (não) do frasco iluminado. Esta taxa de aprovação é registrado como PC6 (6 horas pós-condicionado), que é um indicador da memória de curto prazo. </li></ul></li></ol> 6. Interpretação de Dados e Análise Estatística <ol><li> Ensaio Geotaxis negativo <ul><li> Os dados brutos gerados a partir deste ensaio representa o número de moscas cruzar a marca de 8 cm em 10 segundos em cada grupo. Converter este percentual e calcular a taxa de aprovação média de cada grupo mais de 10 sessões. </li><li> Os dados são representados graficamente como uma taxa de aprovação média em cada grupo (genótipo, tratamento, etc) com o erro padrão da média (SEM). </li><li> Diferenças entre os grupospode então ser determinada a ser estatisticamente significativa ou não usando um teste t de Student ou ANOVA. </li></ul></li><li> Aversivo Assay Supressão fototaxia <ul><li> Os dados brutos a partir deste ensaio é representado como o número de vezes que cada mosca evita a câmara iluminada em cinco ensaios sucessivos. A taxa de aprovação é calculado como o percentual de evasão ensaios bem sucedidos ao longo dos ensaios total. Calcular a taxa de aprovação média desta forma para um mínimo de 15 moscas por grupo. </li><li> Os dados são representados graficamente como taxa de aprovação média PC0 (imediatamente após o condicionamento, "aprendizagem" indicador) ou taxa de aprovação média PC6 (6 horas após condicionado; "memória" indicador) com SEM respectivos. </li><li> Índices de aprendizagem e memória são comparados entre os grupos com o tipo selvagem e "geneticamente manipulados benigno" do grupo (como GFP superexpressão moscas) de forma apropriada. </li></ul></li></ol> 7. Resultados representante Nesta experiência de vídeo, estamos avaliando a aprendizagem ea memória e motor déficits em moscas superexpressão humana Tau no sistema nervoso central e comparar o seu desempenho para aqueles de moscas superexpressão GFP. Superexpressão neuronal do Tau humanos em Drosophila tem sido demonstrado que causam vacuolização grave no cérebro 8 e levar a déficits significativos na aprendizagem e funções de memória 9. Conforme mostrado na Figura 2A, 10 dias de idade do sexo masculino ou feminino moscas superexpressão humana Tau têm déficits locomotor significativo em comparação com pareados por idade GFP superexpressão de moscas. Além disso, estas moscas não conseguiu associar a luz com gosto amargo, como mostrado pelo PC0 taxa de aprovação em comparação ao grupo controle, bem como deixar de lembrar essa associação, como mostrado por um declínio na taxa de aprovação PC6 (Figura 2B). Este experimento confirma ainda mais que os modelos de Drosophila pode ser usado para estudar doenças neurodegenerativas humanas e recapitular alguns dos fenótipos comportamentais observadas em seres humanos e mamíferos. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. T-Maze configuração para aversivos Assay Supressão fototaxia. A. A configuração geral experimental para o experimento APSA com a fonte de luz ligado ao "iluminado" tubo falcon, forrada com papel filtro eo tubo "dark" do lado esquerdo (coberta em papel alumínio), separados por um alçapão. B. Durante a fase de treinamento e testes, a mosca é na câmara escura e do alçapão aberto após a luz é acesa na câmara iluminada. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Resultados representativos do geotaxis negativos e experimentar APS usando moscas superexpressão GFP ou Tau com um motorista pan-neuronal. A. No ensaio geotaxis negativos, 10 dias de idade do sexo masculino (coluna azul) ou feminino (coluna vermelha) voa superexpressão GFP apresentou maior atividade de escalada de Tau-superexpressão de moscas. B. feminino 20 dias de idade moscas superexpressão GFP mostrou uma melhor aprendizagem (PC0) e memória (PC6) funções de Tau superexpressão de moscas.

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<li>Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauopathy+in+Drosophila%3A+Neurodegeneration+Without+Neurofibrillary+Tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li>
<li>Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+deficits+upon+TAU+accumulation+in+Drosophila+mushroom+body+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons.</a> Learn Mem. 11, 277-287 (2004).</li>
<li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+Suppression+Involving+Behavioral+Mutants+with+Altered+Nerve+Excitability+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 100, 597-614 (1982).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ambos geotaxis negativos e ensaios APS são robustos testes comportamentais para medir as mudanças na locomotor ou de aprendizagem e capacidades de memória decorrentes da manipulação genética ou ambiental. No entanto, existem algumas desvantagens para esses testes, que esperam uma maior otimização. No ensaio geotaxis negativo, mutações em determinados genes podem tornar disfunções motoras graves em moscas. Nesses casos, as moscas dificilmente pode escalar as paredes em resposta à gravidade sobre a agitação. Ensaios outro comportamento que medir diretamente o movimento pode ser mais apropriado. Estes ensaios incluem corrigir o comportamento reflexo de que as medidas de paralisia e convulsões 10, 11 e comportamento optomotor que registra perda de coordenação dos movimentos. No ensaio de APS, o primeiro obstáculo pode ser moscas aleatoriamente parar na entrada da câmara iluminada, sem avançar. Isso se torna mais um problema se o envelhecimento é uma das condições estudadas, uma vez que voa mais velhos são menos ativas em geral e tendem a parar e descansar por longos períodos de tempo. Neste caso, o pesquisador tem de fornecer estímulos mecânicos para promover o movimento, o que nem sempre é eficaz. Segundo, pode-se argumentar que a falta de ir para os resultados câmara iluminada de uma perda de fototaxia positivo. Raramente é esse o caso, já que trabalhos anteriores mostraram que as moscas voltar para a luz uma vez que a resposta negativa é removida reforçar 4. Terceiro, a duração do contato com o estímulo aversivo pode variar de julgamento para julgamento. Esta variação pode geralmente ser reduzido circundando a parede interna da câmara com papel filtro embebido para evitar moscas de evitar o quinino. Além disso, o pesquisador pode assegurar que cada mosca passar tempo suficiente em contato com o papel de filtro, aumentando a quantidade de tempo gasto na câmara do contrário um minuto. Em resumo, geotaxis negativos e ensaios APS são maneiras simples e rápida de avaliar os déficits comportamentais e quantitativamente indicam locomotor e aprendizagem e habilidades de memória em Drosophila. Estes ensaios são particularmente úteis na modelagem de doenças neurodegenerativas em humanos Drosophila.

<table border="1"><tbody><tr><th> Materiais </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentário </th></tr><tr><td> Frasco de poliestireno </td><td> Vial Capitol, Inc. </td><td> 28Fly </td><td> 28,5 x 95 Vial Poliestireno mm; qualidade do material importante, mal se demasiado escorregadio para moscas a subir. </td></tr><tr><td> Dissecando Stereoscope </td><td> Zeiss </td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2 ramos de guia de luz pescoço de ganso (12V/30W) </td></tr><tr><td> Cloridrato de quinino </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 6119-47-7 </td><td> Dissolver em água destilada. </td></tr><tr><td> Quick Disconnect Conectores </td><td> Nalgene (VWR) </td><td> 62868-021 </td><td> Polietileno de alta densidade </td></tr><tr><td> T-Maze </td><td> Sistemas simples Behavioral </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Single-channel pipeta 200 mL </td><td> Eppendorf </td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

locomotor ensaio, aprendizagem e memória os déficits no drosophila modelos de neurodegeneração

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Avanços nos métodos de genética têm permitido o estudo dos genes envolvidos em doenças neurodegenerativas humanas utilizando Drosophila como um sistema modelo 1. A maioria dessas doenças, incluindo Alzheimer, Parkinson e doença de Huntington são caracterizados por idade-dependente deterioração na aprendizagem e memória funções e coordenação do movimento 2. Aqui usamos os testes comportamentais, incluindo o ensaio geotaxis negativo 3 e do ensaio de supressão phototaxic aversivo (APS ensaio) 4,5, para mostrar que algumas das características de comportamento associado a neurodegeneração humano pode ser recapitulada em moscas. No ensaio geotaxis negativo, a tendência natural de moscas para mover contra a gravidade, quando agitada é utilizado para estudar genes ou condições que possam prejudicar a capacidade locomotora. No ensaio de APS, as funções de aprendizagem e memória são testadas em positivamente fototáxico-moscas treinados para associar luz com sabor amargo aversivo e, portanto, evitar essa tendência de outra forma natural de mover em direção a luz. Testar estes treinados voa 6 horas pós-treino é utilizado para avaliar as funções de memória. Com estes ensaios, a contribuição de qualquer fatores genéticos ou ambientais para a neurodegeneração em desenvolvimento podem ser facilmente estudada em moscas.

Ensaios de comportamento para as funções de medição de locomoção, aprendizado e habilidades de memória em<em&gt; Drosophila</em&gt;.

Locomotor ensaio, Aprendizagem e Memória Os déficits no Drosophila Modelos de neurodegeneração

Avanços nos métodos genéticos permitiram o estudo de genes envolvidos em doenças neurodegenerativas humanas utilizando *Drosophila* como sistema modelo1. A maioria de...

O objetivo geral do procedimento é estudar a aprendizagem e a memória em adultos de Drosophila melanogaster, primeiramente para determinar se as moscas apresentam déficits locomotores. Elas são testadas no ensaio de geotaxia negativa. O comportamento fototáxico positivo é então verificado colocando-se as moscas em um labirinto em forma de T e registrando-se a latência para se moverem em direção à câmara iluminada preferida.Moscas com fototaxia positiva são então condicionadas a associar a câmara iluminada com o gosto amargo da quinina. Por fim, as moscas são testadas quanto à capacidade de associar o estímulo aversivo à câmara iluminada, fornecendo uma medida de aprendizado e memória. Olá, seja bem-vindo ao laboratório X.Hoje vamos demonstrar a você dois ensaios comportamentais comumente utilizados para estudar neurodegeneração em drosófila. Primeiro, mostraremos o ensaio de supressão da fototaxia aversiva, demonstrado por Wil Fredo Sala, um aluno de graduação em nosso laboratório, e por mim mesmo, seguido pelo ensaio de geotaxia negativa, demonstrado por Kaiwan, um aluno de pós-graduação em nosso laboratório. Mantenha as moscas em meio padrão de milho-agar-melaço-levedura a 25 graus Celsius, em ciclo claro-escuro de 12 horas.No dia da oclusão, separe moscas virgens em grupos de 20. As moscas virgens são identificadas pela coloração clara e por uma mancha verde-escura localizada na parte inferior do abdômen. As moscas devem ser transferidas para um tubo novo a cada três dias, e moscas irmãs devem ser utilizadas para minimizar as diferenças decorrentes dos fundos genéticos.Devem ser testados de 10 a 20 grupos por genótipo ou tratamento em um estudo de geotaxia. Para começar, separe as moscas fêmeas e machos em grupos de 10. Essas moscas devem ser testadas separadamente.Como o comportamento é significativamente influenciado pelo gênero, aguarde pelo menos uma hora após a anestesia antes de prosseguir, para garantir que a atividade locomotora não esteja comprometida. Uma vez que as moscas estejam perfeitamente preparadas, alinhe as aberturas de dois tubos vazios de poliestireno unindo-os verticalmente pelo tubo inferior.Meça oito centímetros a partir da base e desenhe um círculo ao redor da circunferência. Agora que o aparelho foi montado, transfira um grupo de 10 moscas para o frasco inferior. Reconecte imediatamente os frascos e aclimatize as moscas por um minuto antes do teste.Após as moscas se acomodarem, bata suavemente para fazê-las descer até o fundo do frasco e meça o número de moscas que sobem acima da marca de oito centímetros em 10 segundos. O número de moscas por grupo que ultrapassou essa marca é registrado como uma porcentagem do total de moscas. Repita este procedimento 10 vezes por grupo, permitindo que as moscas descansem por um minuto entre os ensaios.Seis horas antes de um ensaio PS, separe moscas fêmeas em frascos de poliestireno contendo papel filtro umedecido com água. Este passo garante que as moscas estejam em jejum e mais sensíveis ao sabor desagradável. Neste ensaio, uma solução de quinina serve como estímulo aversivo.Prepare uma solução de trabalho de um micromolar a partir de um estoque de 0,1 molar. O labirinto em T consiste em uma coluna central com uma comporta e duas câmaras laterais, uma câmara escura e uma câmara iluminada. No marco de dois milímetros, use uma serra manual para cortar a extremidade fechada de dois tubos plásticos de centrífuga de 15 mililitros, coloque conectores adaptadores em cada extremidade e selar a conexão com parafina.Envolva um tubo com papel alumínio para servir como câmara escura. Monte os TMA rosqueando as câmaras iluminada e escura em cada lado da coluna central. Com a porta de retenção no centro fechada, finalize a montagem conectando uma fonte de luz diretamente ao adaptador da câmara iluminada. Antes de realizar o ensaio, transfira cada mosca de um grupo de 10 para um tubo cônico de 15 mililitros vazio e tampe levemente para evitar a fuga.Em seguida, desparafuse a câmara escura das ATMs. Transfira uma única mosca para o tubo e imediatamente reinsira-o no labirinto. Desligue as luzes do ambiente e ligue uma lâmpada vermelha.Deixe a mosca aclimatar-se na câmara escura por 30 segundos e, em seguida, ligue lentamente a fonte de luz que ilumina a câmara iluminada. Assim que estiver iluminada, abra a porta de armadilha que separa as duas câmaras. Se a mosca caminhar para a câmara iluminada dentro de 10 segundos, considera-se que ela apresenta fototaxia positiva e está pronta para ser treinada.A incapacidade de responder dessa forma indica um problema no sistema visual e exige a exclusão do ensaio. Uma vez confirmado o fototaxismo positivo, bata levemente no drosófila para fazê-lo retornar à câmara escura, feche a porta de retenção e desligue a luz durante um período de descanso de 32º. Prepare o estímulo aversivo colocando o papel de filtro na câmara iluminada e pipetando um mililitro da solução de quinina sobre o papel de filtro.Certifique-se de que todo o papel-filtro esteja completamente umedecido com o estímulo aversivo. Para iniciar o condicionamento, abra lentamente a porta de armadilha e ligue a luz. Permita que a mosca caminhe para a câmara iluminada com cheiro de quinina.Após um minuto, bata levemente para fazer a mosca retornar à câmara escura. Repita este procedimento nove vezes, perfazendo um total de 10 ensaios de condicionamento. Normalmente, moscas do tipo selvagem evitam a câmara iluminada após três a cinco ensaios de treinamento, imediatamente após o treinamento.Realize cinco ensaios de teste. Se a mosca treinada não caminhar para a luz da câmara dentro de 10 segundos, isso é registrado como um sucesso. A taxa de sucesso em cinco ensaios consecutivos é registrada e designada.PC zero. Após o treinamento e as gravações iniciais de PC zero, cada mosca é devolvida ao seu tubo de alimento numerado original e mantida em repouso por seis horas. Seis horas após o treinamento, realize cinco ensaios adicionais conforme demonstrado anteriormente; essa taxa de sucesso representa o PC seis e é uma medida da memória de curto prazo.No ensaio de geotaxia negativa, o número de moscas que cruza a marca de oito centímetros é convertido em porcentagem e apresentado como a taxa de sucesso na subida. Ao longo de 10 ensaios, como visto aqui à direita, moscas machos ou fêmeas de 10 dias de idade que superexpressam a proteína humana tau apresentam déficits locomotores significativos em comparação com moscas superexpressando GFP de mesma idade, mostradas à esquerda.O desempenho no ensaio de supressão da fototaxia aversiva é representado pela taxa média de acertos ou pela porcentagem de tentativas de evitação bem-sucedidas. Em todas as tentativas, as moscas superexpressando tau, mostradas aqui à direita, demonstram menor capacidade de associar a luz ao gosto amargo quando comparadas ao grupo controle à esquerda, tanto imediatamente após o treinamento quanto ao serem testadas seis horas depois. Após este procedimento, podem ser coletadas amostras para análise imunohistoquímica, a fim de responder perguntas adicionais sobre diferenças morfológicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar aprendizado e memória em moscas amigos.E lembre-se, é tudo sobre você.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O método para medir adulto Drosophila memória associativa é descrito. O ensaio é baseado na capacidade de tempo real para associar um odor apresentado com um reforçador negativa (choque eléctrico) e depois recupera esta informação numa altura posterior, permitindo que a memória a ser medido.

Drosophila Adulto Olfativo Choque Aprendizagem

Aqui nós descrevemos dois ensaios que foram estabelecidos para estudar neurodegeneração idade-dependente de dopaminérgicos (DA)...

Avaliando fenótipos Neurodegenerativas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios dopaminérgicos subindo Ensaios e toda Imunocoloração Cérebro

Apresentamos um ensaio de geotaxia negativa otimizado, barato e confiável em Drosophila melanogaster como modelo para doenças neurodegenerativas. Sendo mais sensível a defeitos locomotores leves, este ensaio ajudará a rastrear possíveis interações genéticas e alvos de drogas.

Análise Quantitativa de Defeitos de escalada em um modelo de Drosophila de doenças neurodegenerativas

Drosophila é amplamente usado como um sistema modelo para estudar a neurodegeneração. Este protocolo descreve um método pelo qual a degeneração, como determinado pela formação de vacúolo no cérebro, podem ser quantificados. Ela também minimiza os efeitos devido ao procedimento experimental por meio de processamento e controlo de moscas e de seccionamento experimentais como uma amostra.

Mass Histologia para quantificar neurodegeneração em<em&gt; Drosophila</em

Este protocolo descreve um ensaio de aprendizagem e memória de Drosophila chamado condicionamento de namoro. Este ensaio clássico baseia-se numa redução do comportamento do namoro masculino após a rejeição sexual por uma mulher pré-administrada não receptiva. Essa forma natural de plasticidade comportamental pode ser usada para testar aprendizado, memória de curto prazo e memória de longo prazo.

Drosophila Courtship Acondicionamento Como Medida de Aprendizagem e Memória

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Este passo a passo protocolo analisa o comportamento de geotaxis negativo de drosófila usando um sistema automatizado de vários cilindro que hospeda centenas de moscas e sincroniza a sua acção por um motor elétrico. Após a sincronização, comportamento de voar geotaxis negativo é analisado, digitalmente gravada e analisados utilizando o software RflyDetection auto-concebidos.

Um ensaio automatizado rápida iterativo Geotaxis negativo para analisar o comportamento de adultos de escalada em um modelo de drosófila de neurodegeneração

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

O objetivo deste procedimento é dissecar o tecido do músculo longitudinal dorsal (DLM) para avaliar a integridade estrutural das junções neuromusculares DLM (NMJs) em modelos de doenças neurodegenerativas utilizando Drosophila melanogaster.

Visualização da Degeneração Sináptica em Drosophila Adulta em Associação com Neurodegeneração

O presente protocolo avalia a atividade locomotora de Drosophila rastreando e analisando o movimento de moscas em uma arena artesanal usando software de código aberto Fiji, compatível com plugins para segmentar pixels de cada quadro com base em gravação de vídeo de alta definição para calcular parâmetros de velocidade, distância, etc.

Uma técnica simples para avaliar a atividade locomotora em Drosophila

O protocolo apresenta um método de alto rendimento e custo-benefício para avaliar a neurotoxicidade na mosca-da-fruta por meio da quantificação da disfunção locomotora como alternativa aos modelos tradicionais de mamíferos. Tem como objetivo avaliar os efeitos neurotóxicos de compostos farmacêuticos, agentes ambientais ou modificações genéticas usando um modelo sensível, reprodutível e eticamente favorável.

Análise comportamental da disfunção locomotora em Drosophila melanogaster como leitura de neurotoxicidade

Aprenda ensaios comportamentais para avaliar funções locomotoras, aprendizado e memória em Drosophila melanogaster. Este método utiliza geotaxia negativa e fototaxia aversiva para estudar neurodegeneração.

Locomotor ensaio, Aprendizagem e Memória Os déficits no Drosophila Modelos de neurodegeneração

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