Transformação do DNA plasmidial em E. coli Usando o método de choque térmico

Olá, eu sou Alex Hoge. Trabalho no laboratório do professor Hall no Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E hoje vou mostrar como transformar E. coli eletricamente competente pelo método de choque elétrico.

Hoje estou usando esta técnica para transformar um coli com meu produto de ligation porque estou fazendo um prob para realizar uma imunomarcação em montagem inteira em peixe-zebra. Ok, então vamos começar a fazer a transformação. Primeiro, você precisa ter seu banho-maria ou bloco seco a 42 graus.

Você precisa manter suas bactérias, recém-retiradas do estoque principal, em gelo. Hoje utilizamos células eletrocompetentes mantidas em gelo, bem como seu DNA em gelo. Além disso, você precisa de um tubo com meio SOC em temperatura ambiente ou a 37 °C e suas placas com meio LB mais antibiótico.

Agora vou adicionar o DNA às bactérias. Trabalho próximo à chama para não contaminar as bactérias. Adiciono então a ligation às bactérias.

São 50 microlitros de bactérias e, em seguida, imediatamente de volta ao gelo; você pode agitar levemente para misturar as bactérias com o seu DNA e deixar na geladeira por até 15 minutos. Agora, passaram-se 15 minutos e estamos prontos para realizar o choque térmico, que consiste em colocar as bactérias a 42 graus por 45 segundos. Então, retiro os tubos do gelo e coloco-os diretamente em banho a 42 graus, aciono o cronômetro para 45 segundos e, em seguida, devolvo-os rapidamente ao gelo, tirando-os imediatamente do banho a 42 e colocando-os diretamente sobre o gelo.

E então esperamos por dois minutos. Agora vou adicionar o meio SOC às bactérias e incubá-las a 37 °C por 30 minutos. Então pipeto 500 microlitros do meio SOC e adiciono às bactérias, colocando-as na minha pequena câmara improvisada.

Portanto, se você for usar tubos eppendorf e uma câmara improvisada para seu incubador, certifique-se de colocar os tubos eppendorf na posição horizontal, pois eles irão agitar muito melhor dessa forma. Agora estamos prontos para colocar os tubos no agitador. Assim, mantemos essa pequena câmara a 37 graus por 30 minutos.

Agora terminamos a incubação a 37 graus e vamos semear as bactérias em lb mais antibióticos. No meu caso, é cloranfenicol. Então, em cada amostra, coloco 50 microlitros e aplico na placa.

Então, com os 500 microlitros restantes, centrifugue-os em uma pequena centrífuga de bancada, algumas vezes necessária para remover o resíduo bacteriano. Após a centrifugação, obtemos um bom pellet e, agora, vamos remover quase todo o meio SOC, deixando apenas 50 microlitros, para então semear esses 50 microlitros de bactérias concentradas. Então, retirei aproximadamente 450 microlitros.

Eu deixo apenas isso. Agora vou suspender o pellet nos 50 microlitros restantes de meio SOC. E depois disso, posso semear esses 50 microlitros em outra placa.

Então, eu resisto a cada placa, depois a manipulo e a plaqueio. Assim, ao final, haverá duas placas por amostra. Agora precisamos espalhar as bactérias na placa de LB.

Então, vou usar algumas perlas de vidro autoclavadas, mas você também pode usar uma alça de vidro que modele como espalhador assim. Vou colocar algumas perlas na placa de Petri. Gosto disso.

Bem, 10 15. Depois de adicionar as esferas, coloque todas as placas em uma pilha como essa e agite-as suavemente para distribuir as esferas e espalhar as bactérias uniformemente por toda a superfície das placas. Assim, movimento as placas até que sequem.

Portanto, isso significa que você não deve ver grandes manchas de líquido ao movimentar as esferas. Por exemplo, nessa placa, as esferas tendem a se agrupar e apresentar muitas manchas. Essa está úmida, as esferas se movem livremente; essa outra está seca.

Agora as placas estão secas, então podemos descartar as esferas. Então, basta puxar assim para que você possa reciclá-las. Agora vamos colocar a placa no incubador a 37 °C durante a noite e você coloca as placas de cabeça para baixo. Após 12 horas de incubação a 37 °C, retiramos a placa do incubador.

E, como podemos ver, temos menos colônias na placa onde plantei 50 microlitros do que na placa onde plantei o restante. O que é importante quando você transforma bactérias é ter a quantidade correta de colônias na sua placa, a densidade adequada. Nesta placa, você tem muito poucas colônias, mas se desejar mais colônias, pode observar o bom exemplo nesta outra placa, onde a densidade é exatamente a ideal, aproximadamente 100 colônias por placa.

Esta placa é um mau exemplo porque há muitas colônias e você não consegue selecionar colônias individuais. Então, acabei de mostrar a você como transformar E. coli por cada transformação. Assim, o aspecto muito importante desta técnica é manter tudo gelado antes do choque térmico.

Então, 45 segundos em temperatura normal, mais 42 graus, depois de volta ao gelo. E então todo o resto deve ser mantido em temperatura morna ou a 37 graus. Agora vou triar minhas colônias por triagem por PCR.

Então, um dos pontos também é ter duas placas. Em uma, espera-se obter muitas colônias, e na outra, menos colônias. E o importante é que suas placas estejam bem secas, utilizando-se de contas ou da técnica de pipetagem repetida.

Obrigado por assistir e boa sorte com sua confirmação.