Name: Administração passiva de anticorpos monoclonais contra H. capsulatum E outros patógenos fúngicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a administrar anticorpos monoclonais passivamente contra Histoplasma capsulatum em camundongos C57BL/6. Este método avalia a eficácia protetora da imunidade humoral na histoplasmose.

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1. Crescimento de H. Capsulatum <ol><li> Prepare um gabinete de biossegurança para o trabalho com o fungo com a limpeza do gabinete com lixívia a 10%, seguido por 20 min de irradiação UV. H. capsulatum na fase leveduriforme Biossegurança exige nível práticas (BSL) II, enquanto a forma de moldes requer BSLIII. Use o formulário de leveduras nas etapas seguintes. </li><li> Em seguida preparar um tubo cônico de 15 ml com 5 ml de PBS. Colheita uma colônia de H. capsulatum (linhagem ATCC Hc G217B) de uma placa de agar sangue BHI [glicose a 10 g / L, cisteína 0,1 g / L, a penicilina-estreptomicina 1% e os carneiros células vermelhas do sangue 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, EUA) ] cultivadas a 37 ° C ou tomar uma alíquota do estoque de fermento congelado a -80 ° C e adicioná-lo à PBS. Vortex vigorosamente as células e centrifugar para 1100 xg por 10 min em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicionar 10ml de PBS fresco. Repita este procedimento três vezes. Suspender as células em 5 mL de PBS e tranfer para um tubo cônico de 50 mL. </li><li> Para perturbar as células agregadas, passe a suspensão de células de levedura por meio de um G1 26 / 2 agulha u cantar uma seringa de 10 mL 5 vezes em uma cabine de segurança biológica (usando proteção facial). Para isolar o fermento, pequeno de tamanho uniforme, centrifugar as células a 55 xg por 1 min em temperatura ambiente e depois remover o top 1 ml. </li><li> Adicione a suspensão celular para um erlenmeyer estéril, contendo 100 ml de meio HAM F12 (GIBCO) suplementado com 16g / L de glicose, 1 g / L de ácido glutâmico, 8.4mg / L cistina, 6g / L de ácido glutâmico e, em seguida, as células crescem a 37 ° C por 48 h em uma incubadora com agitação 150rpm. </li></ol> 2. Hibridoma Crescimento e Purificação de anticorpos monoclonais <ol><li> Transferir os hibridomas selecionados para DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, NCTC 10%, 1% não-aminoácidos essenciais e 1% penicilina-estreptomicina. Cultivar as células em um frasco de cultura de células (Becton Dickinson) por 5-7 dias a 37 ° CO C / 5% 2. </li><li> Em seguida, centrifugar a média em 1100 xg por 10 min à temperatura ambiente e recolher todas as sobrenadante sem perturbar as pelotas. </li><li> Em seguida, purificar o sobrenadante livre de células usando uma proteína A / G resina por FPLC. </li><li> A concentração mAb pode então ser calculada por um ELISA de captura (1) usando um controle de isotipo IgG como padrão (Figura 1B). </li></ol> 3. Preparação do inóculo Histoplasma capsulatum <ol><li> Dê uma 48 h Histoplasma capsulatum (Hc estirpe ATCC G217B) cultura fase de levedura cultivada em meio HAM F-12. </li><li> Centrifugar as células a 1100 xg por 10 min. Desprezar o sobrenadante e adicionar PBS fresco. </li><li> Repita o procedimento 3 vezes 3,2. </li><li> Passe a suspensão de células de levedura 5 vezes através de uma agulha 26G1 / 2, utilizando uma seringa. </li><li> Centrifugar a suspensão a 55 xg por 1 min a clusters pellet celular residual. Transferir o sobrenadante contendo a suspensão única célula para um novo tubo. </li><li> Enumerar a suspensão de células usando uma única hematocytometer. </li><li> Ajustar a concentração de células, a fim de atingir 1,25 x 10 7 levedura (sobrevivência) ou 5,0 x 10 6 (CFU, citocinas e histologia) em um Suspenção de &lt;mL 50 (Figura 2). </li></ol> 4. Administração intraperitoneal da MAbs <ol><li> Pegar o rato pelo rabo e da nuca do pescoço (Fig. 3A). Imobilizar o mouse pela nuca de seu pescoço tão perto theears possível (certifique-se de assumir a pele suficiente para que o mouse cannotturn sua cabeça para morder a pessoa manuseá-lo; Figura 3B e 3C). </li><li> Estabilizar o dedo withthe rabinho suavemente pressionado contra a palma da mão (Figura 3D). </li><li> Swab a zona da injecção com etanol 70% antes de colocar a agulha e para aspirar a olhar para o sangue antes de injetar. </li><li> Use o 26G1 / 2 a piercethe pele e abdominalmuscles para injectar a solução mAb contendo 500μg (PBS, isotipo de anticorpo de controle ou o mAb a serem testadas, diluídas em 1 mL PBS) em esquerda thelower ou quadrante inferior direito abdominal (cavidade intraperitoneal), com o animal na cabeça para baixo, tomando cuidado para evitar os órgãos internos andother diafragma (Figura 3E). </li><li> Esperar um pouco antes de retirar o needleto reduzir a probabilidade de vazamentos. </li><li> Espere um mínimo de duas horas antes de prosseguir para a próxima etapa. </li></ol> 5. Anestesia do mouse e Infecções intranasal <ol><li> Prepare a anestesia com ketamina e xilazina a 100 mg / Kg e 10 mg / Kg, respectivamente. Executar a administração intraperitoneal de PBS, isotipo de anticorpo controle, ou anticorpos experimental, conforme descrito no protocolo escrito que o acompanha. Esperar duas horas após a injeção de mAb antes de anestesiar o rato e prosseguir com a infecção intranasal. Prepare anestesia com quetamina e xilazina a 100 mg / Kg e 10 mg / kg, respectivamente (7). </li><li> Durante o período de 2h de espera, prepare o inóculo capsulum Histoplasma, conforme descrito no protocolo escrito que o acompanha. </li><li> Proceder de acordo com os itens 5,1-5,5. Toe pitada os animais com uma pinça e verificar a ausência de reflexo e confirmam que a anestesia funcionou. Anaesthetization Depois, gentilmente suspender o mouse por seus dentes da frente a uma corda de nylon ou algodão. Use 2 está coluna para amarrar as cordas, a fim de suspender os animais. </li><li> Lentamente administrar cerca de 50 mL de inóculo em um nare usando uma micropipeta, enquanto monitorando de perto a taxa de rato respiração. Permitir que o mouse para descansar nesta posição por 2-5 min após a infecção intranasal para facilitar a deposição da levedura nos pulmões do animal (Figura 3F). </li><li> Depois de o rato tenha sido infectado, manter o mouse em um ambiente monitorado quente (temperatura entre 25 e 37 ° C), com cuidado, utilizando uma lâmpada de calor, se necessário, até que ele se recupera da anestesia. Quando o desperta mouse, devolvê-lo para uma gaiola limpa, com acesso ad libitum à água e comida. As gaiolas são devolvidos para as nossas instalações de animais e mantidos em uma sala de animal limpo (BLSI). </li></ol> 6. Estudos de sobrevivência <ol><li> Avaliar os animais infectados e mock-infectados clinicamente por taquipnéia, letargia, obnubilação e perda de peso. Os animais devem ser verificados duas vezes por dia por membros de laboratório e diariamente por guardas Animal. </li><li> Com histoplasmose murina, até perto do fim da vida, normalmente há nenhum sinal aparente de infecção que não seja um ligeiro aumento da taxa de respiração. Com doença avançada, o que geralmente acontece a partir de 10-11 dias, os ratos tornaram-se significativamente taquipnéicos e têm atividade diminuída. Normalmente, eles rapidamente se tornam moribunda e expirar. </li><li> Afligido animais devem ser sacrificados de forma adequada com CO 2 em uma câmara dedicada, falecido animais devem ser enumeradas diária. </li></ol> 7. Estudos Estudos CFU Histologia e Citocinas <ol><li> Prepare 15 ml tubos cônicos de 10 mL com PBS para cada órgão a ser coletado. </li><li> Euthanize animais 7 e 14 dias após a infecção com um inuculum subletais (5,0 x 10 6), como demonstrado anteriormente e remover o baço, pulmão e fígado imediatamente. </li><li> Remover um pedaço do órgão a ser avaliado e realizar a fixação em formol durante a noite. As seções serão examinadas sob o microscópio para avaliação patológica. </li><li> Prepare 50 ml tubos cônicos com PBS 5 mL coberto com 70 filtros de células mm para cada órgão a ser homogeneizados. Macerar cada parcela restante dos órgãos, separadamente para os 50 mL utilizando tubos êmbolos seringa estéril 5mL. </li><li> Em seguida, em série diluir homogeneizados de órgãos (1:100, 1:1000 e 1:5000) e 100μL placa de cada diluição em placas BHI-ágar sangue (2). </li><li> Adicionar comprimidos de inibidor de protease para o homogeneizados de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha). </li><li> Incubar as placas a 37 ° C por até 14 dias e UFC enumerar. </li><li> Centrifugar a homogeneizados de órgãos em 4000xg por 10 min e retire sobrenadantes órgão, whish será usado em usados ​​nos ensaios de citocinas realizada por métodos padronizados de acordo com o fabricante. </li></ol> 8. Proteção anticorpo monoclonal contra H. Capsulatum é dependente e Especificidade de Anticorpos do isotipo <ol><li> O mAb isotipo é fundamental na proteção contra H. capsulatum, como camundongos tratados com IgG1 ou IgG2a mAbs a Hsp60 têm sobrevida significativamente prolongada em comparação com camundongos controle recebendo um mAb IgG2b a Hsp60 ou seja um isotipo controle mAb ou PBS (Figura 4). </li><li> Além disso, em camundongos que receberam anticorpos monoclonais de proteção, houve uma redução significativa no número de CFU pulmonar e esplênica no dia 7 e diminui de 2 e 2,5 unidades log de números de levedura nos pulmões no dia 14 (Figura 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Crescimento do H. capsulatum e hibridomas. (A) preparação líquida HAM F-12 cultura a partir de uma única colônia obtida H. capsulatum cultivadas em placas de BHI ágar-sangue. (B) o crescimento Hibridoma em frascos de cultura de células e purificação mAb pela proteína A / G resina cromatografia de afinidade usando. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: H. capsulatum preparação do inóculo para a infecção intranasal. Suspensão de células obtidas após H. interrupção agregados capsulatum por seringa e centrifugação é enumerado pela contagem em um hemocitômetro. Concentração de células é ajustado para 1,25 x 10 7 (experimentos de sobrevivência) ou 5 x 10 6 (UFC, citocinas e histologia) em &lt;mL 50. upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" Figura 3 "/&gt; Figura 3: manuseio do mouse durante mAb administração. (A) O mouse é pego pelo rabo e (B e C) imobilizada segurando a nuca de seu pescoço tão perto theears. (D) A cauda é realizada entre o dedo mindinho e na palma. (E) A solução mAb é injetado com uma agulha 26G1 / 2. (F) O H. capsulatum inóculo é administrada por via intranasal com cuidado pipetando suspensão de células em um nare. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: MAbs a Hsp60 pode alterar a patogênese da histoplasmose. injeções ip com 500 mg de IgG1, IgG2a mAbs ou 2 h antes para a sobrevivência de infecção significativamente prolongada (p &lt;0,05, em comparação com controles), mas um IgG2b mAb. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: determinações CFU nos pulmões, 7 e 14 dias após um desafio subletais intranasal com 5x10 6 leveduras Hc de camundongos tratados com ip mAbs selecionados para Hsp60 ou mAb irrelevante mostrou redução na carga fúngica para IgG1 e IgG2a mAbs animais tratados. Barras pretas representam UFC no dia 7 e barras brancas 14 dias pós-infecção (* p &lt;0,001 em 7 dias e ** p &lt;0,001 em 14 dias após a infecção).

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui apresentado demonstra que mAb de H. capsulatum pode modificar o curso de histoplasmose murina experimental. MAbs aos antígenos de superfície celular de patógenos pode modificar a dinâmica complexa que ocorrem durante a interação entre um host e um patógeno. Este estudo estabelece que mAbs mediar proteção em um modelo murino de histoplasmose letal quando injetada por via intraperitoneal, e sugere proteínas candidato para o desenvolvimento de vacinas, como H2B, M antígeno (superfície catalase) (3...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome de Material </th><th> Companhia </th></tr><tr><td> Cabines de segurança biológica (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 mL tubos cônicos </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> HAM médio F-12 </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C shaker </td><td></td></tr><tr><td> Vórtice </td><td></td></tr><tr><td> 50 mL tubos cônicos </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 agulha </td><td> BD </td></tr><tr><td> Seringa de 10 mL </td><td> BD </td></tr><tr><td> Balões de 250 ml </td><td></td></tr><tr><td> FPLC sistema (cromatografia líquida de rápida proteína) </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> Leitor de ELISA </td><td> Biotek </td></tr><tr><td> Anestesia (ketamina e xilazina) </td><td></td></tr><tr><td> Coluna está </td><td></td></tr><tr><td> Corda de nylon </td><td></td></tr><tr><td> Lâmpada de calor </td><td></td></tr><tr><td> 70μm filtros celular </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> Agar placas BHI </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

administração passiva de anticorpos monoclonais contra h. capsulatum e outros patógenos fúngicos

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

O objetivo do uso desta metodologia é 1) para avançar a nossa capacidade de proteger os indivíduos com anticorpo ou vacina para prevenir ou tratar histoplasmose causada pelo fungo Histoplasma capsulatum e 2) para examinar o papel de fatores de virulência como alvo para a terapia. Para gerar mAbs, os camundongos são imunizados, as respostas imunes são avaliados através de um sistema de ELISA em fase sólida desenvolvido em nosso laboratório, ea melhor resposta ratos são selecionados para isolamento de esplenócitos para a fusão com células de hibridoma. Camundongos C57BL / 6 têm sido amplamente utilizados para estudar H. patogênese capsulatum e fornecer o melhor modelo para a obtenção dos dados necessários. A fim de avaliar o papel do mAbs em infecção, os ratos são administrados por via intraperitoneal com um mAb para H. capsulatum ou combinados isotipo controle mAb e infectados por um ou outro intravenosa (iv), intraperitoneal (ip), ou intranasal (in) rotas. Na literatura científica, a eficácia de mAbs para infecções fúngicas em camundongos depende de mortalidade como um ponto final, em conjunto com unidades formadoras de colónias formin (CFU) avaliações em momentos anteriores. Sobrevida (tempo de morte) são necessários estudos em que melhor representam a doença humana. Assim, a eficácia da nossa intervenção não ser adequadamente estabelecida sem curvas de sobrevivência. Isto também é verdade para estabelecer a eficácia da vacina ou teste de mutantes para a virulência. Com histoplasmose, os ratos vão frequentemente de ser energético para mortos durante várias horas. A capacidade de uma intervenção como a administração de um mAb podem, inicialmente, proteger um animal de doença, mas a doença pode recaída que não seria realizado em experimentos de curta UFC. Além de sobrevivência e ensaios de carga fúngica, examinamos as respostas inflamatórias à infecção (histologia, recrutamento celular, as respostas de citocinas). Para a sobrevivência / hora para experiências de morte, os camundongos são infectados e monitoradas pelo menos duas vezes por dia para sinais de morbidade. Para avaliar a carga fúngica, histopatologia, e as respostas de citocinas, os ratos são sacrificados em vários momentos após a infecção. Experiências com animais são realizadas de acordo com as diretrizes do Instituto de Estudos Animal do Albert Einstein College of Medicine.

Camundongos C57BL / 6 foram usados ​​para estudar a patogênese Hc e fornecer o melhor modelo. Estamos explorando os benefícios potenciais da imunidade humoral contra este fungo e gerou várias mAbs [a histona H2B e um calor 60kDa proteína de choque] que testamos para sua eficácia protectora após a administração intraperitoneal.

Administração passiva de anticorpos monoclonais contra H. capsulatum E outros patógenos fúngicos

O objetivo da utilização desta metodologia é 1) ampliar a nossa capacidade de proteger indivíduos com anticorpos ou vacinas para a prevenção ou tratamento de ...

O objetivo geral deste procedimento é aprimorar nossa capacidade de proteger indivíduos com anticorpos ou vacinas para prevenir ou tratar a histoplasmose, bem como examinar o papel dos fatores de virulência na patogênese da doença. Isso é realizado primeiramente isolando e caracterizando anticorpos monoclonais contra antígenos-alvo. O segundo passo do procedimento consiste em administrar os anticorpos monoclonais selecionados por via intraperitoneal duas horas antes da infecção intranasal.Para que essas moléculas tenham tempo de se distribuir por todo o organismo, o terceiro passo do procedimento é anestesiar os camundongos e infectá-los por via intranasal com o inóculo desejado. O passo final do procedimento é monitorar a saúde dos animais. Os animais são sacrificados em diferentes intervalos para determinar as cargas fúngicas e avaliar as respostas inflamatórias ou são acompanhados quanto à sobrevida.Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram uma prolongação da sobrevida e uma modificação das respostas patológicas nos órgãos afetados de camundongos infectados letalmente. Através da administração peritoneal dos anticorpos monoclonais protetores antes da infecção, o procedimento será demonstrado por Ally Emer, uma pesquisadora pós-doutoranda com ampla experiência em patogênese fúngica e modelos de infecção animal. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como os medicamentos antifúngicos, é que os anticorpos monoclonais são moléculas com propriedades terapêuticas que atuam por meio do engajamento do fator potencial do hospedeiro. A demonstração visual da resposta à doença é fundamental.A administração de anticorpos monoclonais e os passos de infecção intranasal são difíceis de aprender porque exigem experiência no manejo dos animais. Prepare uma cabine de segurança biológica nível dois para trabalho com o fungo na forma de levedura limpando a cabine com água sanitária, seguido por irradiação com UV. Prepare um tubo cônico de 15 mililitros com cinco mililitros de PBS.Colha uma colônia de H caps AUM a partir de uma alíquota do estoque, congelada a menos 80 graus Celsius, e adicione ao vórtex de PBS. Vortexie vigorosamente e centrifugue a 1100 ×g por 10 minutos. À temperatura ambiente, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e adicione pelo menos 10 mililitros de PBS fresco.Repita este procedimento três vezes após a lavagem final. Ressuspenda as células em cinco mililitros de PBS. Todas as lavagens devem ser realizadas à temperatura ambiente. Para desagregar as células, passe as células de levedura através de uma agulha de 26 gauge e meio usando uma seringa de 10 mililitros por cinco vezes, coletando as células de levedura em um tubo cônico de 50 mililitros.Para isolar leveduras pequenas e uniformes, centrifugue as células a 55 vezes G durante um minuto e, em seguida, remova o primeiro mililitro superior. Adicione a suspensão celular a um frasco erlenmeyer de vidro estéril de 250 mililitros contendo 100 mililitros de meio ham, F 12, e cultive as células a 37 graus Celsius por 48 horas em um incubador com agitação na concentração ambiente de dióxido de carbono. Esse cultivo será usado para preparar o inóculo, e a eficácia dos anticorpos monoclonais gerados na próxima etapa será avaliada.Cultive os hibridomas selecionados em DMEM após cinco a sete dias. Após a incubação, colete os anticorpos reunindo todo o meio do frasco de cultura celular e, em seguida, centrifugue o meio a 1100 × g por 10 minutos. Da mesma forma que com as células de levedura, os anticorpos podem ser lavados à temperatura ambiente.Colete o sobrenatante sem perturbar os pellets. Em seguida, purifique o sobrenatante livre de células usando uma resina de proteína AG por captura F-P-L-C-A. O Eli SA é utilizado para calcular a concentração do anticorpo monoclonal, a fim de determinar a quantidade do anticorpo purificado que deve ser injetada.Realize a administração intraperitoneal de anticorpo controle de isotipo PBS ou anticorpo experimental conforme descrito no protocolo escrito acompanhante. Aguarde duas horas após a injeção do anticorpo monoclonal antes de anestesiar o camundongo e prosseguir com a infecção intranasal durante o período de espera. Prepare o inóculo de Histoplasma capsulatum conforme descrito no protocolo escrito acompanhante e monte o aparato com cordão para infecção do camundongo amarrando firmemente um cordão de náilon ou algodão entre dois suportes verticais e, em seguida, separando os suportes de modo que o cordão fique tenso.A anestesia com cetamina a 100 miligramas por quilograma e xilazina a 10 miligramas por quilograma. Também pode ser preparada neste momento, quando os anticorpos tiverem tido tempo suficiente para se dispersar. Anestesie o camundongo e confirme a sedação pela ausência de resposta ao aperto nos dedos dos pés.Pinçar com pinça. Suspenda suavemente o camundongo pelos dentes da frente na corda. Administre lentamente aproximadamente 50 microlitros de inóculo no ar usando uma micropipeta.Enquanto monitora atentamente a frequência respiratória do camundongo, deixe o animal descansar nesta posição por dois a cinco minutos após a infecção intranasal para facilitar a deposição do fungo nas pulmões do animal após a infecção. Mantenha o camundongo em um ambiente aquecido e monitorado, utilizando cuidadosamente uma lâmpada de aquecimento, se necessário, até que se recupere da anestesia.Quando o camundongo acordar, devolva-o a uma gaiola limpa. Com acesso ad libitum a alimento e água, avalie clinicamente os animais infectados e os animais controle não infectados. Em caso de taquipneia, letargia acentuada e perda de peso, os animais devem ser examinados duas vezes ao dia pelos membros do laboratório e diariamente pelos cuidadores dos animais.Com murn histoplasmose até quase o final da vida, geralmente não há sinais aparentes da infecção, exceto um leve aumento na frequência respiratória. Com a doença avançada, os camundongos ficam significativamente decaídos e apresentam atividade reduzida. Normalmente, eles rapidamente pioram e morrem.Animais em sofrimento devem ser eutanasiados adequadamente com dióxido de carbono em uma câmara dedicada. A morte confirmada pela ausência de resposta reflexa ao aperto dos dedos dos pés nos animais cessados deve ser contabilizada diariamente.Prepare tubos c&ocirc;nicos de 15 mililitros com 10 mililitros de PBS para cada &oacute;rg&atilde;o a ser coletado. Eutanizie os animais infectados com o in&oacute;culo subletal cinco vezes 10 &agrave; sexta pot&ecirc;ncia. As c&eacute;lulas levedur&iacute;foras conforme previamente demonstrado e remova imediatamente os pulm&otilde;es, ba&ccedil;os e f&iacute;gados. Prepare tubos c&ocirc;nicos de 50 mililitros com cinco mililitros de PBS.Monte uma placa de Petri com peneiras de células de 70 mícrons para cada órgão a ser homogeneizado. Macere cada órgão separadamente com êmbolos de cinco mililitros e transfira para tubos de 50 mililitros. Em seguida, dilua seriamente o homogenato do órgão em três diluições: um para 100, um para 1001 para 5.000 e plaque 100 microlitros em BHI.Incube as placas de ágar sanguíneo a 37 graus Celsius em uma estufa com porcentagem normal de dióxido de carbono ambiente por até 14 dias e enumere as UFCs anticorpo monoclonal. O isotipo é crítico na proteção contra hcaps Lotum, pois camundongos tratados com IgG um ou IgG dois a anticorpos monoclonais para HS P 60 apresentam sobrevida significativamente prolongada em comparação com camundongos controle que receberam um anticorpo monoclonal IgG dois B para HSP 60 ou um anticorpo monoclonal controle de isotipo ou PS. Além disso, em camundongos que receberam anticorpos monoclonais protetores, houve uma redução significativa no número de UFCs pulmonares e esplênicas no sétimo dia e diminuições de dois e 2,5 unidades logarítmicas nos números de leveduras nos pulmões no 14º dia. Após este procedimento, outros métodos, como a determinação da carga fúngica indicativa da unidade formadora de colônia, as citocinas envolvidas na infecção e a avaliação da topologia, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como definir o mecanismo de ação da modificação da doença pelos anticorpos durante a tentativa deste procedimento.É importante lembrar de trabalhar em condições de segurança biológica ao manipular o knock on e de seguir as regulamentações de cuidados com animais para infecções intranasais.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o placar de indução e clínicos de um modelo animal de esclerose múltipla: doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental em ratos DA. A doença, induzida pela imunização ratos com uma emulsão contendo medula espinhal de ratos inteiros e adjuvante de Freund completo, apresenta sinais clínicos semelhantes à doença humana.

Indução e pontuação clínica de doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental

Linhagens determinados são capazes de resistir a indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) com proteína básica de mielina. Descrito aqui é um simples protocolo de imunização que reverte a apatia e induz a doença paralítica em vários típicos EAE manchas resistentes do mouse.

Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

Este vídeo demonstra uma técnica de homogeneização eficiente para gerar uma emulsão antigénio-adjuvante para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE) num modelo murino. A emulsão contém um autoantígeno - glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) - na fase aquosa, cercada por uma fase oleosa contínua composta por uma bactéria patogênica inativada. A emulsão garante uma liberação sustentada de antígenos para uma resposta imune prolongada.

Preparando uma emulsão adjuvante de antígeno para induzir encefalomielite autoimune

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal estabelecido de esclerose múltipla. C57BL / 6 são imunizados com mielina de oligodendrócitos glicoproteína (MOG) peptídeo 35-55 (MOG 35-55), o que resulta em uma paralisia flácida ascendente causada por células imunes autorreactivas no sistema nervoso central. Protocolos para indução e monitoramento de doenças serão discutidos.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

Um protocolo otimizado é apresentado para a geração de anticorpos monoclonais baseados na tecnologia de hibridoma. Os camundongos foram imunizados com um imunoconjugado. As células do baço foram fundidas por PEG e um impulso elétrico com células de mieloma imortal. As células de hibridoma produtoras de anticorpos foram selecionadas por HAT e triagem ELISA antígeno-específica.

Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação e avaliação de anticorpos monoclonais contra produtos naturais para uso em diversos imunoensaios. Esse procedimento inclui imunização, fusão celular, indirecto ELISA competitivo para clone positivo triagem e preparação de hibridoma monoclonal. As especificações para a caracterização de anticorpo usando análises de ELISA e MALDI-TOF-MS também são fornecidas.

Geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais

Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Este protocolo descreve as etapas para a indução da Uveíte Micobacteriana Primed (PMU) em camundongos. Este método descreve as etapas para ajudar a produzir inflamação ocular confiável e robusta no sistema modelo de rato. Usando este protocolo, geramos olhos uveíticos e outros olhos não inflamados de animais individuais para avaliação adicional com ensaios imunológicos, transcriptômicos e proteômicos.

Uveíte micobacteriana preparada (PMU) como modelo para uveíte pós-infecciosa

Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

Aqui, apresentamos um protocolo alternativo para induzir ativamente encefalomielite autoimune experimental em camundongos C57BL/6, usando o epítopo imunogênico mielina oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspenso em adjuvante de Freund incompleto contendo a subespécie paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.

Atividade Adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis no Aumento da Imunogenicidade de Autoantígenos Durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Os camundongos são geralmente resistentes a infecções por Mycobacterium abscessus, o que complica a descoberta e o desenvolvimento de antibióticos muito necessários contra infecções pulmonares. Aqui, descrevemos um método de preparação de inóculo e infecção intratraqueal que demonstrou fornecer infecção sustentada em camundongos imunocompetentes.

Preparação de Mycobacterium abscessus embebido em grânulo de ágar para inocular camundongos imunocompetentes por via intratraqueal

Aprenda a administrar anticorpos monoclonais passivamente contra Histoplasma capsulatum em camundongos C57BL/6. Este método avalia a eficácia protetora da imunidade humoral na histoplasmose.

Administração passiva de anticorpos monoclonais contra H. capsulatum E outros patógenos fúngicos

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