Name: Arabidopsis thaliana Profiling Glycerolipid Polar por cromatografia em camada delgada (TLC) Juntamente com Cromatografia gás-líquido (GLC) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Aprenda a analisar lipídios polares em plântulas de Arabidopsis thaliana usando cromatografia em camada delgada e cromatografia gás-líquido. Este método simples permite quantificar ésteres metílicos de ácidos graxos.

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Este trabalho é apoiado por uma bolsa da National Science Foundation EUA para Christoph Benning.

1. Extração de lipídeos <ol><li> Começar a extração de lipídios colhendo 30 mg deixa quatro semanas de idade Arabidopsis partir de plantas cultivadas em ágar solidificado médio ou solo e transferi-los para 1,5 mL tubos de reacção de polipropileno. Folhas frescas podem ser flash congelado em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C. </li><li> Adicionar 300 mL de extração de solvente composto por metanol, clorofórmio e ácido fórmico (20:10:01, v / v / v) para cada amostra. Agite vigorosamente (usando um misturador de tinta ou similar) por 5 minutos. </li><li> Adicionar 150 mL de ácido fosfórico 0,2 M (H 3 PO 4), 1 M de cloreto de potássio (KCl) e brevemente vortex. </li><li> Centrifugar a 13.000 xg à temperatura ambiente por 1 minuto. Lipídios dissolvidos na fase de menor clorofórmio será manchado em placas de TLC. </li></ol> 2. Cromatografia em camada fina (TLC) 15 <ol><li> Para preparar as placas TLC, submerge um 20cmx20cm placa de sílica gel TLC revestido com carga strip por 30 segundos em 0,15 M de sulfato de amônio ((NH 4) 2 SO 4) solução, depois de submergir por 30 segundos, secar a placa por pelo menos dois dias no um recipiente coberto. Durante a ativação da sublimação de amônio deixa para trás ácido sulfúrico, que protonates fosfatidilglicerol necessário para a sua separação de glycerolipids outros. </li><li> No dia do experimento, ativar placas por TLC assando no forno a 120 ° C por 2,5 horas. </li><li> Após resfriamento das placas ativado à temperatura ambiente, use um lápis para desenhar uma linha reta (1,5 cm da borda da placa) em toda a placa na origem do cromatograma. </li><li> Em uma capela, lentamente entregar 3 X 20 mL do extrato lipídico na fase de menor clorofórmio, utilizando uma pipeta 20 mL com 200 mL amarelo dicas de plástico sob uma corrente lenta de N 2. Para esta finalidade, um tubo Tygon é conectado ao regulador do 2 N tanque. Mantenha o ponto inferior a 1 cm de diâmetro. Cada placa pode conter até 10 amostras (quando a análise subseqüente é planejada GLC). </li><li> Como o de lipídios spots completamente seco na capela, prepare o solvente de desenvolvimento composto de acetona, tolueno, água (91 mL: 30 mL: 7,5 mL). Se a umidade relativa do ar ambiente é alta, a separação poderia ser afetada. Neste caso, a água deve ser reduzida para dar (mL 91: 30 mL: 7,0 mL) para conseguir a separação desejada. </li><li> Despeje 80 ml solvente de desenvolvimento em um TLC selável desenvolvimento câmara (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, cm / cm / cm) e colocar a placa para dentro do tanque com o fim da amostra virada para baixo. Vedação do tanque usando a braçadeira. O solvente irá subir a placa e lipídios serão separados. O tempo de desenvolvimento é de aproximadamente 50 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Quando a frente do solvente tenha atingido 1 cm do topo da placa, remova cuidadosamente a placa da tina e secar completamente na capela por aproximadamente 10 minutos. </li><li> Lipídios separados por TLC pode ser reversível manchada brevemente com iodo para a análise quantitativa ou irreversivelmente manchado com ácido sulfúrico ou α-naftol. <ol><li> Sulfúrico carbonização ácido: pulverizar a placa com 50% de ácido sulfúrico em água em um frasco spray de vidro no extractor de fumo e leve ao forno a 120 ° C por 15 minutos (Figura 2A). </li><li> α-naftol coloração para glycolipids: pulverizar a placa com 2,4% (w / v) α-naftol em 10% (v / v) de ácido sulfúrico, 80% (v / v) etanol e leve ao forno a 120 ° C por 3-5 minutos, até bandas glicolipídeo estão manchadas rosa ou roxo (Figura 2B). Sobretratamento levará a carbonização de todos os lipídios devido à presença de ácido sulfúrico no reagente. </li><li> Coloração de iodo: em um exaustor, colocar a placa em um tanque de TLC fechado com cristais de iodo (em uma bandeja na parte inferior levando à saturação da atmosfera com vapor de iodo até lipídios são visíveis). Não expor a placa ao iodo muito tempo como o iodo pode modificar covalentemente de ácidos graxos poliinsaturados (Figura 2C). Como alternativa, para evitar a oxidação de lipídios, apenas pistas padrão intercaladas com faixas de amostra deve ser manchado com um a lã de vidro conectado Pasteur pipeta com cristais de iodo através do qual N 2 é soprado sobre pistas individuais padrão. </li></ol></li></ol> 3. Acil graxos metílicos Reaction (FAME) 16 <ol><li> Remove manchas de sílica em torno de lipídios identificados a partir da placa de TLC com uma lâmina de barbear. Raspe a sílica contendo lipídios e transferir o pó de sílica utilizando um funil para um tubo de vidro com tampa de rosca de teflon (PTFE) alinhadas. </li><li> Adicionar 1 mL de ácido clorídrico 1 N (HCl) em metanol anidro para cada amostra de vidro pipeta. </li><li> Adicionar 100 mL 50 mg mL -1 pentadecanoic ácido (15:00), utilizando 200 mL de pipeta para cada amostra como padrão interno, utilizando uma pipeta 200 mL com 200 mL ponta de plástico amarela. Mantenha um tubo com apenas ácido pentadecenoic em metanólico HCl como controle. Fechar os tubos de vidro firmemente com Teflon alinhadas caps. </li><li> Incubar glass tubos em um banho de água 80 ° C por 25 minutos. Tubos devem ser selados de forma que o solvente não evapore. </li><li> Depois de tubos têm arrefecido, adicione 1 mL de cloreto de sódio a 0,9%, seguido por uma hexano mL e vortex vigorosamente. Centrifugar amostras 1000xg por 3 minutos. </li><li> Na capela, remova a camada de hexano / superior da amostra com uma pipeta Pasteur e colocá-lo em um novo tubo de vidro 13x100 milímetros. </li><li> Evaporar hexano sob uma corrente lenta de N 2 sem secar completamente. </li><li> Dissolver o resultado graxos acil methylesters s em 60 mL de hexano. Transferência de amostras em frascos de amostrador automático e tampa. Amostras podem ser armazenadas a 4 ° C para curto prazo e -20 ° C por alguns dias. </li></ol> 4. Cromatografia gás-líquido (GLC) 10 <ol><li> Antes de iniciar GLC, Certifique-se que o hidrogênio, hélio e cilindros de ar são preenchidos. </li><li> Hexano suficiente deve ser adicionado ao reservatório de solvente e o recipiente de resíduos deve estar vazio. Para graxos separação methylesters acila, anexar um DB-23 da coluna para a máquina. </li><li> Frascos lugar para o amostrador automático. Inicie o software ChemStation para GLC no computador do sistema. </li><li> Definir a temperatura de entrada a 250 ° C com taxa de fluxo de hélio em 48,6 mL min -1 ea pressão em 21,93 psi. A razão de separação é de 30,0: 1. </li><li> A temperatura do forno é definido inicialmente a 140 ° C por 2 min e aumentada para 160 ° C a uma taxa de 25 ° C min -1. Em seguida, defina a temperatura aumente de 160 ° C a 250 ° C a uma taxa de 8 ° C min -1 e mantenha a 250 ° C por 4 min seguido por uma diminuição para 140 ° C a uma taxa de 38 ° C min - 1. Uma corrida dura aproximadamente 21 minutos. </li><li> A temperatura do detector de ionização de chama é de 270 ° C com uma taxa de fluxo de hidrogênio de 30,0 mL min -1, vazão de ar de 400 mL min -1 e taxa de fluxo de hélio em 30,0 mL min -1. </li><li> Digite o número de frascos e nomes de amostra na tabela de seqüência de execução. Definir o injector de 10 L para injetar 2 mL da amostra por frasco. </li><li> Quando o instrumento está pronto, iniciar a seqüência de execução. </li></ol> 5. Resultados representativos: Exemplos de coloração irreversível de TLC-separados lipídios a partir de mudas de quatro semanas de idade Arabidopsis são mostrados na Figura 2. Os lipídios ácido sulfúrico corado (Figura 2A) estão carbonizados e aparecem como manchas marrons. α-naftol é preferível a mancha glycolipids como MGDG, DGDG, SQDG etc Glicolipídeos corados com α-naftol levar uma cor rosa-púrpura, enquanto outros lipídeos polares mancha amarela (Figura 2B). A coloração de iodo é reversível e dá lipídios uma cor amarelada que desaparecerão ao longo de um curto período de tempo como evapora iodo (Figura 2C). Lipídios brevemente iodo manchadas podem ser submetidos à análise GLC embora imaculada lipídios são preferíveis para reduzir a quebra de lipídios. Se feito com sucesso, os sinais distintivos que representam diferentes Fatty acil metílicos será observado após GLC (Figura 3). Metílicos de acila graxos de cadeia curta de carbono e menos ligações duplas têm menor tempo de retenção usando o DB-23 coluna. Graxos acil perfil metílico é um instrumento sensível para identificar mutantes com composição lipídica alterada. Na Figura 4, o MGDG18: 3 proporção molar de ácidos graxos é reduzida no mutante tgd4-1 em relação ao tipo selvagem 18. Dividindo-se o moles de gordos acil metílicos para uma classe de lipídios com as toupeiras de todas as classes de lipídios, a relação molar de cada lipídios são calculados. Por exemplo, para calcular a razão molar de MGDG: (MGDG) mol% =% x100 Σ [FAMEs (MGDG)] / Σ [FAMEs (total)] As relações resultantes molar de cada classe de lipídeos de tanto o tipo selvagem eo mutante pode ser comparado. Por exemplo, o mutante tgd4-1 aumentou quantidades relativas de MGDG e PG, mas diminuiu quantidades de DGDG e PE (Figura 5) 18. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura Fluxograma 1. Da análise de lipídios polar usando mudas de Arabidopsis. Lipídios totais são extraídos de mudas de quatro semanas de idade Arabidopsis e separados por TLC. Os lipídios podem ser separados raspadas TLC placa de transesterificação seguido de análise GLC. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Separação de lipídios em placas de TLC. Extratos de lipídios de 35 mg (peso fresco) de mudas do tipo selvagem são separados por TLC e corados pelo ácido sulfúrico (A), α-naftol (B) ou iodo vapor (C). Três repetições são mostradas em cada método de coloração. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; monogalactosyldiacylglycerol MGDG,; PC, fosfatidilcolina, PE, fosfatidiletanolamina, PG, phosphatidylglycerol; PI, fosfatidilinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. GLC análise de Methylesters ácidos graxos (FAMEs) derivado de MGDG do tipo selvagem. FAMEs são separados em uma coluna de 30 m capilar e detectado por ionização de chama. Pentadecanoic ácido (15:00) é usado como padrão interno. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Perfil de ácidos graxos de MGDG no tipo selvagem Col2 (colunas brancas) e os tgd4-1 mutante (colunas pretas). Ácidos graxos são apresentados como o número de carbonos, seguido do número de ligações duplas. Três repetições são em média e desvios-padrão são mostrados. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Composição de lipídios polares do tipo selvagem Col2 (colunas brancas) e os tgd4-1 mutante (colunas pretas). Três repetições são em média e desvios-padrão são mostrados pela barra de erro.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

TLC juntamente com GLC fornece uma ferramenta robusta e rápida de análise quantitativa de lipídios polares em plantas. Pequenas mudanças na composição lipídica podem ser identificados e, portanto, este método tem sido utilizado para triagem em larga escala de mutantes deficientes nas vias metabólicas lipídicas polar 1,20. Este método também é amplamente utilizado para atividades de monitoramento de enzimas utilizando lipídeos polares como substrato. 2,6,7 Além de folhas, a composição lipídica de outros tecidos vegetais, como raízes e sementes ou frações subcelulares, como cloroplastos e mitocôndria também pode ser determinado da mesma maneira. O sistema de solvente (acetona, tolueno, água) aqui utilizado é otimizado para a separação de glicolipídios e fosfolipídios em plantas. No entanto, em tgd1, 2,3,4 mutantes e cloroplastos isolados, TGDG executado em conjunto com o PE, enquanto tetragalactosyldiacylglycerol funciona com PC. Neste caso, um sistema de solventes com clorofórmio, metanol, ácido acético e água (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) é usado 13. Às vezes bidimensional TLC usando dois diferentes sistemas solventes é realizada para mais glycolipids separado e fosfolipídios 19. Além disso, tecidos vegetais podem ser diretamente submetidas à reação FAME seguido por GLC para determinar o perfil de ácidos graxos totais, sem separação inicial sobre TLC 5. Ao lado do TLC-GLC demonstrado sistema, outro método utilizado para o perfil lipídico é baseado em directo de massas com ionização electrospray em tandem espectrometria de 17. Neste método, a separação cromatográfica inicial de lipídios no extrato é omitido. No entanto, este método requer equipamentos caros e pessoal experiente, o que o torna menos útil para análises de rotina no laboratório ou para a seleção de mutantes.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-naftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>HCl metanólico 3N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33050-U</td><td>Diluir até 1N com metanol</td></tr><tr><td>Placas TLC Si250-PA</td><td>JT Baker</td><td>7003-04</td><td>Com pré-absorvente</td></tr><tr><td>Câmara para TLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z266000</td><td></td></tr><tr><td>Tubos com tampa rosqueável</td><td>VWR international</td><td>53283-800</td><td></td></tr><tr><td>Tampas rosqueáveis</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td></td></tr><tr><td>Disco de PTFE</td><td>Sun Sri</td><td>200 608</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de GLC</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP6890</td><td></td></tr><tr><td>Coluna DB-23</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>122-2332</td><td></td></tr><tr><td>Frascos para GLC</td><td>Sun Sri</td><td>500 132</td><td></td></tr><tr><td>Tampas dos frascos de GLC</td><td>Sun Sri</td><td>201 828</td><td></td></tr><tr><td>Software Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2070AA</td><td></td></tr></tbody></table>

arabidopsis thaliana profiling glycerolipid polar por cromatografia em camada delgada (tlc) juntamente com cromatografia gás-líquido (glc)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biológica células membranas separado do ambiente. A partir de uma única célula de plantas e animais multicelulares, glycerolipids, como fosfatidilcolina ou fosfatidiletanolamina, membranas formam bicamada que atuam tanto como os limites e interfaces para permuta química entre as células e seus arredores. Ao contrário dos animais, células vegetais têm uma organela especial para a fotossíntese, o cloroplasto. O sistema de membrana intrincados do cloroplasto contém glycerolipids única, ou seja, glicolipídeos falta de fósforo: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Os papéis destes lipídios são além de simplesmente estrutural. Estes glicolipídeos e glycerolipids outros foram encontrados na estrutura cristalina do fotossistema I e II, que indica o envolvimento de glycerolipids na fotossíntese 8,11. Durante a fome de fosfato, DGDG é transferido para membranas extraplastidic para compensar a perda de fosfolipídeos 9,12. Muito do nosso conhecimento da biossíntese e função desses lipídios foi derivado de uma combinação de estudos genéticos e bioquímicos com 14 Arabidopsis thaliana. Durante esses estudos, um procedimento simples para a análise de lipídios polares tem sido essencial para o rastreamento e análise de mutantes lipídico e será descrito em detalhes. Um extrato de lipídios folha é primeiro separados por cromatografia em camada delgada (TLC) e glycerolipids estão manchadas reversivelmente com vapor de iodo. Os lipídios individuais são raspadas da placa de TLC e convertidos em gordura methylesters acila (FAMEs), que são analisados ​​por cromatografia gás-líquido acoplado com detecção de ionização de chama (FID-GLC) (Figura 1). Este método tem provado ser uma ferramenta confiável para a seleção de mutantes. Por exemplo, o tgd1, 2,3,4 retículo endoplasmático-to-plastid mutantes tráfico de lipídios foram descobertos com base na acumulação de um galactoglycerolipid anormal: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) e uma diminuição na quantidade relativa de 18:03 (carbonos: double títulos) grupos acila graxos em lipídios de membrana 3,13,18,20. Este método também é aplicável para a determinação atividades enzimáticas de proteínas usando lipídios como substrato 6.

Composição de extratos de lipídios polares e da composição de ácidos graxos de glycerolipids individuais são determinados em um experimento simples e robusto perfil lipídico. Para este fim, glycerolipids são isolados por cromatografia em camada delgada e submetido a transmetilação de seus grupos acil. Graxos methylesters acila são quantificados por cromatografia gás-líquido.

Arabidopsis thaliana Profiling Glycerolipid Polar por cromatografia em camada delgada (TLC) Juntamente com Cromatografia gás-líquido (GLC)

As membranas biológicas separam as células do ambiente. Desde uma única célula até plantas e animais multicelulares, os glicerolipídios, tais como...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a composição de lipídios polares de plântulas de arabidopsis. Isso é realizado primeiramente por meio da extração de lipídios das plântulas. Os lipídios polares são então separados por cromatografia em camada delgada.A seguir, manchas específicas de lipídios são isoladas da placa de camada delgada e convertidas em ésteres metílicos de ácidos graxos por transesterificação. O passo final do procedimento é quantificar a composição dos ésteres metílicos de ácidos graxos por cromatografia gasosa em fase líquida. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a razão molar e o perfil de ácidos graxos de cada lipídio polar em tipo selvagem e mutante.Olá, meu nome é Christophe Benning. Muitos de vocês nos perguntaram como realizar uma análise quantitativa de lipídios polares. Utilizamos um método muito simples e robusto que tem funcionado bem em triagens em larga escala de mutantes na planta modelo opsis ou nos motores RG kilômetro.Outros excelentes métodos, como o perfilamento de lipídios baseado em espectrometria de massas, exigem equipamentos caros e muita experiência e treinamento. Utilizamos um procedimento em duas etapas que envolve cromatografia em camada delgada simples combinada com a quantificação de ésteres metílicos de ácidos graxos após o isolamento de mutantes. Normalmente, é necessária uma análise mais quantitativa.Isso é feito pela isolamento de lipídios de membrana a partir da placa de camada fina e preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos, que são quantificados por cromatografia gasosa. O método é altamente reprodutível e os resultados são comparáveis com técnicas baseadas em espectrometria de massa mais complexas, demonstrando o procedimento será Zen Wang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Inicie a extração de lipídios colhendo 30 miligramas de folhas de Arabidopsis com quatro semanas de idade, provenientes de plantas cultivadas em meio sólido de ágar ou solo. Transfira as folhas para tubos de reação de 1,5 mililitro de polipropileno.Adicione 300 microlitros de solvente de extração composto por metanol, clorofórmio e ácido fórmico a cada amostra. Agite as amostras vigorosamente por cinco minutos. Em seguida, adicione 150 microlitros de ácido fosfórico 0,2 molar, cloreto de potássio 1 molar e vortex.Centrifugue brevemente a amostra a 13.000 ×g por um minuto. À temperatura ambiente, os lipídios dissolvidos na fase inferior de clorofórmio serão aplicados em placas de cromatografia em camada delgada. Para preparar as placas de TLC, mergulhe uma placa de TLC de 20 por 20 centímetros revestida com gel de sílica e faixa de carga em uma solução de sulfato de amônio 0,15 molar.Após submergir por 30 segundos, seque a placa por pelo menos dois dias em um recipiente fechado. Durante a ativação, a sublimação do amônio deixa ácido sulfúrico, que protona o fosfato e o glicerol, necessário para sua separação de outros lipídios glicerolícosos. No dia do experimento, ative as placas de CLC aquecendo-as em estufa a 120 graus Celsius por duas horas e meia.Após resfriar as placas ativadas até a temperatura ambiente, use um lápis para traçar uma linha reta através da placa na origem do cromatograma. Em uma cabine de segurança, utilize uma tubulação de tigon conectada ao regulador do tanque de nitrogênio para fornecer um fluxo contínuo de gás nitrogênio, aplicando lentamente três vezes 20 microlitros do extrato lipídico da fase clorofórmica inferior na placa, usando uma micropipeta de 20 microlitros com ponteira plástica amarela de 200 microlitros, sob um fluxo lento de gás nitrogênio. Uma micropipeta de 20 microlitros é utilizada para manter a mancha com diâmetro inferior a um centímetro.Cada placa pode conter até 10 amostras enquanto as manchas de lipídios secam completamente. Na capela, prepare o solvente de eluição composto de acetona, tolueno e água. Despeje 80 mililitros do solvente de eluição em uma câmara selável para desenvolvimento de CLP e coloque a placa dentro do tanque.Selar o tanque com a extremidade da amostra voltada para baixo. Usando o grampo, o solvente subirá pela placa e os lipídios serão separados. O tempo de desenvolvimento é de aproximadamente 50 minutos à temperatura ambiente.Quando a frente do solvente atingir um centímetro da borda superior da placa, remova cuidadosamente a placa do tanque e seque-a completamente na capela por 10 minutos. Os lipídios separados por TLC podem ser temporariamente corados com iodo para análise quantitativa ou permanentemente corados com ácido sulfúrico ou alfa natal. Para coloração permanente da placa, utilize a carbonização com ácido sulfúrico.Pulverize a placa com ácido sulfúrico a 50% em água usando um frasco pulverizador de vidro na capela de exaustão e aqueça-a a 120 graus Celsius por 15 minutos. Alternativamente, para coloração com alfa natal para glicolipídios, pulverize a placa com alfa natal a 2,4% peso por volume em ácido sulfúrico a 10% volume por volume, etanol a 80% volume por volume. Aqueça a placa a 120 graus Celsius por três a cinco minutos até que as manchas de glicolipídios fiquem cor-de-rosa ou roxas.Realize a coloração com iodo em uma câmara de gases. Em uma cabine de exaustão, prepare um tanque fechado para cromatografia em camada delgada (CCD) com cristais de iodo em uma bandeja na parte inferior do tanque, de modo a saturar a atmosfera com vapor de iodo. Coloque a placa de CCD no tanque para expô-la ao iodo até que os lipídios se tornem visíveis. Não exponha por tempo excessivo, pois o iodo pode reagir covalentemente.Modifique os ácidos graxos poliinsaturados. Remova a sílica ao redor das manchas lipídicas identificadas na placa de TLC com uma lâmina de barbear e raspe a sílica contendo os lipídios. Usando um funil, transfira o pó de sílica para um tubo de vidro com tampa de rosca revestida de teflon.Adicione um mililitro de ácido clorídrico em metanol anidro a cada amostra por meio de uma pipeta de vidro. Em seguida, adicione 100 microlitros de ácido pentadecanoico a 50 microgramas por mililitro a cada amostra como padrão interno, utilizando uma pipeta de 200 microlitros com ponteira plástica amarela de 200 microlitros. Prepare também um tubo contendo apenas ácido pentadecanoico em metanol com ácido clorídrico como controle.Fecham-se os tubos de vidro firmemente com tampas revestidas de teflon. Incubam-se os tubos de vidro em banho-maria a 80 graus Celsius por 25 minutos. Os tubos devem ser selados para que o solvente não evapore após o resfriamento dos tubos.Adicione um mililitro de cloreto de sódio 0,9% seguido por um mililitro de hexano e, em seguida, agite vigorosamente em vórtex. Centrifugue as amostras a 1000 × g durante três minutos. Após a centrifugação, remova a camada superior de hexano da amostra com uma pipeta Pasteur na capela e coloque-a em um novo tubo de vidro de 13 por 100 milímetros. Evapore o hexano sob um fluxo lento de nitrogênio sem secar completamente. Dissolva os ésteres metílicos de ácidos graxos resultantes em 60 microlitros de hexano. Transfira as amostras para frascos de amostragem automática e, em seguida, tampe firmemente.As amostras podem ser armazenadas a quatro graus Celsius para curto prazo e a menos 20 graus Celsius por alguns dias antes do início da GLC. Certifique-se de que os cilindros de hélio, hidrogênio e ar estão cheios; hexano suficiente deve ser adicionado ao reservatório de solvente e o recipiente de resíduos deve estar vazio para a separação de ésteres metílicos de ácidos graxos. Acople uma coluna DB 23 ao equipamento.Coloque os frascos no amostrador automático. Inicie o software da estação química para GLC no computador do sistema. Ajuste a temperatura da entrada em 250 graus Celsius, com uma taxa de fluxo de hélio de 48,6 mililitros por minuto e uma pressão de 21,93 PSI.A razão de divisão é de 30 para um. A temperatura do forno é inicialmente ajustada em 140 graus Celsius por dois minutos e elevada para 160 graus Celsius a uma taxa de 25 graus Celsius por minuto. Em seguida, ajuste a temperatura para aumentar de 160 graus Celsius a 250 graus Celsius a uma taxa de oito graus Celsius por minuto, mantendo a temperatura em 250 graus Celsius por quatro minutos, seguido por uma diminuição até 140 graus Celsius a uma taxa de 38 graus Celsius por minuto.Usando este perfil de temperatura, uma corrida leva cerca de 21 minutos. A temperatura do detector por ionização de chama é de 270 graus Celsius com uma vazão de hidrogênio de 30 mililitros por minuto. Vazão de ar em 400 mililitros por minuto e vazão de hélio em 30 mililitros por minuto.Insira o número de frascos e os nomes das amostras na tabela de sequência de execução. Configure o injetor de 10 microlitros para injetar dois microlitros da amostra por frasco. Quando o instrumento estiver pronto, inicie a sequência de execução.Exemplos da coloração de lipídios separados por TLC a partir de plântulas de Arabidopsis com quatro semanas de idade são mostrados aqui. Os lipídios corados com ácido sulfúrico são carbonizados e aparecem como manchas marrons. O alfa natal é preferido para corar glicolipídios como M-G-D-G-D-G-D-G e SQ dg.Glicolipídios corados com alfa natal apresentam uma coloração roxo-rosada, enquanto outros lipídios polares ficam amarelos. A coloração com iodo é reversível e confere aos lipídios uma coloração amarelada que desaparecerá em pouco tempo à medida que o iodo evapora. Resumidamente, lipídios corados com iodo podem ser submetidos à análise por GLC, embora lipídios não corados sejam preferíveis para reduzir a degradação dos lipídios, caso o procedimento seja bem-sucedido.Sinais distintivos representando diferentes metil ésteres de ácidos graxos serão observados após a GLC; metil ésteres de ácidos graxos com cadeias carbônicas mais curtas e menos ligações duplas apresentam tempos de retenção mais curtos. Utilizando a coluna DB 23. O perfil de metil ésteres de ácidos graxos é uma ferramenta sensível para identificar mutantes com composição lipídica alterada.A razão molar dos três ácidos graxos do MGDG 18 é reduzida no mutante TGD four dash one em comparação com o tipo selvagem, dividindo-se os mols de éster metílico de ácido graxo de uma classe lipídica pelos mols de éster metílico de ácido graxo de todas as classes lipídicas. Para todas as classes lipídicas, as razões molares de cada lipídio são calculadas, permitindo comparar aqui as razões molares resultantes de cada classe lipídica do tipo selvagem e do mutante. É evidente que o mutante TGD four dash one apresenta quantidades relativas aumentadas de MGDG e pg, mas quantidades reduzidas de D-G-D-G-N-P-E. A cromatografia em camada delgada permite examinar muitas amostras em paralelo e possibilita uma inspeção visual das principais diferenças nos perfis lipídicos.Além disso, ao analisar uma TLC, você está essencialmente examinando diversas enzimas e genes necessários para a síntese dos lipídios e, portanto, para o perfil lipídico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar a composição de lipídios polares por TOC e GOC. Obrigado por assistir ao vídeo e boa sorte com seu experimento.

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Biologia

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