Locomotor ensaio, Aprendizagem e Memória Os déficits no Drosophila Modelos de neurodegeneração
11 de março de 2011
Ensaios de comportamento para as funções de medição de locomoção, aprendizado e habilidades de memória em Drosophila.
O objetivo geral do procedimento é estudar a aprendizagem e a memória em adultos de Drosophila melanogaster, primeiramente para determinar se as moscas apresentam déficits locomotores. Elas são testadas no ensaio de geotaxia negativa. O comportamento fototáxico positivo é então verificado colocando-se as moscas em um labirinto em forma de T e registrando-se a latência para se moverem em direção à câmara iluminada preferida.
Moscas com fototaxia positiva são então condicionadas a associar a câmara iluminada com o gosto amargo da quinina. Por fim, as moscas são testadas quanto à capacidade de associar o estímulo aversivo à câmara iluminada, fornecendo uma medida de aprendizado e memória. Olá, seja bem-vindo ao laboratório X.
Hoje vamos demonstrar a você dois ensaios comportamentais comumente utilizados para estudar neurodegeneração em drosófila. Primeiro, mostraremos o ensaio de supressão da fototaxia aversiva, demonstrado por Wil Fredo Sala, um aluno de graduação em nosso laboratório, e por mim mesmo, seguido pelo ensaio de geotaxia negativa, demonstrado por Kaiwan, um aluno de pós-graduação em nosso laboratório. Mantenha as moscas em meio padrão de milho-agar-melaço-levedura a 25 graus Celsius, em ciclo claro-escuro de 12 horas.
No dia da oclusão, separe moscas virgens em grupos de 20. As moscas virgens são identificadas pela coloração clara e por uma mancha verde-escura localizada na parte inferior do abdômen. As moscas devem ser transferidas para um tubo novo a cada três dias, e moscas irmãs devem ser utilizadas para minimizar as diferenças decorrentes dos fundos genéticos.
Devem ser testados de 10 a 20 grupos por genótipo ou tratamento em um estudo de geotaxia. Para começar, separe as moscas fêmeas e machos em grupos de 10. Essas moscas devem ser testadas separadamente.
Como o comportamento é significativamente influenciado pelo gênero, aguarde pelo menos uma hora após a anestesia antes de prosseguir, para garantir que a atividade locomotora não esteja comprometida. Uma vez que as moscas estejam perfeitamente preparadas, alinhe as aberturas de dois tubos vazios de poliestireno unindo-os verticalmente pelo tubo inferior.
Meça oito centímetros a partir da base e desenhe um círculo ao redor da circunferência. Agora que o aparelho foi montado, transfira um grupo de 10 moscas para o frasco inferior. Reconecte imediatamente os frascos e aclimatize as moscas por um minuto antes do teste.
Após as moscas se acomodarem, bata suavemente para fazê-las descer até o fundo do frasco e meça o número de moscas que sobem acima da marca de oito centímetros em 10 segundos. O número de moscas por grupo que ultrapassou essa marca é registrado como uma porcentagem do total de moscas. Repita este procedimento 10 vezes por grupo, permitindo que as moscas descansem por um minuto entre os ensaios.
Seis horas antes de um ensaio PS, separe moscas fêmeas em frascos de poliestireno contendo papel filtro umedecido com água. Este passo garante que as moscas estejam em jejum e mais sensíveis ao sabor desagradável. Neste ensaio, uma solução de quinina serve como estímulo aversivo.
Prepare uma solução de trabalho de um micromolar a partir de um estoque de 0,1 molar. O labirinto em T consiste em uma coluna central com uma comporta e duas câmaras laterais, uma câmara escura e uma câmara iluminada. No marco de dois milímetros, use uma serra manual para cortar a extremidade fechada de dois tubos plásticos de centrífuga de 15 mililitros, coloque conectores adaptadores em cada extremidade e selar a conexão com parafina.
Envolva um tubo com papel alumínio para servir como câmara escura. Monte os TMA rosqueando as câmaras iluminada e escura em cada lado da coluna central. Com a porta de retenção no centro fechada, finalize a montagem conectando uma fonte de luz diretamente ao adaptador da câmara iluminada. Antes de realizar o ensaio, transfira cada mosca de um grupo de 10 para um tubo cônico de 15 mililitros vazio e tampe levemente para evitar a fuga.
Em seguida, desparafuse a câmara escura das ATMs. Transfira uma única mosca para o tubo e imediatamente reinsira-o no labirinto. Desligue as luzes do ambiente e ligue uma lâmpada vermelha.
Deixe a mosca aclimatar-se na câmara escura por 30 segundos e, em seguida, ligue lentamente a fonte de luz que ilumina a câmara iluminada. Assim que estiver iluminada, abra a porta de armadilha que separa as duas câmaras. Se a mosca caminhar para a câmara iluminada dentro de 10 segundos, considera-se que ela apresenta fototaxia positiva e está pronta para ser treinada.
A incapacidade de responder dessa forma indica um problema no sistema visual e exige a exclusão do ensaio. Uma vez confirmado o fototaxismo positivo, bata levemente no drosófila para fazê-lo retornar à câmara escura, feche a porta de retenção e desligue a luz durante um período de descanso de 32º. Prepare o estímulo aversivo colocando o papel de filtro na câmara iluminada e pipetando um mililitro da solução de quinina sobre o papel de filtro.
Certifique-se de que todo o papel-filtro esteja completamente umedecido com o estímulo aversivo. Para iniciar o condicionamento, abra lentamente a porta de armadilha e ligue a luz. Permita que a mosca caminhe para a câmara iluminada com cheiro de quinina.
Após um minuto, bata levemente para fazer a mosca retornar à câmara escura. Repita este procedimento nove vezes, perfazendo um total de 10 ensaios de condicionamento. Normalmente, moscas do tipo selvagem evitam a câmara iluminada após três a cinco ensaios de treinamento, imediatamente após o treinamento.
Realize cinco ensaios de teste. Se a mosca treinada não caminhar para a luz da câmara dentro de 10 segundos, isso é registrado como um sucesso. A taxa de sucesso em cinco ensaios consecutivos é registrada e designada.
PC zero. Após o treinamento e as gravações iniciais de PC zero, cada mosca é devolvida ao seu tubo de alimento numerado original e mantida em repouso por seis horas. Seis horas após o treinamento, realize cinco ensaios adicionais conforme demonstrado anteriormente; essa taxa de sucesso representa o PC seis e é uma medida da memória de curto prazo.
No ensaio de geotaxia negativa, o número de moscas que cruza a marca de oito centímetros é convertido em porcentagem e apresentado como a taxa de sucesso na subida. Ao longo de 10 ensaios, como visto aqui à direita, moscas machos ou fêmeas de 10 dias de idade que superexpressam a proteína humana tau apresentam déficits locomotores significativos em comparação com moscas superexpressando GFP de mesma idade, mostradas à esquerda.
O desempenho no ensaio de supressão da fototaxia aversiva é representado pela taxa média de acertos ou pela porcentagem de tentativas de evitação bem-sucedidas. Em todas as tentativas, as moscas superexpressando tau, mostradas aqui à direita, demonstram menor capacidade de associar a luz ao gosto amargo quando comparadas ao grupo controle à esquerda, tanto imediatamente após o treinamento quanto ao serem testadas seis horas depois. Após este procedimento, podem ser coletadas amostras para análise imunohistoquímica, a fim de responder perguntas adicionais sobre diferenças morfológicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar aprendizado e memória em moscas amigos.
E lembre-se, é tudo sobre você.
Visão Geral
Este artigo apresenta ensaios comportamentais para avaliar funções locomotoras, aprendizado e memória em Drosophila. Os procedimentos incluem ensaios de geotaxia negativa e supressão de fototaxia aversiva para avaliar neurodegeneração.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Comportamental
- Genética
Antecedentes
- Drosophila melanogaster é um organismo modelo para o estudo da neurodegeneração.
- Ensaios comportamentais ajudam a compreender déficits locomotores e funções cognitivas.
- Aprendizado e memória podem ser avaliados por meio de respostas condicionadas.
- Diferenças de gênero podem influenciar os resultados comportamentais nos ensaios.
Objetivo do Estudo
- Avaliar funções locomotoras em Drosophila.
- Avaliar as capacidades de aprendizado e memória por meio de testes comportamentais.
- Investigar os efeitos de modificações genéticas no comportamento.
Métodos Utilizados
- Ensaio de geotaxia negativa para medir a capacidade de escalada.
- Ensaio de supressão de fototaxia aversiva para avaliar aprendizado e memória.
- Condicionamento de moscas para associar luz a um estímulo aversivo.
- Gravação das respostas comportamentais e análise estatística dos dados.
Resultados Principais
- Moscas com modificações genéticas exibiram déficits locomotores significativos.
- Aprendizado e memória foram avaliados por meio das taxas de aprovação em ensaios de condicionamento.
- Diferenças comportamentais foram observadas entre moscas machos e fêmeas.
- Os resultados indicam a eficácia dos ensaios no estudo da neurodegeneração.
Conclusões
- Os ensaios fornecem informações valiosas sobre as funções locomotoras e cognitivas em Drosophila.
- Os achados contribuem para a compreensão da base genética das doenças neurodegenerativas.
- Estudos futuros podem expandir esses métodos para explorar outros aspectos comportamentais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A fenotipagem comportamental em Drosophila fornece um sistema escalável e geneticamente manipulável para a validação inicial de alvos na pesquisa de neurodegeneração. Ao quantificar déficits locomotores, de aprendizado e de memória, esses ensaios permitem a redução de riscos mecanicistas em hipóteses terapêuticas antes do investimento em modelos mamíferos. A abordagem reforça a confiança preditiva na seleção de alvos e na triagem de portfólios para programas de descoberta de fármacos para o sistema nervoso central.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas ao relacionar fatores genéticos ou ambientais a fenótipos locomotores e cognitivos quantificáveis.
- Valor Operacional: Permitir triagem de alto rendimento de modificadores genéticos utilizando leituras comportamentais padronizadas.
- Valor Estratégico: Apoiar a redução de riscos de alvos por meio de ensaios quantitativos e reprodutíveis que se correlacionam com a sintomatologia humana de neurodegeneração.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Preparar modelos validados de Drosophila para triagem de compostos, estabelecendo déficits comportamentais basais em modelos de neurodegeneração.
- Valor Operacional: Fornecer saídas padronizadas e quantitativas (taxa de sucesso na escalada, taxa de sucesso na evitação) adequadas para automação de ensaios e reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Facilitar a preparação do ensaio para campanhas de identificação de compostos ativos e otimização de fármacos direcionadas a desfechos cognitivos e motores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Permitir a modelagem de sistemas relevantes para doenças em que genes humanos associados à neurodegeneração produzem fenótipos comportamentais conservados em moscas.
- Valor Operacional: Proporcionar continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, utilizando ensaios comportamentais ortogonais que medem desfechos funcionais.
- Valor Estratégico: Apoiar decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo leituras precoces de eficácia em aprendizado, memória e função motora.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Os ensaios funcionam como ferramentas na fase de descoberta para testes de hipóteses e triagem fenotípica, auxiliando nos fluxos de trabalho de identificação de compostos líderes e validação pré-clínica em programas de neurodegeneração.
- Biologia da Descoberta: Apoie a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao mensurar déficits locomotores e cognitivos em modelos genéticos de neurodegeneração.
- Triagem: Forneça sistemas biológicos prontos para ensaio com respostas comportamentais quantitativas padronizadas para avaliação de compostos.
- Análises: Gere medidas de taxa de aprovação (subida por geotaxia negativa, evitamento APS) que permitem comparação estatística entre condições e genótipos.
- Pesquisa Translacional: Conecte a descoberta à continuidade pré-clínica por meio de fenótipos comportamentais conservados que modelam sintomas humanos de neurodegeneração.
- Reutilização Empresarial: Estabeleça uma plataforma reutilizável de fenotipagem comportamental aplicável em múltiplas campanhas de validação de alvos e triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da ligação mecanicista entre genes e fenótipos locomotores e cognitivos.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade das leituras comportamentais entre laboratórios e lotes experimentais.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar/não avançar melhoradas mediante desvio funcional precoce, reduzindo falhas em estágios tardios do desenvolvimento do SNC.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de alvos com base em déficits comportamentais quantitativos em modelos de doenças validados.
Considerações sobre a Implementação
- Experiência no manejo de Drosophila, cruzamentos genéticos e execução de ensaios comportamentais.
- Aparelhagem para geotaxia negativa (tubos verticais, guias de marcação) e construção de labirinto em T para o ensaio APS.
- Padronização das condições ambientais (25°C, ciclo claro/escuro de 12 h, protocolos de privação alimentar) e testes específicos por sexo.
- Considerações de adaptação para diferentes modelos de neurodegeneração (por exemplo, tau, alfa-sinucleína, huntingtina) e estressores ambientais.
- As limitações práticas incluem a variabilidade comportamental devido ao manejo, idade e background genético, exigindo grupos grandes e controles entre irmãos.
