Transformação do DNA plasmidial em E. coli Usando o método de choque térmico

Olá, sou Alex Hoge. Eu trabalho na academia Hall Lab no Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E hoje vou mostrar como transformar E. coli eletricamente competente pelo método de cada choque.

Então, hoje estou usando essa técnica para transformar uma coli com meu produto de lação porque estou fazendo um problema para fazer uma montagem inteira em peixe-zebra. Ok, então vamos começar a fazer a transformação. Então, primeiro você precisa ter seu banho-maria ou ônibus seco a 42 graus.

Você precisa ter suas bactérias que você acabou de tirar da cidade principal no gelo. Hoje usamos células de competência elétrica de idades e também seu DNA no gelo. Além disso, você precisa de tubo de mídia SOC em temperatura doméstica ou 37 e suas placas de LV mais mídia antibiótica.

Então agora vou adicionar o DNA com a bactéria. Então eu trabalho ao lado da chama para não contaminar as bactérias. Então eu adiciono lação com as bactérias.

São 50 microlitros de bactérias e, imediatamente de volta ao gelo, você pode sacudir um pouco para misturar as bactérias e seu DNA e deixar por até 15 minutos no gelo. Então, agora 15 minutos se passaram e estamos prontos para fazer o choque térmico, que é colocar as bactérias a 42 graus por 45 segundos. Então eu tiro os tubos do gelo diretamente a 42 graus, 30 temporizadores em 45 segundos, e então vou colocá-los de volta no gelo muito rápido e colocá-los fora de 42 diretamente no gelo.

E então esperamos dois minutos. Então agora vou adicionar o meio SOC às bactérias e colocá-los em 37 por 30 minutos. Então eu vaporizo 500 microlitros da mídia SOC e coloco nas bactérias e as coloco na minha pequena câmara improvisada.

Portanto, se você for usar tubos eend e câmara improvisada para sua incubadora, certifique-se de colocar seus tubos eend na horizontal, pois eles tremerão muito melhor assim. Então agora estamos prontos para colocar os tubos no agitador. É por isso que temos essa pequena câmara a 37 graus por 30 minutos.

Então, agora terminamos a incubação a 37 graus e vamos colocar as bactérias em lb mais antibióticos. Então, no meu caso, é o cloral. Então, em 50 microlitros de cada amostra e coloquei na placa.

Então, com os 500 microlitros restantes, você os gira em uma pequena mesa, alguns se recusam a descascar as bactérias. Então, após a ificação, obtemos um bom pellet e o que vamos fazer agora é remover quase todos os meios SOC, basta deixar 50 microlitros e então podemos colocar esses 50 microlitros de bactérias concentradas. Então eu pago aproximadamente 450 microlitros.

Eu apenas deixo isso. Então agora vou suspender o palete nos 50 microlitros restantes da mídia SOC. E depois disso, posso colocar esses 50 microlitros em outro prato.

Então eu resisto a cada palete, então eu fantoche e coloco no prato. Portanto, haverá no final duas placas por amostra. Então agora temos que espalhar as bactérias na placa LB.

Então, vou usar algumas contas de vidro em autoclave, mas você também pode usar um tubo que você molda em um espalhador assim. Então, vou colocar algumas contas na placa de Petri. Eu gosto disso.

Bem, 10 15. Então, depois de adicionar as contas, você coloca todos os seus pratos em uma pilha como essa e os agita suavemente para que as contas espalhem as bactérias uniformemente nos pratos. Então, enquanto eu movo as placas até que estejam secas.

Então, o que significa que você não deve ver grandes listras de líquido ao se mover com as contas. Por exemplo, nessa placa, as contas tendem a colapsar juntas e ver muitas estrias. É suor aquele, as contas se movem livremente, aquele está seco.

Então agora os pratos estão secos para que possamos descartar as contas. Então eu apenas faço a atração assim para que você possa reciclá-los. Então agora vamos colocar a placa na incubadora aos 37 durante a noite, e você coloca as placas de cabeça para baixo após 12 horas de incubação aos 37, tiramos a placa da incubadora.

E como podemos ver, temos menos colônias na placa onde eu a coloco 50 microlitros do que na placa onde eu coloquei o resto. O que é importante quando você transforma bactérias é ter a quantidade certa de colônias em seu prato, a densidade certa. Então, neste lugar você tem muito poucas colônias, mas se você quiser mais colônias, você pode ter o bom exemplo nesta placa, onde é exatamente a densidade certa, aproximadamente 100 colônias por placa.

Esta placa é um mau exemplo porque há muitas colônias e você não pode escolher colônias individuais. Então, acabei de mostrar como transformar e coli a cada transformação. Portanto, o aspecto muito importante dessa técnica é manter tudo ou gelado antes do choque.

Então 45 segundos normais, mais a 42 graus de volta ao gelo. E então todo o resto tem que estar a uma temperatura quente ou 37 graus. Então agora vou rastrear minhas colônias por triagem de PCR.

Então, um dos pontos também é ter duas placas. Então, primeiro, esperamos ter muitas colônias e uma colônia a menos. E o importante é deixar seus pratos bem secos com o uso de miçangas ou o tubo passado.

Obrigado por assistir e boa sorte com sua confirmação.