Name: Preparação e Cultura do Fatias de frango auditivo de tronco cerebral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprenda a preparar fatias do tronco encefálico auditivo de frango para estudos de neurofisiologia in vitro e culturas organotípicas de longo prazo. Este método preserva a integridade funcional do circuito auditivo.

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Laboratório membros atuais e antigos Rubel.

1. Preparação de Dissecting Área <ol><li> Continuamente bolha artificial de fluido cerebral espinhal (ACSF) com uma mistura de 95% O 2 / 5% CO 2 (pH entre 7,2-7,4, osmolaridade 295-310 mOsm / l). </li><li> Enquanto ACSF está borbulhando, limpe a área de trabalho com EtOH 70%. Também limpar o vibratome e lâmina de corte. Enxaguar a lâmina com água destilada (dH 2 O). </li><li> Local almofada de absorção de líquidos limpos em dissecar área com ferramentas adequadas de dissecação. </li><li> Cola bloco de agar (40 mg de agarose / mL, ou seja 4%, em dH 2 O) para o palco de uma câmara de vibratome-slicing *. * Dica: prepare ágar antes da dissecção. Loja agar pré-fabricados dentro de uma placa de Petri cobertas na geladeira. Agarose comprado de Merck Química ou Invitrogen. </li></ol> 2. Preparação de 6-bem Placas com meio de cultura <ol><li> Sob um capuz estéril, preencher um bem por animal de uma placa de 6-bem com 1 mL de meio de cultura e incubar a 35 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Prepare como inserções membrana muitos cultura como necessários e colocá-los na capa para uso posterior. </li></ol> 3. Isolamento do tronco cerebral Chicken <ol><li> Ovo lugar sob uma fonte de luz brilhante para determinar o ar vazio espaço preenchido do embrião (normalmente o lado grande do ovo). </li><li> Quebre aberto lado grande saco de ovos a exposição da membrana. Faça fatia na membrana saco com bisturi e remover suavemente a cabeça do embrião de galinha. </li><li> Rapidamente decapitar a cabeça com uma tesoura. </li><li> Ponta lugar de lâmina ligeiramente posterior para e entre os olhos. Faça uma incisão rostral-to-caudal da linha média através do crânio aplicando-se apenas uma ligeira pressão *. * Dica: pressão aplicada depende da idade do embrião (ou seja, = jovens menos, mais velhos = mais) </li><li> Suavemente afastar pele e penas para expor crânio e verificar corte da linha média. </li><li> Bloco porção rostral do crânio por corte com uma lâmina de barbear. Blade posição posterior para os olhos e rapidamente cortou o crânio inteiro e tecido cerebral *. * Dica: forte pressão é necessária para remover completamente seção rostral. </li><li> Faça a linha média-lateral incisões com uma tesoura pequena na região caudal do crânio, um pouco anterior aos músculos do pescoço visível em ambos os lados da cabeça. Se afastar do crânio e do tecido para expor cerebelo e cérebro. </li><li> Remova cuidadosamente tronco a partir da base do crânio através do corte do tecido ligado com uma tesoura pequena. Uma vez que todo o tecido é cortado, tronco deve mover-se livremente fora do crânio *. * Dica: você pode precisar virar a cabeça (para baixo do cérebro) para cortar o tecido em anexo. </li></ol> 4. Preparação de Tronco para Slicing <ol><li> Uma vez retirados do crânio, o pino para baixo através do tronco cerebral TECTA óptica. </li><li> Remover completamente o cerebelo suavemente cortando os pedúnculos com uma tesoura pequena, expondo o assoalho do quarto ventrículo. </li><li> Remover qualquer tecido membranoso e dos vasos sanguíneos da superfície do tronco cerebral, com uma pinça e fazer cortes laterais através da TECTA óptica para isolar o tronco cerebral. </li><li> Coloque uma pequena quantidade de super-cola no palco vibratome na frente do bloco de ágar (na direção da lâmina vibratome). </li><li> Com uma pinça, com cuidado e rapidamente levantar o tronco na medula espinhal e tecido lugar para a super-cola com o lado rostral baixo e de lado dorsal em direção à lâmina vibratome *. * Dica: excesso de cola deve ser absorvido com uma kim-wipe ou filtro de papel antes da etapa seguinte. </li><li> Derramar delicadamente ACSF oxigenado para o estágio vibratome *. * Nota: esta ACSF pode ser continuamente aeradas com O 2 / CO 2. No entanto, borbulhando de ACSF em um volume tão pequeno de resultados solução em movimentos indesejados (e possíveis danos) para as fatias do tronco cerebral. Se realizada rapidamente, já oxigenado ACSF da dissecção é suficiente. </li><li> Blade Vibratome deve estar em um ângulo de 20-22. Iniciar vibratome (oscilação deve ser fixado em amplitude máxima) e mova-se palco para a lâmina de modo que a parte superior do tecido é paralela com a lâmina antes de cortar. </li><li> Mover rapidamente em direção da lâmina de tecido cerebral. Diminuir consideravelmente pouco antes entrar em contato com o tecido da lâmina. </li><li> Comece cortando o tecido com o mais lento possível movimento para a frente. Depois de atravessar toda a seção coronal do tecido, suavemente move fatia de distância da lâmina com uma escova ou um vidro quebrado, disparou pipeta polido, se encaixam em uma das extremidades com um bulbo de borracha. </li><li> Estágio inferior em passos 300-500 mm e fatia de novo. Repita até que as assinaturas são visíveis anatômica no tecido cerebral. Neste momento, o tecido cerebral fatia contendo estruturas auditivas em 200-1000 mM espessuras, dependendo da idade das necessidades do tecido e experimental. </li><li> Manter cuidadosamente fatias utilizáveis ​​na ordem de corte, ou seja, a fatia de 1 º representa a região mais caudal do circuito (de baixa freqüência de processamento de som) ea última fatia representa a parte mais rostral (alta freqüência processing) *. * Nota: para a colocação de fatias para uso da cultura, vá para a seção 6. Para in-vitro de armazenamento fisiologia, veja a próxima seção. </li></ol> 5. Armazenamento fatia para in-vitro Fisiologia <ol><li> Dependendo da idade do embrião da galinha e da espessura da fatia, cada animal deve fornecer 1-6 fatias. </li><li> Delicadamente, coloque fatias individuais na câmara de usar o fogo pipeta de vidro polido montado em uma extremidade com um bulbo de borracha. Câmara devem ser numeradas. Coloque apenas uma fatia por poço, a fim de manter alguma especificidade tonotópica (por exemplo, fatia, mais caudal na câmara 1 ea fatia mais rostral na câmara anterior). Câmara deve ser preenchido com ACSF e continuamente aeradas com uma mistura de 95% O 2 / 5% CO 2 (pH 7.4, osmolaridade 295-310 mOsm / l). </li><li> Permitir fatias para equilibrar colocando a câmara em um banho quente (36 ° C) por aproximadamente 1 hora. </li><li> Remover câmara de banho morno e deixe descansar em temperatura ambiente por cerca de ½ hora. </li><li> Depois de horas e meia à temperatura ambiente, as fatias podem ser transferidos da câmara de exploração para uma câmara de gravação de ~ 0,5 mL montado em um microscópio para experimentos eletrofisiológicos. </li><li> Fatias podem ser utilizados para até ~ 6 horas após a remoção do banho quente. </li></ol> 6. Preparação das Culturas Slice organotípicas 8 <ol><li> Imediatamente após o procedimento corte (ver Secção 6) fatias de transferência com ~ 500 mL ACSF usando um incêndio pipeta de vidro polido montado em uma extremidade com um bulbo de borracha para uma placa de 48 bem no gelo. Por uma fatia bem *. * Dica: As fatias devem ser de pelo menos 300 mm e até 1000 mm de espessura. </li><li> Depois fatias foram coletadas, a transferência da placa de 48 também para a capa. </li><li> Remover uma placa bem 6-out meio contendo cultura da incubadora e transferi-la para a capa. </li><li> Pouco antes de colocar fatias de um único cérebro em membranas, coloque uma das inserções da membrana preparada (ver secção 2.2) em um poço com meio de cultura. Verifique se não há bolhas de ar estão presentes em membrana. </li><li> Usando uma pipeta de vidro, a transferência de uma fatia em uma gota de ACSF sobre a membrana cultura e remover o excesso ACSF com uma micropipeta. Repita o procedimento para as fatias restantes (max 4 fatias por membrana) *. * Dica: Certifique-se de postas não se tocam e coloque fatias de central na membrana de modo que não toque a borda da membrana. </li><li> Repita o procedimento para a fatias do cérebro que forem necessárias *. * Dica: Se as culturas são manipulados em um ponto mais tarde, pode ser vantajoso para limitar a quantidade de membranas para 3 por 6-bem como placa para reduzir o tempo as culturas são retirados da incubadora. </li><li> Alterar meio de cultura 3 vezes por semana sob um capuz: Remover média de idade com um tubo de vácuo com uma ponta estéreis, enquanto inserir membrana é retirado do poço com um par de fórceps. Adicionar 1 mL de meio de cultura fresco em bem, enquanto inserir membrana é retirado do poço. Quando todas as médias for alterado, colocar placa de volta para a incubadora. </li></ol> 7. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Circuito Binaural do tronco cerebral de frango. (A) Esquema de uma seção coronal e (BF) imagens in-vitro fatia do tronco cerebral de frango. O circuito em (A) mostra aferentes excitatórios entradas desde o nervo auditivo (AN) para o núcleo magnocellularis (NM) e angularis núcleo (NA). NM projectos bilaterais entradas excitatórias para o núcleo laminaris (NL) em ambos os lados do tronco cerebral. Uma entrada de inibição do núcleo olivar superior (SON) projetos para NA, NM e NL. As fatias in vitro-in (BF) são imagens seqüenciais (200 mM cada) indo de caudal (B) para rostral (F) do tronco cerebral de frango, representando os de baixa freqüência de regiões de alta, respectivamente. Circuito é responsável pela codificação de propriedades temporais do som usado principalmente para localização do som. Barra de escala em (B) = 500 mm e aplica para imagens em (CF). Setas em (D) apontam para a única camada de células do corpo de NL. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Neurônios cultivados desenvolver normais propriedades resposta fisiológica. Sobreposto variações de tensão de membrana em resposta a hiperpolarizante e despolarizante passos atual aguda (A &amp; C) e tecidos cultivados em 4 (B) e 7 (D) dias de cultura (DIC). Mudanças na nota hiperpolarizantes "sag" tensão, forte redução na corrente para fora, e disparando AP único que se desenvolvem de forma semelhante na abordagem da cultura em comparação com fatia de tecido idade equivalente aguda. Injeções de corrente foram 200 ms, os passos de 50-100 pA. RMPS foram entre -55 e -60 mV. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Estrutura anatômica em sli culturaces. meia esquerda do tronco cerebral de um frango E11 após 7 dias em cultura (DIC). Um anticorpo contra a proteína associada ao microtúbulo 2 (MAP2), que ocorre na soma e dendritos, é rotulado em verde. Um conjunto de núcleo magnocellularis (NM) neurônios e seus axônios são marcados em vermelho via eletroporação de um dextran Alexa corante. Ambos NM ea linha de células NL são visíveis. Terminais do axônio ipsilateral NM pode ser vista a projectar para os dendritos dorsal NL (setas brancas).

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<li>Sorensen, S. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+and+integrity+of+synaptic+input+regulates+dendrite+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The level and integrity of synaptic input regulates dendrite structure.</a> J Neurosci. 26, 1539-1550 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Durante várias décadas, a preparação fatia aguda do tronco cerebral de frango tem sido utilizada para estudo do processamento auditivo 9, 10. Esta abordagem forneceu uma enorme quantidade de in-vitro dados fisiológicos sobre o processamento binaural de ambos os estados de desenvolvimento e maturidade 4, 11, 12. Muito se sabe sobre este circuito altamente especializados eo papel de cada núcleo desempenha no processamento temporal do som 13, 14. Na verdade, a curto prazo manipulaç...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ACSF de frango&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11624</td><td>130 mM</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M-10576</td><td>26 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9333</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8282</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>Glicose</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>423525000</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Meio de cultura para frango (armazenar a 4&amp;#x00B0;C)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>meio mínimo essencial avançado (com NEAA, piruvato de sódio a 110 mg/l, sem L-glutamato)</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>48,00%</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Earl&amp;rsquo;s</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2888</td><td>24,00%</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7513</td><td>1,00%</td></tr><tr><td>Solução de glicose (200 g/l, filtrada esterilizante)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td>2,75%</td></tr><tr><td>Soro de cavalo (inativado pelo calor, filtrado esterilizante)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138</td><td>24,00%</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina*</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0781</td><td>1,00 ml&lt;br/&gt;* = Adicionar a 100 ml de meio de cultura, se necessário, para prevenir contaminação</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipamento específico&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insertos de cultura celular Millicell-CM</td><td>PICMORG50</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Placa de cultura celular de 6 poços</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Incubadora Forma Scientific com jaqueta de água e CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação e cultura do fatias de frango auditivo de tronco cerebral

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

O tronco cerebral frango é um sistema modelo bem estabelecido que tem sido amplamente utilizada para estudar a anatomia e fisiologia do processamento auditivo em períodos discretos de desenvolvimento 04/01, bem como os mecanismos de codificação temporal no sistema nervoso central 5-7. Aqui apresentamos um método para preparar fatias de frango auditivo do tronco cerebral que pode ser usada para procedimentos experimentais aguda ou fatias organotípicas cultura de longo prazo manipulações experimentais. O tronco cerebral é composto por frango angularis núcleo, azeitona, magnocellularis laminaris e superior. Esses núcleos são responsáveis ​​pelo processamento de som binaural única e preparações corte coronal preservar o circuito inteiro. Em última análise, as culturas fatia organotípicas pode fornecer a oportunidade de manipular vários parâmetros de desenvolvimento, como atividade sináptica, expressão de componentes pré e pós-sináptica, expressão de aspectos excitabilidade controle e expressão gênica diferencial Esta abordagem pode ser usada para ampliar o conhecimento geral sobre o desenvolvimento do circuito neural, refinamento e amadurecimento.

O tronco cerebral de frango é composta por núcleos responsáveis ​​pelo processamento de som binaural. A preparação única fatia coronal mantém o circuito inteiro, enquanto a abordagem culta fornece uma preparação única para estudar o desenvolvimento da estrutura neuronal e função auditiva em nível molecular, celular e rede.

Preparação e Cultura do Fatias de frango auditivo de tronco cerebral

O tronco encefálico auditivo do frango é um sistema modelo bem estabelecido que tem sido amplamente utilizado para estudar a anatomia e a fisiologia do processamento auditivo em...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias do tronco encefálico auditivo de embrião de galinha para uso em fisiologia celular inteira in vitro ou em culturas organotípicas de longo prazo. Isso é realizado primeiramente removendo-se o embrião do ovo. O segundo passo do procedimento consiste em dissecar o cérebro do crânio e isolar a região do tronco encefálico auditivo.O terceiro passo do procedimento é preparar fatias da região do tronco encefálico em um vioma. O passo final do procedimento é colocar as fatias do tronco encefálico em uma câmara para gravações de fisiologia, ou sobre placas Millipore para cultivo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram fatias saudáveis do tronco encefálico auditivo de embriões de galinha por meio de gravações fisiológicas ou culturas organotípicas de longo prazo.Olá, meu nome é Armand Sidle. Ambos estes métodos podem fornecer informações sobre o desenvolvimento auditivo em aves. Eles também podem ser utilizados para estudar a regeneração topográfica de éxons, a dinâmica dos dendritos, bem como as propriedades intrínsecas e sinápticas devido à estrutura e função únicas deste circuito auditivo binaural.Em geral, indivíd

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este é um protocolo para preparar e manter uma preparação fatia neocortical na cultura organotípicas com a finalidade de fazer gravações elétrica de neurônios piramidais.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

Este vídeo demonstra o processo de preparação de fatias de cérebro em forma de cunha em um ambiente de laboratório. Usando um vibratome, uma fatia em forma de cunha do cérebro de um camundongo é trabalhada com espessura variável. Esta fatia contém a raiz nervosa auditiva posicionada na extremidade mais espessa, enquanto os neurônios relacionados à audição estão localizados na extremidade mais fina.

Preparando fatias cerebrais em cunha para visualizar neurônios auditivos

O vídeo demonstra a preparação de fatias de cerebelo. Ele mostra um procedimento detalhado para isolar o cerebelo de um embrião de galinha. As fatias são então preparadas a partir do cerebelo dissecado usando um cortador de tecidos para posterior análise experimental.

Obtenção de fatias de cerebelo de um cérebro embrionário de pintinho

Cultura de lâminas de facilitar a manipulação do gene de desenvolvimento do embrião e perturbações farmacológicas. No entanto, as condições de cultura devem assegurar que o desenvolvimento normal pode prosseguir dentro do ambiente reduzido da fatia. Ilustramos um protocolo que facilita o desenvolvimento normal, medula espinhal prosseguir durante pelo menos 24 horas.

Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

Aqui descrevemos uma técnica de microdissecção seguido de injeção de corante fluorescente no gânglio acústico de embriões de galinha cedo para rastreamento seletivo das fibras auditivas axônios no nervo e rombencéfalo.

Rastreamento seletiva de fibras no nervo auditivo embrionário aviária Vestibulococlear

Oscilações são propriedades fundamentais da rede e são modulados pela doença e drogas. Estudar oscilações cérebro-slice permite a caracterização das redes isoladas em condições controladas. Protocolos são fornecidos para a preparação de fatias cerebrais agudos para evocar CA1 oscilações γ.

Geração de locais Oscilações CA1 γ por Tetânica Estimulação

A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

Os neurônios auditivos de tronco encefálico de aves e mamíferos são especializados para codificação neural rápida, um processo fundamental para funções auditivas normais. Esses neurônios surgem de precursores distintos do antígeno cervical embrionário. Apresentamos técnicas que utilizam eletroporação para expressar genes no colo de embriões de frango para estudar a função genética durante o desenvolvimento auditivo.

Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

Este protocolo visualmente se comunica a preparação de tronco cerebral-medular e clarifica a preparação de fatias transversais de tronco cerebral de uma forma abrangente e passo a passo. Ele foi projetado para aumentar a reprodutibilidade e aumentar a probabilidade de se obter fatias ritmicamente ativo, viáveis e duradouras, para gravar saída neural das regiões respiratórias do tronco cerebral.

Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina

A integração de diversas entradas sinápticas aos neurônios é melhor medida em uma preparação que preserva todos os núcleos pré-sinápticos para o tempo natural e a plasticidade do circuito, mas as fatias cerebrais normalmente cortam muitas conexões. Desenvolvemos uma fatia cerebral modificada para imitar a atividade do circuito in vivo, mantendo a capacidade de experimentação in vitro.

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de fatias de tronco cerebral auditiva não coronal do embrião de frango para a investigação de propriedades tonotópicas e trajetórias de desenvolvimento dentro de uma fatia de tronco cerebral. Essas fatias incluem seções sagita, horizontal e horizontal/transversal que abrangem regiões tonotópicas maiores dentro de um plano de fatia individual que as seções coronais tradicionais.

Fatiando o tronco auditivo de frango embrionário para avaliar gradientes tonotópicos e microcircuitos

Aprenda a preparar fatias do tronco encefálico auditivo de frango para estudos de neurofisiologia in vitro e culturas organotípicas de longo prazo. Este método preserva a integridade funcional do circuito auditivo.

Preparação e Cultura do Fatias de frango auditivo de tronco cerebral

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