Name: Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprenda a visualizar a translocação da PKC em células vivas usando microscopia confocal de varredura a laser. Este método permite estudar a dinâmica da PKC em neurônios sensoriais de Aplysia e células Sf9 em tempo real.

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Este trabalho foi financiado pelo Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Grant para Wayne S. Sossin. Carole A. Farah é o destinatário de uma bolsa de pós-doutorado do Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e um Conrad Harrington comunhão. Os autores gostariam de agradecer Joanna Bougie, Margaret Hastings e Margaret Labban para ajudar com a gravação de vídeo e Piscina Madeline Richmond para ajudar com a visão geral gráfica.

1. Preparação e manutenção de culturas monocamada de células Sf9 <ol><li> Sf9 cultura de células e manutenção é realizada em uma capa de cultura de tecidos. </li><li> Sf9 células são derivadas de células de ovário de Spodoptera frugiperda (Sf21 células) e podem ser comprados como células congeladas em meio Grace da Invitrogen. </li><li> Lugar de 8 mL de meio de insetos de Grace, completados, a que 30% de soro fetal bovino (FBS) foi adicionada em um balão de 75 centímetros cultura 2 celulares com o pescoço inclinado. (1X) </li><li> Descongelar o tubo congelado de células Sf9 rapidamente em banho-maria a 37 ° C, movendo o tubo de ida e volta (cerca de 1-2 minutos). </li><li> Transferência de células Sf9 para a 75 centímetros garrafa de cultura celular e duas placas de rocha suavemente com a mão para distribuir uniformemente as células. </li><li> Incubar de 1-2 horas a 27 ° C até que as células têm em anexo. </li><li> Remova o meio de idade e substituir com 10 mL de meio de insetos freshGrace com 30% FBS. </li><li> Incubar a 27 ° C até que as células são confluentes. </li><li> Para manter as culturas em monocamada, remova o meio de idade do frasco confluentes de células Sf9 e adicionar 5 mL de meio de insetos de Grace com 10% de FBS. </li><li> Toque levemente no lado do frasco várias vezes para retirar as células Sf9. </li><li> Usando uma pipeta 10 mL e uma pipeta, pipetar os meios de comunicação para cima e para baixo uma vez gentilmente, pulverização parede frasco enquanto pipetagem para baixo. Transferência das células para um tubo estéril 15 ml poliestireno. </li><li> Adicione 2 mL da suspensão de células Sf9 a 8 mL de meio de insetos de Grace com 10% FBS (1:5 diluição para manter o crescimento fase log) em novos 75 centímetros garrafa de cultura celular e duas placas de rocha suavemente com a mão. </li><li> Incubar a 27 ° C até que as células são confluentes. </li></ol> 2. Expressão de PKCs fluorescente Tagged em Células Sf9 <ol><li> Para a imagem live-experiência, cultura de células Sf9 em 35 milímetros de vidro de fundo Mattek cultura disheswith uma superfície de vidro de 14 mm e uma espessura de lamela 0,16-0,19 mm. </li><li> PKCs marcadas com proteínas fluorescentes são expressos em células Sf9 usando Cellfectin II recomendação de reagentes de transfecção seguintes do fabricante, com as modificações detalhadas abaixo. </li><li> Dia 1: Antes de revestimento das células, tratar cada prato Mattek com meio de insetos de Grace com FBS 10% para pelo menos 30 minutos. </li><li> Contagem de células Sf9 a partir do passo 11 (acima), utilizando um hemocitômetro. </li><li> Placa de 0,05 x 10 6 células em cada lamela de vidro Mattek em um volume total de 150 mL. Permitir que as células para anexar por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2 mL de Grace suplementado com 10% de SFB a cada mL prato 1 de cada vez lentamente para evitar separar as células. </li><li> Incubar a 27 ° C durante a noite. </li><li> Deste ponto em diante, use a recomendação do fabricante para a transfecção de células Sf9 com DNA plasmidial. </li><li> Dia 2: transfecção Sf9 células com PKCs fluorescente etiquetado usando Cellfectin reagente transfecção II. Temos muitas vezes co-expressas neste sistema PKCs marcados com Proteína Verde Fluorescente melhorada (eGFP) e proteína monomérica Vermelho Fluorescente (MRFP) (detalhes para a construção do plasmídeo foram previamente descritos 2,5). Expressão de uma proteína fluorescente de uma vez produz cerca de 70-80% expressar células 72 horas pós-transfecção. Co-expressão de duas proteínas fluorescentes diminui a eficiência de transfecção para cerca de 30% de co-células que expressam. Quando co-expressando eGFP marcadas PKC e MRFP marcadas PKC, use 2x mais DNA do plasmídeo para a proteína MRFP-marcadas para a expressão da proteína ideal. </li><li> Executar ao vivo de imagens de 48-72 horas pós-transfecção (para a expressão da proteína ideal, esperar 72 horas). </li></ol> 3. Expressão de PKCs fluorescente nos neurônios Tagged Aplysia Sensorial <ol><li> Preparação de culturas de células Aplysia neuronal tem sido descrita em um artigo de vídeo por Zhao e 4 colegas. </li><li> PKCs marcadas com proteínas fluorescentes são expressos em neurônios sensoriais Aplysia usando procedimento de microinjeção detalhadas abaixo. </li><li> Prepare uma solução estoque de 1% Verde Fast (FCF) em água destilada, filtro usando uma seringa e uma seringa de 28 milímetros filtro (0,20 m). Alíquotas e armazenar a -20 ° C. </li><li> Microinjeção dos neurônios sensoriais pode ser realizada no dia 1 ou 2 dias depois de isolar os neurônios mas nós achamos que esperar dois dias permite melhor adesão celular para a lamela. </li><li> No dia 2 após o isolamento dos neurônios sensoriais, descongelar uma alíquota do Verde Fast e filtrá-la novamente usando uma seringa e uma seringa de 28 milímetros filtro (0,20 m). </li><li> Prepare uma solução de DNA plasmidial em água destilada contendo 0,5% Verde Fast. Concentrações de DNA plasmídeo tão alto quanto 0,4 g / mL pode ser usado, mas não é recomendável ir acima desses valores. </li><li> Filtrar o DNA plasmidial / solução Verde rápida usando uma seringa de 1 mL e um filtro de seringa de 4 milímetros (0,20 m). </li><li> Centrifugar o DNA plasmidial / solução Verde rápida a 16.110 xg por 15 minutos, utilizando um microfonerocentrifuge. </li><li> Prepare eletrodos afiada para microinjeção de neurônios utilizando um extrator de microeletrodos (Sutter Flaming / Brown Micropipeta Puller, modelo P-97). Utilizando um filamento de caixa, puxe microeletrodos de vidro com 1 mm de diâmetro externo, 0,75 mm de diâmetro interno e 100 mm de comprimento com parede fina capilares de vidro com um filamento dentro (World Precision Instruments TW100F-4). Para mais informações sobre puxando eletrodos microinjeção consulte cookbook eletrodo Sutter. </li><li> Preencha cada eletrodo com 2 mL de DNA plasmídeo / solução rápida usando Verde microloader pipeta ponta (eppendorf CA32950-050). </li><li> Transferir o vidro Mattek placa de cultura de fundo contendo culturas Aplysia neuronal para a estação de microinjeção. </li><li> A estação de microinjeção consiste no seguinte: um home-made estágio copo grande para manter os pratos da cultura em uma mesa de isolamento de vibração (Kinetic Sistemas de estação de trabalho de isolamento de vibrações), um aparelho de som com escopo de iluminação halógena externo, um micromanipulador (Sutter Huxley micromanipulador tipo de parede que permite o posicionamento tanto grosseiro e ultra-fino nos três eixos), um suporte de microeletrodos conectado a uma bomba pneumática (Instrumentos de Precisão Mundial PV820 Pneumatic Pico-Bomba). A entrada de pressão da bomba pneumática é conectado a um tanque de nitrogênio comprimido. </li><li> Inserir um microeletrodo no suporte de microeletrodos. </li><li> Visualização sob um estereomicroscópio, introduza a ponta da micropipeta no núcleo da célula. </li><li> Entregar pulsos de pressão curto de nitrogênio (10 a 100 ms de duração, 20 lb / pol 2) até o núcleo torna-se uniformely verde. </li><li> Incubar as células durante 4 horas à temperatura ambiente e manter a 4 ° C até o uso. Para a translocação da PKC ideal, tocar ao vivo de imagens experimento 20-24 horas após a injecção. </li></ol> 4. Visualização da translocação da PKC em células Sf9 Vivendo e em neurônios sensoriais Aplysia <ol><li> Para geração de imagens, nós usamos um microscópio invertido Zeiss LSM510 confocal com um 200 Axiovert. </li><li> Protocolo de imagens é a mesma para células Sf9 e para os neurônios sensoriais Aplysia, exceto para o seguinte: Sf9 células são gravadas com uma objetiva de imersão X63 óleo enquanto neurônios sensoriais Aplysia são gravadas com um objetivo de imersão em óleo x40. Sf9 células são gravadas em uma câmara com temperatura controlada mantida a 26-27 º C enquanto que os neurônios sensoriais Aplysia são gravadas em temperatura ambiente mantida em torno de 18-20 º C. </li><li> Nós usamos um laser de argônio 30 mW (excitação em 488nm), com saída do laser de 50% a PKC imagem marcada com eGFP proteína e um laser HeNe (excitação em 543nm) para PKC imagem marcada com a proteína MRFP. A Argon e linhas de laser HeNe são atenuadas a 4% e de saída da transmissão de 50%, respectivamente, antes da imagem e do pinhole é ajustado para um. </li><li> É importante ter a placa de cultura estabilizado no palco de imagem e para evitar o movimento ou vibração. </li><li> Retire 1 mL de meios de cultura do prato com cuidado usando uma pipeta 10 mL deixando um volume de mL total no prato. </li><li> Tire fotos na seção intermediária das células onde o núcleo pode ser visto. </li><li> Configurar uma série temporal de 10-20 imagens confocal de tirar uma foto a cada 30 segundos. </li><li> Iniciar a série de tempo. </li><li> Depois de 2 fotos são tiradas (após o ponto de tempo de 30 segundos), adicione 1 mL da droga (2X concentração) suavemente gota a gota, em cima das células utilizando uma pipeta P1000. A droga é adicionada continuamente por cerca de 30 segundos. </li><li> Algumas drogas induzem uma rápida translocação, que pode ser visível imediatamente após o tratamento medicamentoso (no ponto de tempo de 60 segundos), enquanto outros induzem uma translocação lenta que só é ideal 5-10 minutos pós-tratamento (Filme 1 e Filme 2). </li><li> Se o medicamento precisa ser lavado, use 2 x 10 mL pipetas para fazer a lavagem, pipetagem do tampão de lavagem suavemente com uma pipeta de um lado do prato e pipetagem até a mídia do outro lado. </li><li> Se a lavagem tem sido eficaz e se o efeito da droga é reversível, PKC reverte para o citosol dentro de 30-60 segundos. </li><li> Salve o filme como um arquivo de LSM. </li><li> Use software NIH Image J para abrir os arquivos LSM e quantificar as imagens pré e pós tratamento medicamentoso. Quantificação tem sido descrito em outros lugares 1. </li></ol>

<ol><li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &amp, Klein, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2%2B-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li>
<li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos uma técnica para translocação imagem de PKCs fluorescente etiquetado em tempo real em Sf9 células e nos neurônios sensoriais Aplysia. Sf9 células fornecer um sistema simples de translocação imagem PKC desde cultura e transfecting deles é bem simples. Em contraste, a microinjeção de neurônios sensoriais Aplysia leva algum tempo para dominar, até alguns meses. Dificuldades relacionados a essa técnica incluem o entupimento do eletrodo. Filtragem da solução de injeção e centrifugação, geral...

<table><tbody><tr><td>Células Sf9 congeladas</td><td>&lt;em&gt;Spodoptera frugiperda&lt;/em&gt; células ovarianas</td><td>Invitrogen</td><td>B825-01</td><td></td></tr><tr><td>Meio para Insetos Grace&amp;rsquo;s, Suplementado (1X), líquido</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11605-094</td><td>Utilizado para cultivar células Sf9</td></tr><tr><td>Frasco cônico para cultivo celular, 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, Corning</td><td>Ferramenta</td><td>Corning</td><td>430720</td><td>Utilizado para cultivar células Sf9</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Reagente</td><td>CanSera</td><td>CS-C08-500</td><td>Suplementar o meio de Grace&amp;rsquo;s com SBF antes do uso</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>Utilizada para filtrar a solução de verde rápido</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>Utilizada para filtrar solução de DNA plasmidial / verde rápido</td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Ferramenta</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>Utilizado para filtrar a solução de verde rápido</td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Ferramenta</td><td>Corning</td><td>431212</td><td>Utilizado para filtrar solução de DNA plasmidial / verde rápido</td></tr><tr><td>Placa de fundo de vidro</td><td>Ferramenta</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Utilizada para cultivar células Sf9 antes da transfeção e da imagem</td></tr><tr><td>Reagente Cellfectin II</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Utilizado para expressar PKCs marcadas com fluorescência em células Sf9</td></tr><tr><td>Verde rápido FCF</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>Utilizado para visualizar a microinjeção de solução de DNA plasmidial em neurônios sensoriais de &lt;em&gt;Aplysia&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Capilares de vidro de parede fina</td><td>Ferramenta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td>Utilizados para fabricar micr&amp;#8211;eletrodos para microinjeção</td></tr><tr><td>Ponta de pipeta Microloader</td><td>Ferramenta</td><td>Eppendorf</td><td>CA32950-050</td><td>Autoclavar antes de usar para preencher os micr&amp;#8211;eletrodos para microinjeção</td></tr><tr><td>Bomba Pneumática PicoPump PV820</td><td>Ferramenta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td>Parte da estação de microinjeção</td></tr><tr><td>Suporte para micr&amp;#8211;eletrodo</td><td>Ferramenta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH6S</td><td>Utilizado para segurar o micr&amp;#8211;eletrodo</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Ferramenta</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td>Utilizado para posicionar o micr&amp;#8211;eletrodo nos três eixos</td></tr></tbody></table>

live-imagem de translocação da pkc em células sf9 e em neurônios sensoriais aplysia

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Proteína quinase Cs (PKCs) são serina treonina quinases que desempenham um papel central na regulação de uma ampla variedade de processos celulares como crescimento celular e aprendizagem e memória. Há quatro famílias conhecidas de isoformas da PKC em vertebrados: PKCs clássica (α, βI, βII e γ), tipo romance que PKCs (ε e η), novo tipo II PKCs (δ e θ), e PKCs atípicos (ζ e ι ). O PKCs clássica são ativadas por Ca 2 + e diacylclycerol (DAG), enquanto o PKCs romance são ativadas por DAG, mas são Ca 2 +-independente. O PKCs atípicos são ativadas por Ca 2 + nem nem DAG. Em Aplysia californica, o nosso sistema modelo para estudar a formação da memória, há três isoformas específicas do sistema nervoso PKC um de cada classe principal, ou seja, o convencional PKC Apl I, o novo tipo I PKC Apl II ea PKC atípica Apl III. PKCs são lipídios cinases ativadas e, portanto, a ativação de PKCs clássica e romance em resposta a sinais extracelulares tem sido freqüentemente correlacionada com a translocação da PKC do citoplasma para a membrana plasmática. Portanto, visualizando translocação da PKC em tempo real em células vivas tornou-se uma ferramenta valiosa para a elucidação das vias de transdução de sinal que levam à ativação da PKC. Por exemplo, esta técnica permitiu-nos estabelecer que diferentes isoformas da PKC translocate sob diferentes condições de mediar tipos distintos de plasticidade sináptica e que a serotonina ativação (5HT) da PKC Apl II requer a produção de ambos os DAG e ácido fosfatídico (PA) para translocação 02/01. Importante, a capacidade de visualizar o mesmo neurônio repetidamente nos tem permitido, por exemplo, para medir a dessensibilização da resposta PKC no requintado detalhe 3. Neste vídeo, demonstramos cada etapa de preparação de culturas de células Sf9, culturas de neurônios sensoriais Aplysia foram descritas em outro artigo de vídeo 4, expressando PKCs fluorescente etiquetado em Sf9 células e nos neurônios sensoriais Aplysia e live-imaging de translocação da PKC em resposta a ativadores diferentes, utilizando microscopia de varredura a laser.

Neste vídeo, demonstramos a visualização da translocação da PKC em células vivas usando PKCs fluorescente etiquetado.

Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia

As proteínas quinases C (PKCs) são serina-treonina quinases que desempenham um papel central na regulação de uma ampla variedade de processos celulares, tais como o crescimento celular e...

O objetivo deste procedimento é visualizar a translocação de PKC marcada com fluorescência em células vivas. Isso é realizado primeiramente preparando culturas de células SF nine ou culturas de neurônios sensoriais de um Plegia California. O segundo passo é expressar PKCs marcadas com fluorescência nas células.O passo final é obter imagens da translocação da PKC em resposta a diferentes ativadores utilizando microscopia a laser. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram a regulação diferencial das diferentes isoformas da PKC por mensageiros secundários, como o diacilglicerol, por meio do registro em tempo real da translocação da PKC em células vivas. Olá, meu nome é Carol Ferra.Sou pesquisador associado no laboratório do Dr. Wayne Sawn, no Instituto Neurológico de Montreal. Hoje demonstrarei a imagem em tempo real da translocação da PKC em neurônios sensoriais de Aplysia. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da plasticidade sináptica, como a forma pela qual as diferentes isoformas da PKC são ativadas durante a formação da memória.Para preparar culturas monocamada de células SF nine em uma cabine de cultura de tecidos, adicione oito mililitros do meio para insetos de Grace com 30% de soro bovino fetal a um frasco de cultura celular de 75 centímetros quadrados e, em seguida, descongele rapidamente o tubo congelado de células SF nine em banho-maria a 37 graus Celsius, movendo o tubo para frente e para trás por cerca de um a dois minutos. Em seguida, transfira as células SF nine para o frasco de cultura celular e agite suavemente o frasco com a mão para distribuir as células uniformemente. Incube as células por uma a duas horas a 27 graus Celsius até que tenham se aderido.Em seguida, remova o meio antigo do frasco e substitua por outros 10 mililitros de meio inseto Grace fresco com 30% de FBS e incube as células a 27 graus Celsius até que atinjam confluência. Para manter culturas em monocamada, remova o meio antigo do frasco confluente das células SF9 e adicione cinco mililitros de meio inseto Grace com 10% de FBS; bata levemente na lateral do frasco várias vezes para destacar as células SF9. Em seguida, utilizando uma pipeta de 10 mililitros, pipete suavemente o meio para cima e para baixo.Uma vez borrifado na parede do frasco durante a pipetagem descendente, transfira as células para um tubo estéril de poliestireno de 15 mililitros. Adicione dois mililitros de suspensão de células SF9 a oito mililitros de meio para insetos de Grace com 10% de SBF no novo frasco de cultura celular de 75 centímetros quadrados, com uma razão de diluição de um para cinco. Para manter o crescimento na fase logarítmica, agite suavemente o frasco manualmente.Em seguida, incubar novamente as células a 27 graus Celsius até que atinjam confluência. Após a incubação, as células SF9 estão prontas para serem usadas na expressão de PKCs marcadas com fluoróforo, conforme descrito no procedimento escrito anteriormente à expressão de PKCs marcadas com fluoróforo. Culturas de células neuronais pleigocitárias são preparadas em placas de cultura com fundo de vidro Matech, conforme descrito anteriormente. Dois dias após o isolamento dos neurônios sensoriais, filtrar uma quantidade previamente preparada de verde rápido utilizando uma seringa e um filtro de seringa de 20 milímetros com tamanho de poro de 0,2 mícron.Prepare uma solução de DNA plasmidial codificando para E-G-F-P-P KC API dois em água destilada contendo 0,5% de verde rápido numa concentração não superior a 0,4 microgramas por microlitro. Filtre a solução de DNA plasmidial com verde rápido utilizando uma seringa de um mililitro e um filtro de seringa de quatro milímetros com porosidade de 0,2 mícrons. Em seguida, centrifugue a solução de DNA plasmidial com verde rápido a 16.110 ×g durante 15 minutos utilizando uma microcentrífuga.Em seguida, prepare eletrodos afiados para microinjeção de neurônios utilizando um puxador de microeletrodos. Puxe microeletrodos de vidro usando capilares de vidro de parede fina com filamentos internos. Encha cada eletrodo com dois microlitros de solução de DNA plasmidial com verde rápido.Utilizando uma ponteira de pipeta de microinjeção, a microinjeção é realizada na estação de microinjeção. A estação de microinjeção consiste em uma plataforma de vidro grande feita artesanalmente para segurar as placas de cultura sobre uma mesa de isolamento de vibração. Um estereoscópio com iluminação halógena externa, um micromanipulador e um suporte para microeletrodo conectado a uma bomba pneumática.A entrada de pressão da bomba pneumática é conectada a um tanque de nitrogênio comprimido. Transfira a placa de cultura com fundo de vidro matech contendo os cultivos de neurônios plegia para a estação de microinjeção e insira um microeletrodo no suporte de microeletrodo. Observe os neurônios sob um microscópio estéreo e insira a ponta da micropipeta no núcleo celular.Aplicar pulsos curtos de pressão de nitrogênio com duração de 10 a 100 milissegundos e 20 libras por polegada quadrada até que o núcleo fique uniformemente verde. Incubar as células por quatro horas à temperatura ambiente e manter a quatro graus Celsius até o uso em um microscópio confocal invertido Zeiss LSM cinco 10 com axia avert. 200 é utilizado para a obtenção de imagens de células SF nine e neurônios sensoriais plegia.A imagem dos neurônios sensoriais de plegia é demonstrada neste vídeo. Os detalhes para a obtenção de imagens de células SF nove podem ser encontrados no protocolo escrito. Utilize um laser de argônio de 30 miliwatts com saída de laser de 50% para imagens da PKC marcada com a proteína EGFP.Em seguida, atenue a linha do laser Argonne para uma saída de transmissão de 4%. Ajuste então o diafragma de pinça a um, estabilize a placa de cultura no estágio de imagem e evite movimento ou vibração. Remova cuidadosamente um mililitro do meio de cultura da placa utilizando uma pipeta de 10 mililitros e deixe um volume total de um mililitro.No recipiente, localize a região mediana das células onde pode ser visto o núcleo. Configure uma série temporal de 10 a 20 imagens confocais com intervalos de tempo de 30 segundos.Inicie o filme e, após a captura da segunda imagem, induza a translocação adicionando suavemente um mililitro de fármaco na concentração duas vezes maior. Adicione o fármaco gota a gota sobre as células continuamente por cerca de 30 segundos. Aqui, a serotonina é utilizada para induzir uma translocação rápida, que pode ser visível imediatamente após o tratamento com o fármaco.Algumas drogas induzem uma translocação lenta, que só é ideal cinco a dez minutos após o tratamento; remova a droga com duas pipetas de 10 mililitros, adicionando suavemente o tampão de lavagem com uma pipeta em um lado da placa e aspirando o meio do outro lado. Se a lavagem for eficaz e o efeito da droga for reversível, a PKC retornará ao citosol em 30 a 60 segundos. Salve o filme como um arquivo LSM mostrado.Aqui estão os resultados representativos da imagem em tempo real da translocação da PKC em neurônios sensoriais de plegia. O E-G-F-P-P KC APL dois foi expresso em um neurônio sensorial e uma série de 10 imagens confocais foi registrada em intervalos de tempo de 30 segundos. Neste exemplo, a serotonina foi adicionada à placa após 30 segundos de gravação.Neste exemplo, é mostrada a imagem em tempo real da translocação da PKC em células SF9. A PKC APL um com marcação E-G-F-P e a PKC APL dois com marcação M-R-F-P foram coexpressas em células SF9 e uma série de 10 imagens confocais foi registrada em intervalos de tempo de 30 segundos. Um dois SN glicerol dioctil.Foi adicionado ao recipiente um análogo permeável à célula do glicerol DYL após 30 segundos de gravação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar PKCs marcadas com fluorescência em neurônios sensoriais de aplysia e de como imaginar a translocação de PKC em células vivas.

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Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um bom modelo para estudar o transporte axonal e intracelular. Aqui, eu descrevo um protocolo para análise de transporte axonal e em c. eleganse in vivo de gravação.

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Um procedimento é apresentado para visualizar as atividades da proteína quinase A em ratos cabeça-fixados, comportando-se. Um repórter melhorado da atividade da um-quinase, tAKARα, é expressado em neurônios corticais e tornado acessível para A imagem latente através de uma janela craniana. A microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão é usada para visualizar atividades de PKA in vivo durante a locomoção forçada.

Visualizando proteína quinase uma atividade na cabeça-corrigido ratos comportando-se usando in vivo microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão

Este protocolo apresenta um método para a atividade populacional neuronal de imagem com resolução unicelular em espécies invertebrados não transgênicas usando corantes sensíveis à tensão de absorvância e uma matriz de fotodiodo. Essa abordagem permite um fluxo de trabalho rápido, onde imagens e análises podem ser perseguidas ao longo de um único dia.

Imagem óptica baseada em fotodiodo para dinâmica de rede de gravação com resolução de neurônio único em invertebrados não transgênicos

Este protocolo descreve aplicações de imobilização de amostras usando coágulos fibrinas, limitando a deriva e permitindo a adição e lavagem de reagentes durante a imagem ao vivo. As amostras são transferidas para uma gota de Fibrinogênio contendo meio de cultura na superfície de um deslizamento de cobertura, após o qual a polimerização é induzida pela adição de trombina.

Aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Este artigo apresenta um protocolo passo a passo detalhado sobre como utilizar um sistema multifuncional e programável integrado ao usuário que permite que a imagem multicanal e a análise mecanobiológica automática e a elucidação da mecano-sensibilidade da proteína associada ao Sim (YAP).

Interrogatório de Mecanobiologia totalmente óptica de proteína associada a sim em câncer humano e células normais usando um sistema multifuncional

Aqui, demonstramos como combinar a transfecção de neurônios primários de roedores do hipocampo com imagens confocais de células vivas para analisar os efeitos patológicos induzidos por proteínas no transporte axonal e identificar vias mecanicistas que medeiam esses efeitos.

Usando imagens de células vivas para medir os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal em neurônios primários do hipocampo

Aprenda a visualizar a translocação da PKC em células vivas usando microscopia confocal de varredura a laser. Este método permite estudar a dinâmica da PKC em neurônios sensoriais de Aplysia e células Sf9 em tempo real.

Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia

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