Name: Infecção subcutânea de Staphylococcus aureus resistente (MRSA) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de infecção subcutânea por MRSA em camundongos para avaliar virulência bacteriana e resposta imunológica do hospedeiro. Este método permite quantificar unidades formadoras de colônias e analisar citocinas.

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Este trabalho foi financiado por um Prémio Carreira Burroughs-Wellcome e pelo National Institutes of Health conceder AI074832 a GY Liu.

1. Preparando o MRSA de Infecção (dois dias antes da infecção) <ol><li> Inocular uma loopful de MRSA de uma cultura de ações a um agar sangue (Trypticase Soy Agar (TSA)) prato. </li><li> Verificar o fenótipo hemólise (uma zona clara em torno de cada colônia) na placa de ágar sangue. </li><li> Escolha uma colônia que tem um fenótipo hemolítico que é consistente com outros experimentos. </li><li> Inocular a colônia em 3 mL Todd Hewitt Broth (THB), com o antibiótico apropriado quando necessário, em um tubo de 15 mL snap-tampado. </li><li> Incubar a 37 ° C durante a noite com agitação a 220 rpm. </li></ol> 2. Preparando o Ratos de Infecção (um dia antes da infecção) <ol><li> Dependendo do tamanho dos ratos, raspar os pêlos fora de uma área de 3 cm x 4 na parte traseira de ratos. </li><li> Aplicar ~ 5 mm 3 creme removedor de pêlos (comprado de uma loja de droga local) para a área depilada. </li><li> Permitir que o creme removedor de pêlos para incubar na superfície da pele por cerca de 1 min. </li><li> Toalhas de papel molhado com DDH 2 O. </li><li> Limpe o creme removedor de pêlos com a toalha de papel molhado. </li></ol> 3. Preparando o MRSA de Infecção (no Dia da infecção) <ol><li> Diluir a cultura bacteriana durante a noite em 1:500 para 1:1000 com 10 mL de pré-aquecido THB, em um tubo de 50 mL com tampa de rosca. </li><li> Incubar a 37 ° C por aproximadamente 2,5 horas com agitação de 220 ​​rpm, até A 540 chega a 2,5. </li><li> Coletar MRSA por centrifugação a 3225 xg por 10 min a 4 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento de bactérias em 10 mL de fosfato salina tamponada Dulbecco (DPBS). </li><li> Repita os passos 3 e 4. </li><li> Ressuspender o pellet bacteriano em DPBS na concentração desejada. </li><li> Serialmente diluir a suspensão bacteriana de 10 janeiro - 10 agosto. </li><li> Placa bacteriana diluída a suspensão em placas de agar sangue. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C durante a noite. </li><li> Observar e registrar o fenótipo hemolítico do inóculo. </li><li> Contar as Unidades Formadoras de Colônias (UFC) número da placa. </li><li> Calcular o inóculos com base no número de UFC na placa. </li></ol> 4. Infecção subcutânea de MRSA (no Dia da infecção e 3 dias pós-infecção) <ol><li> Injetar por via subcutânea 100 mL de suspensão bacteriana na área raspada. </li><li> Observar os animais de 3 a 5 horas após a injecção para se certificar de que os ratos estão vivos. </li><li> Observe a lesão nas costas dos animais diariamente e registrar a área de lesão ao dia, quando ela é necessária. Observação lesão deve incluir a gravação do tamanho da lesão e morfologia. A pele e as lesões musculares são quantificada pela multiplicação do comprimento e largura da lesão. Lesões de formato irregular precisa ser dividido em pequenos pedaços simétricos, e cada peça medida pelo mesmo método. Medições lesão também pode utilizar um assistida por computador programa de avaliação histomorfométrica (ImageJ; open-source disponível a partir do NIH em <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) 2. </li><li> Sacrifício dos animais no dia 3 pós-infecção por inalação de isoflurano seguido por deslocamento cervical. </li><li> Observar e registar a lesão na pele. </li><li> Nick a pele com uma tesoura esterilizada. </li><li> Descasque a pele fora cuidadosamente e observar e registar a lesão no músculo. </li><li> A lesão de consumo e cerca de 2-5 mm da área circundante. </li><li> Coletar baço e rins. </li><li> Homogeneizar os tecidos utilizando um homogeneizador de tecido ou pela aplicação repetida de um êmbolo de uma seringa de 1 mL para um tubo de microcentrífuga contendo o tecido e 100 mL de DPBS. </li><li> Adicionar 900 mL de DPBS a cada tubo. </li><li> Vortex as amostras por 5 min. </li><li> Serialmente diluir a suspensão com DPBS 10 janeiro - 10 junho. </li><li> Placa de suspensões diluídas em placas THA. </li></ol> 5. Resultados representativos: <ol><li> Imediatamente após cada injecção subcutânea, uma bolha será observada na superfície da pele quando a infecção é feito corretamente (Figura 1A). Se nenhuma bolha é observada na superfície da pele, a injeção pode ser muito profunda, e isso pode afetar o resultado da infecção (o tamanho da lesão, CFU). </li><li> A suspensão bacteriana precisa ser diluída em série e do UFC precisam ser examinadas em placas de ágar sangue para cada experimento. Esta etapa irá fornecer informações importantes: 1) se o inóculo têm fenótipo homogêneo; 2) a contagem de bactérias viáveis ​​exata para a infecção. </li><li> As lesões e sobrevivência bacteriana pode ser avaliada em vários pontos do tempo pós-infecção. Aqui, nós examinamos a infecção no 3 º dia pós-infecção. Os tamanhos são analisados ​​lesão na superfície da pele (Figura 1B: 1x 10 9; Figura 1D: 1 x 10 7 UFC) e na superfície do músculo (Figura 1C: 1x 10 9 7 UFC). A área de lesão é igual ao comprimento (mm) x largura (mm) podem ser medidos para avaliar o dano tecidual (Figuras 2 A e B). Este resultado pode ajudar a determinar a extensão do dano tecidual causado por um fator de virulência dado. Além disso, as lesões são retirados e homogeneizados em DPBS, e banhado para quantificar o número de CFU (Figura 2C), que indica a viabilidade da bactéria no local da infecção. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2528/2528fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A pele e as lesões musculares. CD1 camundongos foram inoculados por via subcutânea em um flanco com MRSA (LAC). Fotos foram tiradas em 0 hora e dia 3 pós-infecção. (A) Tempo 0 pós-infecção (pi), (B) - (G) 3 º dia pi; B, D. e F: lesões de pele; C, E e G: lesões musculares, B e C: 1x 10 9 CFU infectados; D e E: 1x 10 7 UFC infectados; F e G: mock. <img src="/files/ftp_upload/2528/2528fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Tamanho da lesão de pele e bactérias viáveis ​​contar no local da infecção no 3 º dia pós-infecção de pele. E lesões musculares em MRSA (LAC) CD1 infectados camundongos. (A) tamanho da lesão de pele. (B) tamanho da lesão muscular. (C) CFU tecido Total. H: 1 x 10 9 UFC inóculos; L: 1 x 10 7 UFC inóculos. *: P &lt;0,05, Mann-Whitney.

<ol><li>Ahn, J. Y., Song, J. Y., Yun, Y. S., Jeong, G., Choi, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+Staphylococcus+aureus-infected+septic+mice+by+suppression+of+early+acute+inflammation+and+enhanced+antimicrobial+activity+by+ginsan%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protection of Staphylococcus aureus-infected septic mice by suppression of early acute inflammation and enhanced antimicrobial activity by ginsan.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 46, 187-197 (2006).</li>
<li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+image+analysis+using+NIH+Image%2FImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41, 47-47 (2004).</li>
<li>Hahn, B. L., Onunkwo, C. C., Watts, C. J., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+dissemination+and+cutaneous+damage+in+a+mouse+model+of+staphylococcal+skin+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Systemic dissemination and cutaneous damage in a mouse model of staphylococcal skin infections.</a> Microb Pathog. 47, 16-23 (2009).</li>
<li>Hruz, P., Zinkernagel, A. S., Jenikova, G., Botwin, G. J., Hugot, J. P., Karin, M., Nizet, V., Eckmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD2+contributes+to+cutaneous+defense+against+Staphylococcus+aureus+through+alpha-toxin-dependent+innate+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">NOD2 contributes to cutaneous defense against Staphylococcus aureus through alpha-toxin-dependent innate immune activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12873-12878 (2009).</li>
<li>Ji, Y., Zhang, B., Van, S. F., Horn, P. W. arren, Woodnutt, G., Burnham, M. K., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+critical+staphylococcal+genes+using+conditional+phenotypes+generated+by+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of critical staphylococcal genes using conditional phenotypes generated by antisense RNA.</a> Science. 293, 2266-2269 (2001).</li>
<li>Somerville, G. A., Beres, S. B., Fitzgerald, J. R., DeLeo, F. R., Cole, R. L., Hoff, J. S., Musser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+serial+passage+of+Staphylococcus+aureus%3A+changes+in+physiology%2C+virulence+factor+production%2C+and+agr+nucleotide+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vitro serial passage of Staphylococcus aureus: changes in physiology, virulence factor production, and agr nucleotide sequence.</a> J Bacteriol. 184, 1430-1437 (2002).</li>
<li>Tseng, C. W., Kyme, P., Low, J., Rocha, M. A., Alsabeh, R., Miller, L. G., Otto, M., Arditi, M., Diep, B. A., Nizet, V., Doherty, T. M., Beenhouwer, D. O., Liu, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Panton-Valentine+leukocidin+contributes+to+inflammation+and+muscle+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin contributes to inflammation and muscle tissue injury.</a> PLoS One. 4, e6387-e6387 (2009).</li>
<li>von Kockritz-Blickwede, M., Rohde, M., Oehmcke, S., Miller, L. S., Cheung, A. L., Herwald, H., Foster, S., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+mechanisms+underlying+the+genetic+predisposition+to+severe+Staphylococcus+aureus+infection+in+the+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunological mechanisms underlying the genetic predisposition to severe Staphylococcus aureus infection in the mouse model.</a> Am J Pathol. 173, 1657-1668 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<ol><li> A pele de camundongos e modelo de infecção dos tecidos moles é uma ferramenta poderosa na avaliação de virulência in vivo de um patógeno. A patogenicidade de S. aureus na pele macia e infecção dos tecidos podem variar, dependendo de uma série de parâmetros. Estes incluem o tamanho do inóculo, fase de crescimento bacteriano, a profundidade de inoculação, idade dos camundongos, e os antecedentes do mouse genética 7, 8. Ao examinar a função de virulência usando este modelo, é fundamental para controla...

<table><tbody><tr><td>THB</td><td>VWR international</td><td>95025-314</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>agulha 27G1/2</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Sangue de Ovelha (TSA)</td><td>VWR international</td><td>90004-328</td><td></td></tr></tbody></table>

infecção subcutânea de staphylococcus aureus resistente (mrsa)

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MRSA é uma ameaça mundial à saúde pública, e MRSA pele e tecidos moles, infecções hoje respondem por mais da metade de todos os tecidos moles infecções nos Estados Unidos. Entre tecidos moles infecções, miosite, piomiosite, e fasceíte necrotizante tem sido cada vez mais relatada em associação com MRSA provenientes da comunidade. Para entender a interação entre MRSA e imunidade do hospedeiro levando a uma maior infecção grave, a disponibilidade de modelos animais é fundamental, permitindo o estudo do hospedeiro e os fatores bacterianos. Modelos de infecção vários foram introduzidas para avaliar a patogênese da S. aureus durante a infecção de pele superficial. Aqui, descrevemos um modelo de infecção subcutânea que examina a pele, subcutâneo e patologias músculo.

Pele murina e modelo de infecção dos tecidos moles é utilizado para avaliar a função de virulência de Staphylococcus aureus resistente (MRSA) e as respostas imunológico do hospedeiro. Aqui, apresentamos um modelo de infecção subcutânea por infecção da pele e tecidos moles.

Infecção subcutânea de Staphylococcus aureus resistente (MRSA)

O MRSA é uma ameaça mundial à saúde pública, e as infecções cutâneas e de tecidos moles por MRSA representam agora mais da metade de todas as infecções de tecidos moles no...

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar a sobrevivência e disseminação do staphylococcus aureus resistente à meticilina ou MA, bem como os níveis de quimiocinas e citocinas nos locais da infecção. Isso é conseguido removendo o pêlo das costas dos camundongos para permitir uma área clara de observação. Como segundo passo.MRSA em suspensão será administrado a camundongos por via subcutânea três dias após a infecção; as patologias da infecção e as contagens bacterianas podem ser avaliadas mediante a determinação do número de unidades formadoras de colônias a partir de homogeneizados teciduais em placas de ágar. Olá, como você está? Meu nome é De Lordon.Sou pesquisadora pós-doutoranda. Olá, meu nome é Mariel Sanchez. Sou aluna de doutorado e eu sou Andrea Huda.Sou pesquisador associado, fazemos parte do laboratório de George Lee no departamento de pediatria do Centro Médico Cedar-Sinai. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área médica, como a modelagem de infecções graves, incluindo miosite, polimiosite e fasciite necrosante. Embora este método possa fornecer insights sobre infecções graves de emergência, ele também pode ser aplicado a outros sistem

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