Infecção subcutânea de Staphylococcus aureus resistente (MRSA)
9 de fevereiro de 2011
Pele murina e modelo de infecção dos tecidos moles é utilizado para avaliar a função de virulência de Staphylococcus aureus resistente (MRSA) e as respostas imunológico do hospedeiro. Aqui, apresentamos um modelo de infecção subcutânea por infecção da pele e tecidos moles.
O objetivo geral do seguinte experimento é examinar a sobrevivência e disseminação do Staphylococcus aureus resistente à meticilina, ou MA, bem como os níveis de quimiocinas e citocinas nos locais da infecção. Isso é realizado removendo o pêlo das costas dos camundongos para permitir uma área clara de observação. Como segundo passo.
O MRSA em suspensão será administrado a camundongos por via subcutânea três dias após a infecção; as patologias da infecção e as contagens bacterianas podem ser avaliadas mediante a determinação do número de unidades formadoras de colônias a partir de homogeneizados teciduais em placas de ágar. Olá, como você está? Meu nome é De Lordon.
Sou pesquisadora pós-doutoranda. Olá, meu nome é Mariel Sanchez. Sou aluna de doutorado e eu sou Andrea Huda.
Sou pesquisador associado, fazemos parte do laboratório de George Lee no departamento de pediatria do Centro Médico Cedar-Sinai. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área médica, como a modelagem de infecções graves, incluindo miosite, polimiosite e fasciite necrosante. Embora este método possa fornecer insights sobre infecções graves de emergência, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o estreptococo do grupo A e outros organismos.
Além disso, podemos estudar a função e a patogênese de outros organismos que causam miosite e polimiosite. Geralmente, indivíduos novos neste procedimento podem ter dificuldades porque um dos funcionários das áreas de regulação global é altamente mutável. Se as precauções não forem tomadas, os dados coletados podem apresentar variações significativas, o que resultará em dificuldades para interpretar os dados.
Vamos começar. Em uma instalação de BSL 2, prepare uma placa de ágar sangue de ovelha em base TSA e um alça estéril utilizando um bloco congelado. Transfira a cultura estoque de Mercer para fora do armazenamento a menos 80 graus Celsius.
Em seguida, utilizando o alça estéril, retire um pequeno fragmento de gelo da cultura estoque e coloque-o na placa. Após obter um pequeno fragmento da cultura estoque Mercer, transfira imediatamente a cultura estoque de volta ao congelador para evitar o descongelamento, pois congelamentos e descongelamentos repetidos danificarão a cultura estoque. Utilize a alça para semear em risco o ágar, facilitando o crescimento de colônias individuais de Mercer.
Incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite sem suplemento de CO2. No dia seguinte, prepare e rotule uma nova placa de sangue com ovo, placa de TSA e um tubo de 15 mililitros com tampa de encaixe contendo três mililitros de THB.
Retire a placa M SSA cultivada durante a noite e examine o fenótipo hemolítico das colônias. Usando um alça estéril, escolha uma colônia que apresente um fenótipo consistente com as colônias experimentais anteriores. Inocule o THB com a colônia selecionada utilizando o mesmo esgotamento com alça.
Incube a placa com a solução THB a 37 graus Celsius durante a noite com agitação a 220 rotações por minuto. Essas bactérias serão usadas para inocular o cultivo para infecção subcutânea dos camundongos nas etapas posteriores. Coloque também a placa de ágar sangue no incubador.
A placa será usada na manhã seguinte para confirmar se o fenótipo hemolítico das bactérias na solução de THB corresponde ao da colônia originalmente selecionada. Se o fenótipo de hemólise não for consistente com o do clone original, não inicie o experimento. Transfira o camundongo para uma plataforma e retire os pelos das costas.
Se o animal for excessivamente agressivo, pode ser necessária sedação com isoflurano. Aplique aproximadamente cinco milímetros cúbicos de creme removedor de pelos, como NA, na área depilada. O NA pode ser adquirido em farmácias locais.
Certifique-se de adquirir o creme depilatório que contenha óleo de bebê, pois o produto sem o óleo de bebê será muito estimulante para os camundongos. Deixe o creme agir na superfície da pele por aproximadamente um minuto; enquanto o creme depilatório estiver agindo, umedeça algumas toalhas de papel com água duplamente destilada após um minuto. Use as toalhas de papel umedecidas para limpar a área depilada.
Certifique-se de que a pele esteja livre do creme depilatório. Aqueça previamente 10 mililitros de THB em um tubo de tampa de rosca de 50 mililitros a 37 graus Celsius em uma incubadora bacteriana por quatro a dez horas. Transfira 20 microlitros da cultura bacteriana de incubação noturna para o THB pré-aquecido. Isso diluirá a cultura noturna.
Uma suspensão na proporção de um para 500. Coloque o tubo a 37 graus Celsius em um incubador agitado a 220 rotações por minuto durante aproximadamente duas horas e meia a três horas após o período de incubação. Use mais THB para diluir ainda mais a suspensão bacteriana na proporção de um para 10 e meça a suspensão com um espectrofotômetro.
Com absorvância em 514 nanômetros. Mantenha a re-incubação da suspensão a 37 graus Celsius com agitação a 220 rotações por minuto até que a suspensão diluída de um para 10 atinja 0,25. Para coletar o M er, centrifugue o tubo de 50 mililitros a 3.225 vezes a gravidade por 10 minutos a quatro graus Celsius, descarte o sobrenadante e re-suspenda.
Suspenda a paleta bacteriana em 10 mililitros de DPBS e lave as bactérias novamente repetindo a etapa de centrifugação para este modelo de infecção grave. Re suspenda o pellet bacteriano em aproximadamente um mililitro de DPBS, resultando em aproximadamente um vezes 10 à 10 unidades formadoras de colônia por mililitro. Monte placas de sangue de ovelha A-R-T-S-A, dilua as bactérias seriamente de 10 à um até 10 à oitava potência em DPBS e plaque.
Colocar gotas de 10 microlitros da suspensão bacteriana diluída em série sobre uma placa de ágar sangue em triplicata. Incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. Após incubação das placas por 16 a 18 horas, observar e registrar o fenótipo de hemólise do inóculo.
Conte as unidades formadoras de colônia nas placas. A inoculação da infecção será calculada com base na unidade formadora de colônia. Número nas placas.
Prepare uma seringa com 100 microlitros da suspensão bacteriana em DPBS preparada anteriormente. Antes da injeção, os camundongos devem ser sedados para que sua frequência respiratória seja de aproximadamente uma vez por segundo. Para fins de demonstração, um camundongo eutanasiado é mostrado neste vídeo.
Injete o soro M em um flanco após a injeção. Devolva o camundongo à sua gaiola. Observe os animais por três a cinco horas após a injeção para garantir que o camundongo esteja vivo antes de devolvê-lo ao biotério.
Monitore diariamente as lesões nas costas dos animais após a eutanásia dos animais. Meça e registre o tamanho e o estado das lesões na pele. As áreas das lesões cutâneas e musculares são quantificadas multiplicando o comprimento e a largura da lesão em milímetros.
Lesões de formato irregular devem ser divididas em partes menores e simétricas, e cada parte deve ser medida pelo mesmo método. Prepare tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro com 100 microlitros de DPBS para coleta do tecido. Faça um pequeno corte na pele com uma lâmina de barbear estéril e excise a lesão com uma tesoura estéril.
Ao excisar a lesão, certifique-se de que cerca de dois a cinco milímetros de pele saudável ao redor da área também sejam excisados. Coloque a lesão nos tubos de coleta de tecido para analisar as lesões musculares. Remova cuidadosamente a pele para medir o tamanho e registrar a condição da lesão no tecido muscular.
Colete o baço e os rins. Coloque esses tecidos em tubos de coleta individuais separados. Homogeneíze os tecidos agitando com uma seringa de um mililitro por aproximadamente 30 segundos.
Adicione 900 microlitros de DPBS a cada tubo. Prepare as placas THA e vortexe as amostras de tecido homogeneizado por cinco minutos. Dilua a amostra em série.
As suspensões tendem a uma diluição de 10¹ a 10⁶. Em placas de 96 poços, distribua 10 microlitros de cada suspensão diluída em série sobre os poços. Incube as placas durante a noite em uma incubadora bacteriana a 37 °C.
Na manhã seguinte, conte as unidades formadoras de colônias nas placas e calcule o número de unidades formadoras de colônias com base nos fatores de diluição. Se a infecção for realizada corretamente, uma bolha será observada na superfície da pele imediatamente após a injeção subcutânea. Se nenhuma bolha for observada, a injeção pode estar muito profunda, o que pode afetar o resultado da infecção.
O tamanho da lesão e a sobrevivência bacteriana podem ser avaliados em diversos momentos após a infecção com MSA. As seguintes lesões cutâneas foram examinadas no terceiro dia após a infecção e são exemplos de lesão em um camundongo CD um infectado em um flanco com um vezes 10 elevado a sete unidades formadoras de colônia. Lesões musculares são tipicamente encontradas no tecido abaixo das lesões cutâneas.
A seguir estão exemplos das lesões musculares superficiais coincidentes com as fotos de lesões cutâneas mostradas anteriormente. Estas são lesões musculares observadas no terceiro dia após a infecção em um camundongo infectado com um vezes 10 elevado a sete unidades formadoras de colônia. A área da lesão é determinada pelo comprimento multiplicado pela largura da lesão, medida em milímetros, e pode ser quantificada para avaliar o dano tecidual da pele.
O número de unidades formadoras de colônia das bactérias localizadas no local da infecção pode ser quantificado em lesões ressecadas. A contagem de unidades formadoras de colônia pode indicar se um fator de virulência confere à MSA uma vantagem de sobrevivência. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de adotar as precauções padrão de segurança devido ao uso de agulhas e microrganismos altamente patogênicos após este procedimento.
Por último, no modelo de abscesso, utilizamos uma inócula 1.000 vezes menor em comparação com o nosso modelo, o qual pode ser usado para responder perguntas adicionais, como: quais fatores de S promovem a infecção persistente por RSA? Não se esqueça de que trabalhar com seringas cheias de um Mars A pode ser extremamente perigoso, e precauções, como descartar a seringa diretamente no recipiente de objetos perfurocortantes, são importantes para evitar perfurações acidentais pela agulha. Além disso, para este experimento, é importante seguir protocolos padrão de BSO2 para garantir a desinfecção adequada da área de trabalho.
Então é isso. Obrigado por assistir. Olá. Olá, tchau.
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Visão Geral
Este estudo utiliza um modelo de infecção em pele e tecidos moles em camundongos para avaliar a virulência de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) e as respostas imunológicas do hospedeiro. O modelo permite a análise da sobrevivência e disseminação bacteriana, bem como a avaliação dos níveis de quimiocinas e citocinas nos locais de infecção.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Imunologia
- Doenças Infecciosas
Contexto
- O MRSA é um patógeno significativo responsável por infecções da pele e dos tecidos moles.
- Compreender as interações entre hospedeiro e patógeno é essencial para o desenvolvimento de tratamentos eficazes.
- O modelo murino fornece informações sobre a resposta imune às infecções por MRSA.
- Estudos anteriores destacaram a importância das citocinas e quimiocinas na infecção.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a virulência do MRSA em um modelo de infecção controlado.
- Medir as respostas imunológicas do hospedeiro durante a infecção.
- Analisar a disseminação do MRSA e seu impacto nos tecidos do hospedeiro.
Métodos Utilizados
- Remoção de pelos das costas de camundongos para criar uma área de observação clara.
- Administração subcutânea de suspensão de MRSA aos camundongos.
- Avaliação das patologias infecciosas por meio de contagens bacterianas.
- Determinação de unidades formadoras de colônias a partir de homogeneizados teciduais em placas de ágar.
Resultados Principais
- Estabelecimento bem-sucedido de um modelo de infecção subcutânea.
- Quantificação da carga bacteriana nos locais de infecção.
- Análise dos níveis de quimiocinas e citocinas em resposta ao MRSA.
- Compreensão da dinâmica da resposta imune durante a infecção.
Conclusões
- O modelo murino é eficaz para estudar infecções por MRSA.
- As respostas imunes do hospedeiro são fundamentais para controlar a disseminação da MRSA.
- São necessárias pesquisas adicionais para explorar intervenções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Modelos in vivo robustos para infecção por MRSA são essenciais para reduzir riscos no descobrimento precoce de agentes anti-infecciosos e esclarecer as interações hospedeiro-patógeno que provocam patologia tecidual grave. Este modelo de infecção subcutânea permite a avaliação quantitativa da sobrevivência bacteriana, disseminação e resposta imune, reforçando a confiança preditiva na validação de alvos e na pesquisa translacional. A abordagem orienta decisões sobre portfólios ao fornecer resultados quantitativos reprodutíveis, relevantes para testes de hipóteses mecanicistas e terapêuticas.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de fatores de virulência do MRSA e das vias imunes do hospedeiro em um sistema controlado e relevante para a doença.
- Apoia a desmistificação biológica mediante a quantificação da sobrevivência bacteriana e da patologia das lesões in vivo.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio da medição das respostas de quimiocinas e citocinas nos locais de infecção.
- Fornece dados para orientar a confiança preditiva e o triagem de candidatos anti-infecciosos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Estabelece um modelo animal validado para triagem de eficácia e mecanismos de ação de agentes anti-MRSA.
- Fornece leituras padronizadas e quantitativas, como tamanho da lesão e contagem de unidades formadoras de colônias.
- Permite reprodutibilidade e escalabilidade para avaliação comparativa de intervenções candidatas.
- Apoia a preparação do ensaio para integração de dados entre estudos e equipes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a desfechos relevantes para a doença ao modelar infecções graves de tecidos moles observadas clinicamente.
- Oferece continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, permitindo a avaliação de biomarcadores e de alterações patológicas.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados quantitativos de infecção e resposta imune.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas em programas translacionais de agentes anti-infecciosos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo insere-se na fase de descoberta inicial até o continuum pré-clínico, permitindo testes de hipóteses, validação de alvos e avaliação translacional de estratégias anti-infecciosas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação baseada em hipóteses dos mecanismos de virulência do MRSA e da resposta do hospedeiro.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para avaliação de candidatos e padronização de ensaios.
- Análises: Permite a medição do tamanho das lesões, carga bacteriana e mediadores imunológicos para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas e validação pré-clínica com dados de patologia e biomarcadores relevantes para a doença.
- Reutilização Corporativa: Oferece uma plataforma padronizada e reutilizável para P&D de agentes anti-infecciosos em múltiplos programas e patógenos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na descoberta de agentes anti-infecciosos.
- Valor Operacional: Oferece fluxos de trabalho in vivo padronizados, escaláveis e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco dos ativos anti-infecciosos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manejo de animais, modelagem de doenças infecciosas e avaliação quantitativa de patologia.
- Requer infraestrutura de instalação BSL-2 e protocolos rigorosos de biossegurança para o manejo de MRSA.
- Necessita padronização entre equipes na preparação do inóculo, mensuração das lesões e análise de dados.
- Adaptável a outros patógenos e modelos de infecção com validação apropriada.
- Potencial para variabilidade dos dados se o fenótipo bacteriano ou a consistência dos procedimentos não forem mantidos.
