Name: Transformação do DNA plasmidial em E. coli Usando o método de choque térmico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprenda a transformação de E. coli por choque térmico a 42°C para engenharia genética. Este método introduz DNA plasmidial em células competentes para estudos de biologia molecular.

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transformação do dna plasmidial em e. coli usando o método de choque térmico

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformação do DNA plasmidial em E. coli utilizando o método de choque térmico é uma técnica básica de biologia molecular. Ele consiste na inserção de um produto estrangeiro plasmídeo ou ligadura em bactérias. Este protocolo de vídeo descreve o método tradicional de transformação usando comercialmente disponíveis quimicamente bactérias competentes de Genlantis. Após uma curta incubação no gelo, uma mistura de bactérias quimicamente competentes e DNA é colocado a 42 ° C por 45 segundos (choque térmico) e depois colocados de volta no gelo. SOC media é adicionado e as células transformadas são incubados a 37 ° C por 30 min com agitação. Para ter certeza de isolar as colônias, independentemente da eficiência de transformação, duas quantidades de bactérias transformadas são banhados. Este protocolo tradicional pode ser utilizado com sucesso para transformar a maioria disponível comercialmente bactérias competentes. O turbocells de Genlantis também pode ser usado em um protocolo de transformação romance de 3 minutos, descrito no manual de instruções.

Transformação do DNA plasmidial em E. coli Usando o método de choque térmico

A transformação de DNA plasmidial em E. coli utilizando o método de choque térmico é uma técnica básica de biologia molecular. Consiste na inserção de um...

Olá, eu sou Alex Hoge. Trabalho no laboratório do professor Hall no Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E hoje vou mostrar como transformar E. coli eletricamente competente pelo método de choque elétrico.Hoje estou usando esta técnica para transformar um coli com meu produto de ligation porque estou fazendo um prob para realizar uma imunomarcação em montagem inteira em peixe-zebra. Ok, então vamos começar a fazer a transformação. Primeiro, você precisa ter seu banho-maria ou bloco seco a 42 graus.Você precisa manter suas bactérias, recém-retiradas do estoque principal, em gelo. Hoje utilizamos células eletrocompetentes mantidas em gelo, bem como seu DNA em gelo. Além disso, você precisa de um tubo com meio SOC em temperatura ambiente ou a 37 °C e suas placas com meio LB mais antibiótico.Agora vou adicionar o DNA às bactérias. Trabalho próximo à chama para não contaminar as bactérias. Adiciono então a ligation às bactérias.São 50 microlitros de bactérias e, em seguida, imediatamente de volta ao gelo; você pode agitar levemente para misturar as bactérias com o seu DNA e deixar na geladeira por até 15 minutos. Agora, passaram-se 15 minutos e

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Biologia

Mutagênese dirigida local de plasmídeos todo é uma maneira simples de criar variações ligeiramente diferentes de um plasmídeo original. Aqui nós demonstramos uma forma fácil e de custo eficaz para introduzir substituições de base em um plasmídeo reagentes padrão usando.

Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole

Fonte: Stefan, A., et al., Os benefícios multifacetados da co-expressão de proteínas em Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o procedimento para transformar Escherichia coli com um plasmídeo portador de um gene de resistência a antibióticos, incluindo preparação celular, eletroporação, recuperação e seleção de transformantes.

Preparação e transformação de bactérias usando eletroporação de alta tensão

Este protocolo demonstra a atividade de chaperona da proteína de choque térmico 70 (Hsp70). As células de E. coli dnaK756 servem de modelo para o ensaio, pois abrigam uma Hsp70 nativa funcionalmente prejudicada, tornando-as suscetíveis ao estresse térmico. A introdução heteróloga de Hsp70 funcional resgata a deficiência de crescimento das células.

Ensaio de Complementação Baseado em Escherichia coli para Estudo da Função Chaperone da Proteína de Choque Térmico 70

A montagem in vivo é um método de clonagem independente de ligação que depende de enzimas intrínsecas de reparo de DNA em bactérias para montar fragmentos de DNA por recombinação homóloga. Este protocolo é eficaz em termos de tempo e custo, uma vez que são necessários poucos reagentes e a eficiência da clonagem pode chegar aos 99%.

Uso de montagem in vivo para construção de plasmídeo de alta eficiência

Este artigo descreve uma metodologia para superexpressar Nsp15 recombinante, uma nuclease tóxica, em um sistema de expressão C41 (DE3), seguido de purificação da proteína marcada utilizando cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas tóxicas desafiadoras.

Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli

Purificação de DNA plasmidial colônias bacterianas Usando o Kit Qiagen Miniprep

Este trabalho mostra como formar um híbrido RNA / DNA no nível cromossômico e revelar transferência de informação genética do RNA para DNA genômico em células de levedura.

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Nós apresentamos um procedimento pelo qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar a estrutura de intermediários de replicação que ocorrer após a irradiação UV.

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Este protocolo é uma alternativa rentável para o esclarecimento paralela eficiente e purificação de DNA plasmidial...

Purificação simplificada do DNA plasmidial das culturas Procarióticas

Aqui demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante para uma seqüência alvo. Nós mostramos como esse método, que é realizado in vivo em Escherichia coli, pode ser acoplado com seleções funcional para evoluir novas atividades enzimáticas.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

Aprenda a transformação de E. coli por choque térmico a 42°C para engenharia genética. Este método introduz DNA plasmidial em células competentes para estudos de biologia molecular.

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