Name: Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Aprenda a técnica de hibridização in situ em montagem total para visualizar padrões de expressão gênica em embriões de Danio rerio. Este método integra biologia molecular e organismal em cursos de graduação.

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Os autores gostariam de agradecer o Departamento de Biologia da Universidade de Syracuse e Marilyn Dr. Kerr por seus papéis na administração do curso de Biologia Comparada de Vertebrados. O laboratório Albertson é apoiada por conceder R21DE019223 dos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial, bem como conceder R01AG031922 do National Institutes of Health / National Institute on Aging.

1. Transformação plasmídeo do Target cDNA Parte I: Transformação de Plasmid (Tempo necessário: 3 horas mais de incubação durante a noite) <ol><li> Caldo quente SOC nutrientes em um banho de água 42 ° C (500 mL por reação) </li><li> Descongele as células competentes sobre o gelo </li><li> Adicionar 1 mL a 25 mL plasmídeo células competentes </li><li> Colocar no gelo por 20 minutos </li><li> Calor células de choque em 42 banho de água ° C por 45 segundos </li><li> Colocar imediatamente as células no gelo por 2 minutos </li><li> Adicionar 500 mL de 42 ° C caldo de nutrientes para cada frasco de células </li><li> Agite a 37 ° C por 2 horas a 255 rotações por minuto (rpm) </li><li> Placa 75 mL mix de transformação em Luria Bertani placas (LB) ágar </li><li> Incubar as placas invertidas a 37 ° C durante a noite </li></ol> Parte II: E. Cultura coli (Tempo necessário: 15 minutos acrescido de incubação durante a noite) <ol><li> Para cada reação, 3 alíquota caldo LB mL e 3 mL de 50 mg / mL ampicilina em um tubo de cultura </li><li> Raspe uma colônia de bactérias da placa de agar e adicionar a cada tubo de cultura </li><li> Agitar tubos de cultura a 37 ° C em 255 rpm durante a noite </li></ol> Parte III: Prep Plasmid (Tempo necessário: 1,5 horas) <ol><li> Isolar plasmídeo de culturas durante a noite usando o Kit 5 Mini Prime FastPlasmid (Catalog # 2300000) </li><li> Para verificar a presença de plasmídeo preparada, execute o DNA eluído do kit em um gel de 1% Tris-acetato-EDTA (TAE) corado com brometo de etídio </li></ol> 2. In Situ DIG marcado Síntese da sonda RNA Parte I: Linearização de Plasmid (Tempo necessário: 2,5 horas) <ol><li> Em um microtubo de 1,5 mL, combine: <table border="1"><tbody><tr><td> Preparado Plasmid </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> * Enzima de restrição </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Tampão ** </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> 10X albumina bovina (BSA) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Dietil Pyrocarbonate Água (DEPC) </td><td> 58 mL </td></tr><tr><td></td><td> 100 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Incubar a 37 ° C por 2 horas * Varia de acordo com plasmídeo ** Varia de acordo com enzima de restrição </li></ol> Parte II: Transcrição (Tempo necessário: 3 horas) <ol><li> Em um microtubo de 1,5 mL, combine: <table border="1"><tbody><tr><td> Linear Plasmid </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Tampão Transcrição 10X ** </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Digoxigenina Mix Etiqueta </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> * Polimerase </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Inibidor de RNase </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Água DEPC </td><td> 24 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Incubar a 37 ° C por 1 hora </li><li> Adicione 2 mL da polimerase * </li><li> Incubar a 37 ° C por 1 hora </li><li> Adicione 2 mL de DNase </li><li> Incubar a 37 ° C por 20 minutos * Varia de acordo com plasmídeo ** Varia de acordo com polimerase </li></ol> Parte III: Precipitação (Tempo necessário: 5 minutos mais duas horas de incubação durante a noite, uma hora para outra centrífuga e re-suspensão) <ol><li> Adicionar 4 mL de EDTA 0,2 M </li><li> Adicionar 5 mL de cloreto de lítio 4M </li><li> Adicionar 150 mL de etanol 100% gelado </li><li> Incubar a -80 ° C por 2 horas durante a noite </li><li> Centrifugar a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C, embora decante o sobrenadante </li><li> Pellet seco por 7 minutos </li><li> Re-suspender em 20 mL de água DEPC </li><li> Incubar a 37 ° C por 5 minutos </li></ol> Parte IV: Fracionamento - Executar apenas se o tamanho da sonda é superior a 0,6 kb (Tempo necessário: Varia com base no tamanho da sonda, geralmente não mais de 20 minutos) <ol><li> Em um microtubo de 1,5 mL, combine: <table border="1"><tbody><tr><td> RNA Probe </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> Água DEPC </td><td> 12 mL </td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Carbonato de Sódio </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Incubar em banho-maria a 60 ° C. O tempo de incubação de base na seguinte equação: Tempo (min.) = (partida kb - desejado kb) / (0,11 x de partida kb x desejado kb) Tamanho desejado média = 0,6 kb </li></ol> Parte V: Precipitação final (Tempo necessário: 5 minutes mais duas horas de incubação durante a noite, uma hora para outra centrífuga e re-suspender, 1 hora para eletroforese em gel) <ol><li> Adicionar 40 mL de água DEPC </li><li> Adicionar 8 mL de acetato de sódio </li><li> Adicionar 1,04 mL de ácido acético glacial </li><li> Adicionar 240 mL de gelo etanol frio a 100% </li><li> Incubar a -80 ° C por 2 horas durante a noite </li><li> Centrifugar a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C, embora decante o sobrenadante </li><li> Pellet seco por 7 minutos </li><li> Re-suspender em 20 mL de água DEPC </li><li> Vortex para misturar </li><li> Para verificar a presença de riboprobe, executar a solução re-suspensas em um gel corado 1% TAE com brometo de etídio </li></ol> 3. Monte todo Hibridização In Situ Parte I: A fixação de embriões e proteinase K Digestão (Tempo necessário: Fix horas durante a noite, mais 4 no dia seguinte para o armazenamento, 2,5 horas de armazenamento com a Parte II) <ol><li> Coletar embriões encenado zebrafish e corrigir em paraformaldeído 4% (PFA) durante a noite a 4 ° C </li><li> Lavar embriões fixados em tampão fosfato salina contendo 0,1% Tween-20 (PBST) 3 vezes por 10 minutos cada </li><li> Para garantir a exposição dos embriões aos reagentes experimental, embriões dechorionate manualmente (se necessário) usando uma pinça de ponta fina </li><li> Desidratar embriões por lavagem em uma série graduada de 25% e metanol 50% em PBST por uma hora cada lavagem, em seguida, armazenar em metanol 100% a -20 ° C </li><li> Quando estiver pronto para uso, reidratar embriões em PBST por lavagem em 50% (2 vezes) e 25% (1 vez) de metanol em PBST por 10 minutos cada. Finalmente, lavar 2 vezes durante 10 minutos cada, em PBST 100%. Momento exato não é importante para PBST / metanol lava </li><li> Bleach embriões em uma solução de peróxido de hidrogênio 10% em PBST, se necessário, para remover os pigmentos escuros. Embriões devem incubar em solução de peróxido de hidrogênio por 10-20 minutos, dependendo da idade do embrião, ea tampa do tubo de microcentrífuga deve permanecer aberta para evitar acumulação de pressão de ar </li><li> Embriões Digest com 50 mg / mL de Proteinase K diluído 1:5000 em PBST de 15/03 minutos, dependendo da idade do embrião </li><li> Re fix-embriões em PFA 4% por 30 minutos, e depois lave 3 vezes em PBST por 5 minutos cada </li></ol> Parte II: A hibridação de Riboprobes (Tempo necessário: 3 horas mais durante a noite para hibridação, 1,5 horas no dia seguinte com a Parte III) <ol start="9"><li> Prehybridize embriões com solução prehybridization (PHS), em pré-aquecido a 70 · Banho de água C por 2-3 horas </li><li> Remover PHS, adicionar 0,5 mL de solução de hibridização e 1,5 mL previamente sintetizado digoxigenina riboprobes rotulados, incubar a 70 ° C durante a noite. Temperatura poderá variar dentro de alguns graus, dependendo do alvo riboprobe </li><li> No dia seguinte, lave embriões a 70 ° C em soluções graduais de 75%, 50% e 25% PHS em citrato de sódio, solução salina 2X (SSC) por 10 minutos cada, em seguida, lave em 0,2 X SSC por 30 minutos a 68 ° C </li><li> Lavar em tampão de ácido maleico (MAB) 2 vezes por 10 minutos cada em temperatura ambiente </li></ol> Parte III: Anti-digoxigenina (DIG-α) Incubação de anticorpos (Tempo necessário: 3 horas mais durante a noite para bloco, 2,5 horas no dia seguinte com a Parte IV) <ol start="13"><li> Transferência de embriões para uma placa de 12 poços </li><li> Bloco pré-embriões em solução mL 1-2 bloqueio por pelo menos 3 horas à temperatura ambiente </li><li> Ao mesmo tempo, pré-bloco do anticorpo preparando um segundo volume de solução de bloqueio e diluindo o anticorpo anti-digoxigenina 1:2000 nesta solução </li><li> Remover pré-bloco e adicionar 1-2 mL de pré-bloqueados solução α-DIG, incubar overnight a 4 ° C </li><li> No dia seguinte, lave embriões no MAB. Permitir que os embriões para incubar no MAB por 5 minutos em primeiro lugar, em seguida, executar alterações no buffer e incubar por dois minutos 10, uma 30 minutos e um intervalo de 60 minutos. Momento exato não é necessário </li><li> Lavar embriões 3 vezes por 5 minutos cada em tampão Fosfatase Alcalina (AP) </li></ol> Parte IV: Coloração e Processamento Final (Tempo necessário: uma hora durante a noite para a coloração, dependendo da riboprobe usado, quatro horas para o início de lavagens glicerol, 10/06 horas por lavagem de glicerol, podem ser armazenados em glicerol) <ol start="19"><li> Adicione 1-2 mL de solução de coloração para os embriões, embrulhe a placa em papel alumínio, e verificar a coloração em intervalos regulares (a cada 20 minutos) até que a coloração é suficiente </li><li> Lavar embriões com PBST 2 vezes por 5 minutos cada um para parar a reação de coloração </li><li> Desidratar embriões usando 10 lavagens minutos em 25% (1 vez) e 50% (2 vezes) metanol em PBST, em seguida, em metanol 100%, para remover a coloração de fundo </li><li> Permitir que embriões para incubar em metanol 100% por pelo menos duas horas em temperatura ambiente </li><li> Reidratar em PBST com 10 lavagens minutos em 50% (2 vezes) e 25% (1 vez) de metanol em PBST, em seguida, lave em 100% PBST 2 vezes </li><li> Transferência e manchadambryos a uma solução de glicerol 80% em PBST, usando uma série graduada de lavagens, e armazenar a 4 ° C. </li></ol> Receitas: <ul><li> Placas-10 LB agar agar LB g + 250 mL de água destilada, autoclave, quando fria ao toque juntar 250 mL ampicilina, despeje solução mL 15-20 quente em cada placa de Petri, permitem ágar para solidificar </li><li> Caldo-12.5 LB caldo LB g + 200 mL de água destilada, autoclave, deixe esfriar antes de usar </li><li> 1% TAE gel-agarose 0,4 g, 40 mL TAE 1X, 2 mL de brometo de etídio; carga 7 (Transformação Plasmid do Target cDNA) plasmídeo mL ou 3 mL riboprobe e 4 mL de água DEPC (In situ DIG marcado Síntese Probe RNA) + um corante de carregamento mL, 5 mL escada de DNA </li><li> Formamida Prehybridization solução de 50%, SSC 5X, 9.2mm ácido cítrico, 1% Tween-20 </li><li> Solução de hibridização solução prehybridization-plus 500 mcg / mL tRNA e 50 mcg / mL de heparina </li><li> MAB-100mM ácido maleico, 150mm NaCl, NaOH 0,2 M, 0,1% Tween-20, pH para 7,5 </li><li> Bloqueando-Solução 3 partes MAB, 1 parte de 10% de reagente Boehringer bloqueio no MAB, uma parte do calor desativado cordeiro soro </li><li> AP-buffer 60mm pH Tris-HCl a 9,5, NaCl 60mm, 30mm MgCl 2, 0,1% Tween-20 </li><li> Solução-5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato de coloração (BCIP) e Nitro blue tetrazolium (NBT) em tampão AP </li></ul> 4. RESULTADOS REPRESENTANTE Quando realizada corretamente, a reação entre o NBT, BCIP, e fosfatase alcalina formará um precipitado roxo que deve aparecer no embrião do zebrafish como uma mancha roxa. Riboprobes deve ser previamente sintetizado a partir do cDNA correspondente ao gene de interesse. Portanto, pode-se concluir qualquer visualizadas mancha representa áreas do paulistinha em que o gene de interesse foi transcrita nessa fase especial de desenvolvimento. Para os fins deste curso, riboprobes foram sintetizados a partir aldh1a2 (anteriormente raldh2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates et al, 2005.); myod1 (Weinberg et al, 1996.); shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) e myl7 (anteriormente cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. Coloração era esperado na linha média e em estruturas anatômicas, incluindo os somitos, tailbud, myotome, cérebro e coração. Mutantes Ace/fgf8a Esperava-se que têm defeitos em muitas destas estruturas. Coloração foi facilmente visualizado através de um microscópio padrão de dissecação. Fontes adicionais contêm mais informações e solução de problemas em WISH técnicas semelhantes às descritas aqui (Clark, 2003;. D'Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Um embrião zebrafish 24 horas após a fecundação, que tem sido hibridizado com riboprobes específicas para aldh1a2. Coloração específica pode ser visto nos olhos, cérebro posterior, peitoral fin bud primórdios, e somitos. Anterior é para o topo, é posterior ao fundo. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Um embrião zebrafish na fase somito 13 de desenvolvimento que tem sido hibridizado com uma sonda específica para fgf8a. Coloração específica é visto no telencéfalo, diencéfalo dorsal, mesencéfalo rombencéfalo-limite, somitos, e tailbud. Ventral é para a esquerda, dorsal é para a direita. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A 22 horas após a fecundação do embrião zebrafish que foi hibridizada com uma específica para riboprobe pax2a, um marcador robusto útil para visualizar o sistema nervoso. Coloração específica pode ser visto na fissura coróide, mesencéfalo rombencéfalo-limite, vesícula ótica, e os neurônios da medula espinhal. Vista dorsal, com anterior para a esquerda.

<ol><li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li>
<li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7%2C+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+A+Clin+Mol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li>
<li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+neckless+mutation+reveals+a+requirement+for+raldh2+in+mesodermal+signals+that+pattern+the+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain.</a> Development. 128, 3081-3094 (2001).</li>
<li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li>
<li>Clark, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+M+%22In+situ+Hybridization%3A+Laboratory+Companion%22">In situ Hybridization: Laboratory Companion</a>. , Wiley-VCH. (2003).</li>
<li>D'Costa, A., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+genetics%3A+Introducing+undergraduates+to+developmental+biology+and+genetics+in+a+large+introductory+laboratory+class%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class.</a> Zebrafish. 6, 169-177 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Emerging+Model+Organisms%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Volume+1%22">Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).</li>
<li>Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).</li>
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<li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+somite+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in somite development.</a> Ann Anat. 190, 208-222 Forthcoming.</li>
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<li>Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).</li>
<li>Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+is+mutated+in+zebrafish+acerebellar+%28ace%29+mutants+and+is+required+for+maintenance+of+midbrain-hindbrain+boundary+development+and+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis.</a> Development. 125, 2381-2395 (1998).</li>
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<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

WISH foi usado em um comparativo curso de laboratório de Vertebrados Biologia para ajudar os alunos a compreender o papel da genética no desenvolvimento anatômico através da visualização dos padrões de expressão gênica conhecida. Para a primeira parte do curso, os alunos realizadas dissecções em organismos representando taxa chordate várias diferentes, permitindo-lhes tempo suficiente para estudar, compreender, comparar e anatomia de vertebrados contraste. Como uma introdução à segunda parte do curso, os alunos receberam uma palestra formal descrevendo o desenvolvimento zebrafish e anatomia. Os métodos e resultados esperados da experiência WISH também foram discutidas. Os alunos foram então dadas ao vivo em zebrafish somitogenesis e prim-6 estágios de desenvolvimento, e em 2 e 5 dias após a fertilização (DPF) para examinar sob o microscópio de dissecação. Isso era para dar aos alunos uma melhor compreensão do que embriões zebrafish aparência e os tipos de alterações morfológicas que ocorrem durante a ontogenia. Na sessão de laboratório próximo, os alunos receberam embriões zebrafish em que gostaria que tivesse sido previamente realizada. Eles foram convidados a estudar e descrever os padrões de expressão gênica para cada gene de interesse (riboprobe utilizado). Embriões utilizados para WISH foram derivadas de acasalamentos entre os membros de uma linha ace/fgf8a heterozigotos. Com base na herança mendeliana, 25% dos embriões dos acasalamentos ace/fgf8a deveriam ser mutantes homozigotos e exibir defeitos de muitas das estruturas anatômicas focada em neste curso. Com base em relatórios publicados e não publicados observações no laboratório Albertson, defeitos no cérebro e coração looping imprópria eram esperados, bem como defeitos na somitos (Brand et al, 1996;. Albertson e Yelick, 2005; observações pessoais). Os alunos foram convidados a examinar todas as amostras, de tipo selvagem (animais heterozigotos são indistinguíveis dos irmãos do tipo selvagem nos estágios iniciais de desenvolvimento) e os mutantes homozigotos, para cada padrão de expressão gênica apresentada. Eles foram, então, convidado a escrever relatórios de laboratório descrevendo seus resultados, e com base em seus conhecimentos de anatomia e genética, como a expressão do gene defeituoso pode ter precipitado malformações anatômicas. Alunos pareciam receber este exercício de laboratório com entusiasmo e curiosidade. A maioria nunca tinha usado antes e WISH estavam extremamente interessados ​​nesta parte do curso. Alunos encontraram os diferentes padrões de expressão gênica em embriões do zebrafish intrigante, alguns até mesmo descrito o padrão de coloração visualizado por associá-las com o bem conhecido desenhos e símbolos, como um rosto sorridente. Os relatórios de laboratório resultantes mostraram que os alunos tinham um entendimento geral do protocolo WISH ea expressão de genes específicos em estruturas anatômicas. Os estudantes também foram obrigados a entender as funções específicas dos genes estudados utilizando WISH durante o (Stickney et al, 2000 laboratório;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Geetha-Loganathan et al, 2008b ). Era evidente no entanto, que alguns alunos tiveram conhecimento de fundo limitado das vias de sinalização e genes de interesse. Mais informações sobre esses conceitos no WISH aula introdutória pode ser uma adição bem-vinda ao uso de WISH, no futuro, cursos de Biologia Comparada de Vertebrados. Desde o protocolo geralmente leva quatro dias consecutivos, dependendo do horário do curso, os alunos só poderão ser capaz de completar uma parte da experiência em sala de aula eo professor deve ser responsável pelo restante. Em nossa classe da Biologia Comparada de Vertebrados, os alunos completaram a coloração reações em laboratório, enquanto o Assistente de Ensino realizou todas as etapas anteriores. Se é preferível que os alunos realizam WISH em sala de aula, o protocolo pode ser dividida em subunidades que podem ser realizadas em sessões de laboratório vários, dependendo do tempo da classe. Se não é viável para os alunos a realizar todo o protocolo, como foi aqui devido à reunião de laboratório apenas uma vez por semana, os alunos podem adicionar a solução de coloração no início da classe e, dependendo do riboprobe usado, tem a coloração completa dentro de uma hora. O tempo que leva para a mancha de desenvolver varia muito com cada riboprobe e uma variedade de condições experimentais, e deve ser determinado antes da aula. Nomeadamente, se os alunos só será desenvolver a mancha no laboratório, os instrutores serão responsáveis ​​por todas as etapas anteriores, o que exigirá tempo e esforços significativos fora da sala de aula. Se desejar, uma alternativa mais curta a WISH poderia ser imuno-histoquímica, utilizando rótulos de anticorpos para visualizar localização de proteínas, no entanto, neste momento, zebrafish anticorpos específicos para os genes de desenvolvimento não estão prontamente disponíveis. Outra opção seria realizar WISH em diferentes espécies de vertebrados umand que os alunos comparar os padrões de expressão dos mesmos genes em diferentes organismos (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. organismos modelo Emergentes, 2008; Organismos modelo emergente, 2010). O objetivo maior do uso de WISH em um curso de Biologia Comparada de Vertebrados foi demonstrar aos alunos como técnicas da biologia molecular são utilizados para estudar o desenvolvimento anatômico. Ele também proporcionou uma oportunidade para os alunos a especular sobre a forma como alterou a expressão do gene pode conduzir não só a malformações do desenvolvimento, mas também à mudança evolutiva. Formalizado como biologia evolutiva do desenvolvimento (muitas vezes referida como &quot;evo-devo&quot;), este campo de rápido crescimento de estudo pretende ligar o genótipo eo fenótipo através do desenvolvimento, e para elucidar bases mecanicistas potencial de mudança evolutiva. Com a ascensão deste campo, os ecologistas mais, os biólogos do organismo, e fisiologistas estão empregando técnicas moleculares em suas pesquisas. Defendemos que o uso de WISH em um curso de Biologia Comparada de Vertebrados ajudará a manter o currículo atualizado com atuais avanços tecnológicos e conceituais na pesquisa, e para facilitar um melhor alinhamento horizontal dos cursos de biologia de nível superior, combinando subcampos biológica. Além disso, esta abordagem integrativa irá proporcionar aos alunos a oportunidade de aprender uma variedade de técnicas de pesquisa biológica em um curso, levando a uma educação mais diversificada e a promoção da investigação interdisciplinar futuro científico.

<ul><li> Autoclave </li><li> Micro-centrífuga </li><li> 37 ° C incubadora (com agitador) </li><li> 4 ° C micro-centrífuga </li><li> Banho de água </li><li> Vórtice </li><li> Aparelho de eletroforese em gel </li><li> -20 ° C freezer </li><li> -80 ° C freezer </li><li> Rocker / shaker </li><li> 4 ° C geladeira </li><li> Microscópio de dissecação (de preferência com uma tela de ensino ou da câmera) </li></ul>

usando monte whole in situ hibridação a ligação de biologia molecular e organísmicos

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Montar toda a hibridização in situ (WISH) é uma técnica comum em laboratórios de biologia molecular utilizadas para estudar a expressão do gene através da localização de transcrições de mRNA específicos dentro espécime montar todo. Esta técnica (adaptado de Albertson e Yelick, 2005) foi usado em um nível superior de graduação comparativa sala de aula Vertebrados laboratório de Biologia da Universidade de Syracuse. Os primeiros dois terços do comparativo de laboratório do curso de Vertebrados Biologia deram aos alunos a oportunidade de estudar a embriologia e anatomia dos diversos organismos que representam taxa chordate vários principalmente através dissecções tradicionais eo uso de modelos. A parte final do curso envolveu uma abordagem inovadora para ensinar anatomia através da observação do desenvolvimento dos vertebrados empregando técnicas moleculares em que WISH foi realizada em embriões do zebrafish. Um fator de crescimento de fibroblastos heterozigotos 8-A (fgf8a) linhagem mutante, ace, foi usado. Devido à herança mendeliana, ás intercrosses produzida tipo selvagem, heterozigoto, e os mutantes homozigotos ace/fgf8a em uma proporção de 01:02:01. Sondas de RNA com padrões de expressão conhecida na linha média e no desenvolvimento de estruturas anatômicas, como o coração, somitos, tailbud, miótomo e cérebro foram utilizados. WISH foi realizada utilizando zebrafish no somito 13 e prim-6 etapas, com os alunos realizar a reação de coloração em sala de aula. O estudo de embriões zebrafish em diferentes estágios de desenvolvimento deram aos alunos a capacidade de observar como estas estruturas anatômicas mudado ao longo da ontogenia. Além disso, alguns mutantes ace/fgf8a exibido looping coração imprópria, e defeitos em somito e desenvolvimento do cérebro. Os alunos neste laboratório observou o desenvolvimento normal de vários sistemas do órgão usando tanto a anatomia externa, bem como padrões de expressão gênica. Eles também identificaram e descreveram embriões exibindo desenvolvimento anatômico inadequado e de expressão gênica (ie, os mutantes putativos). Para instrutores em instituições que ainda não possuem o equipamento necessário ou onde os fundos de laboratório e de inovação curricular são limitados, o custo financeiro dos reagentes e aparelhos pode ser um fator a considerar, assim como o tempo eo esforço necessário por parte do instrutor, independentemente da configuração. No entanto, sustentamos que o uso de WISH neste tipo de ambiente de laboratório em sala de aula pode proporcionar uma importante ligação entre a genética do desenvolvimento e anatomia. Com o avanço da tecnologia ea capacidade de estudar o desenvolvimento do organismo em nível molecular se torna mais fácil, mais barato e cada vez mais popular, muitos biólogos evolutivos, ecologistas e fisiologistas estão se voltando para estratégias de pesquisa no campo da biologia molecular. Usando WISH em um comparativo de sala de aula de laboratório de Vertebrados Biologia é um exemplo de como as moléculas e anatomia podem convergir em um único curso. Isso dá a estudantes universitários de nível superior a oportunidade de praticar as modernas técnicas de pesquisa biológica, levando a uma educação mais diversificada e a promoção da investigação interdisciplinar futuro científico.

Montar toda<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação (WISH) foi utilizado em um curso superior de Biologia Comparada de Vertebrados nível de graduação, além de vertebrados dissecções. Isso deu aos alunos a oportunidade de estudar padrões de expressão gênica, bem como anatomia, ligando o estudo da biologia molecular e do organismo dentro de um curso.

Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

A hibridização in situ em montagem total (WISH) é uma técnica comum em laboratórios de biologia molecular, utilizada para estudar a expressão gênica por meio da localização de...

O objetivo geral deste procedimento é observar padrões de expressão gênica em embriões de peixe-zebra durante estágios específicos do desenvolvimento. Isso é realizado primeiramente hibridizando uma sonda de riboprova antissenso marcada com digoxigenina ao mRNA alvo. O segundo passo é detectar a riboprova.Utilizando um anticorpo contra doxiciclina, o anticorpo é conjugado a uma enzima fosfatase alcalina. O terceiro passo do procedimento é a coloração pela adição de NBT e BCIP, que reagem com a enzima fosfatase alcalina para produzir um precipitado roxo insolúvel. O passo final do procedimento é incubar embriões suficientemente corados em metanol para reduzir a coloração não específica.Em última análise, resultados que mostram padrões de expressão gênica em embriões inteiros de peixe-zebra em estágios específicos do desenvolvimento podem ser obtidos utilizando a hibridização in situ em montagem inteira. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como demonstrações tradicionais em sala de aula de histologia ou dissecações, é que ela oferece aos alunos a oportunidade de construir pontes conceituais entre a biologia molecular e as tendências no desenvolvimento e evolução dos organismos, proporcionando assim uma experiência verdadeiramente integrativa. Embora esses métodos tenham sido tradicionalmente usados para estudar o desenvolvimento de alguns organismos modelo, eles podem ser facilmente aplicados a outros organismos não modelo para compreender a conservação das vias de desenvolvimento entre táxons vertebrados, bem como os pontos em que essas vias divergem, levando a novidades evolutivas.Este método pode ser desconhecido para alunos de graduação, de modo que alguns estudantes podem ter dificuldades inicialmente, mas aprender este método será muito útil em suas experiências de pesquisa na graduação e em disciplinas avançadas. Para iniciar este procedimento, utilize uma pipeta de transferência para transferir cerca de 50 embriões de peixe-zebra para um tubo microfugador. Remova o líquido em excesso e, em seguida, pipete 1,5 mililitros de paraformaldeído 4% para dentro do tubo.Coloque o tubo com embriões em um agitador à temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, remova e descarte o fixador. Adicione 1,5 mililitros de solução salina tamponada com fosfato contendo 0,1% de tween 20 aos embriões para lavar.Use pin&ccedil;as de ponta fina para revestir manualmente os embri&otilde;es, se necess&aacute;rio, e use uma pipeta de transfer&ecirc;ncia para colocar os embri&otilde;es revestidos em um tubo microfus&iacute;vel limpo. Em seguida, pipete 1,5 mililitros de metanol 25% e PBST no tubo. Ap&oacute;s a incuba&ccedil;&atilde;o por uma hora, aspire o m&aacute;ximo poss&iacute;vel dessa solu&ccedil;&atilde;o sem perturbar os embri&otilde;es.Em seguida, substitua por 1,5 mililitros de metanol a 50% em PBST e incube por um mínimo de uma hora. Por fim, substitua por 1,5 mililitros de metanol a 100% e coloque a menos 20 graus Celsius. Os embriões podem ser armazenados em metanol a menos 20 graus Celsius.Quando pronto para usar, pipete o metanol do tubo e descarte a pipeta. Adicione 50% de metanol em PBST ao tubo e incube por 10 minutos. Repita isso, lave uma segunda vez, depois aspire a solução e repita a incubação com 25% de metanol em PBST.Por fim, lave duas vezes por 10 minutos cada em PBST a 100% e prepare uma solução de peróxido de hidrogênio a 10% em PBST. Mergulhe os embriões de peixe-zebra nesta solução à temperatura ambiente com a tampa do tubo microfúgada aberta por 10 a 20 minutos, dependendo da idade do embrião. Para remover qualquer pigmentação escura, utilize uma pipeta de transferência para remover e descartar a solução de peróxido de hidrogênio.Lave os embriões em 1,5 mililitros de PBST várias vezes para interromper a reação. Dilua uma solução estoque de proteinase K de 50 miligramas por mililitro em uma proporção de um para 5.000 em PBST. Normalmente, um microlitro de proteinase K em 4,999 mililitros de PBST.Remova o PBST dos embriões. Usando uma pipeta de transferência, descarte e adicione 1,5 mililitros de solução de proteinase K no tubo. Incube os embriões na solução de proteinase K à temperatura ambiente por três a 15 minutos, dependendo da idade dos embriões.Lave com PBST várias vezes para interromper a reação. Em seguida, remova o PBST e imerja os embriões em formaldeído a 4% por 30 minutos à temperatura ambiente para refixar, remova o paraformaldeído usando uma pipeta de transferência e descarte. Adicione 1,5 mililitros de PBST aos embriões e lave por cinco minutos.Pipete cuidadosamente o PBST do frasco e descarte. Repita a lavagem com mais dois volumes de PBST. Em seguida, prossiga para a hibridização com a sonda rip, aqueça previamente o banho-maria a 70 graus Celsius e prepare a solução de pré-hibridização.Em seguida, utilize uma pipeta de transferência para remover e descartar o PBST. Imersa os embriões em 0,5 mililitros de solução de pré-hibridização e incuba-os no banho-maria a 70 graus Celsius por duas a três horas, tomando cuidado para não perturbar os embriões.Retire com pipeta a solução de pré-hibridização do tubo micro e descarte. Adicione suavemente 0,5 mililitros da solução de hibridização no tubo. Em seguida, adicione rapidamente a doxiciclina previamente sintetizada no ribo rotulado.Utilizam-se concentrações de sonda ribossomal no tubo variando em torno de um micrograma por mililitro. Incube a 70 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, prepare soluções de 75%, 50% e 25% de PHS em cloreto de sódio e citrato de sódio duas vezes concentrado, bem como soluções de duas vezes SSC e 0,2 vezes SSC.Aqueça mais soluções no banho-maria a 70 graus Celsius. Quando as soluções atingirem 70 graus Celsius, retire-as do banho-maria. Em seguida, aspire a solução de hibridização do tubo e descarte-a.Adicione 0,5 mililitros de cada solução P-H-S-S-S-C aquecida, incubando os embriões em cada solução por 10 minutos a 70 graus Celsius. Por fim, incube os embriões na solução 0,2 vezes SSC a 68 graus Celsius por 30 minutos. Aspire a solução 0,2 vezes SSC do tubo e descarte-a.Incube os embriões em 1,5 mililitros de tampão de ácido málico, pH 7,5, à temperatura ambiente durante 10 minutos. Repita este procedimento, lavando uma segunda vez. Prepare a solução bloqueadora de acordo com o protocolo escrito.Transfira os embriões em MAB para cada poço de uma placa de 12 poços. Remova o excesso de MAB e pipete um a dois mililitros de solução bloqueadora para cada poço.Incubar bem em temperatura ambiente com agitação por pelo menos três horas. Diluir o antígeno no anticorpo um para 2000 na solução bloqueadora restante. Incubar em temperatura ambiente por pelo menos três horas com agitação suave.Tendo cuidado para não perturbar os embriões. Pipete a solução bloqueadora das cavidades da placa e descarte. Pipete suavemente o anticorpo anti-doxygênio previamente preparado na solução de anticorpo e bloqueio nas cavidades e incube a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, lave os embriões com cinco trocas de 1,5 mililitros de tampão de ácido málico. Deixe os embriões incubarem no tampão de ácido málico durante cinco minutos. Primeiro, realize as trocas do tampão e incube por dois períodos de 10 minutos.Um intervalo de 30 minutos e um de 60 minutos. Aspire o último lavado do tampão de ácido meic do interior das cavidades e descarte a pipeta. Adicione de 1,5 a dois mililitros de tampão de fosfatase alcalina nas cavidades e incube por cinco minutos.Repita este processo duas vezes. Remova o tampão de fosfatase alcalina e adicione de 1,5 a dois mililitros de solução corante aos poços. Envolva toda a placa com papel alumínio para proteger da luz e agite suavemente a cada 20 minutos.Interrompa a agitação e observe os embriões ao microscópio estereoscópico para verificar se a coloração suficiente foi alcançada. Quando a coloração suficiente for visível, pipete a solução de coloração das cavidades e descarte. Substitua por PBST para interromper a reação de coloração.Repita o processo de lavagem com outro volume de PBST, remova o PBST das cavidades com pipeta e descarte para desidratar os embriões. Adicione com pipeta 1,5 a dois mililitros de metanol 25% em PBST nas cavidades e incube por 10 minutos. Repita o processo duas vezes com metanol 50% em PBST, cada lavagem por mais 10 minutos. Em seguida, transfira os embriões para metanol 100% e incube por pelo menos duas horas para reduzir a coloração não específica.Após a incubação, pipete o metanol das cavidades e descarte-o para reidratar os embriões. Lave duas vezes com 50% de metanol em PBST, seguido de 25% de metanol em PBST, durante 10 minutos cada. Em seguida, lave duas vezes com PBST 100%, durante 10 minutos cada vez.Por fim, transfira os embriões corados para uma solução de glicerol 80% em PBST utilizando uma série graduada de lavagens e armazene a quatro graus Celsius até a observação, quando realizado corretamente. A expressão do gene de interesse é indicada pelo aparecimento de uma coloração roxa no embrião de peixe-zebra. Esta imagem mostra um embrião de peixe-zebra 24 horas após a individualização, que foi hibridizado com sondas RIBA específicas para AAL DH um A dois. A coloração específica pode ser observada nos olhos, cérebro posterior, broto da nadadeira peitoral, ria e somitos.Esta imagem mostra um embrião de peixe-zebra na fase de 13 somitos que foi hibridizado com uma sonda específica para FGF eight A. Neste caso, a coloração específica é observada na linha média, diângio dorsal, diencéfalo, limite entre o mesencéfalo e o rombencéfalo, somitos e botão caudal. Esta imagem mostra um embrião de peixe-zebra com 22 horas pós-fertilização que foi hibridizado com a sonda específica para PAX two A. Um marcador robusto útil para a visualização do sistema nervoso.A coloração específica pode ser observada na fissura coroidea, mesencéfalo, limite entre o metencéfalo e o mielencéfalo, vesícula ótica e neurônios da medula espinhal após dominar a técnica. Este método pode ser modificado para ser realizado em várias sessões laboratoriais, dependendo da programação do curso. Pode ser necessário que o instrutor dedique tempo e esforço fora da sala de aula.Depois de assistir a este vídeo, esperamos que você se sinta mais à vontade com a ideia de introduzir a hibridização com montagem inteira e C dois em um laboratório de graduação. À medida que os estudantes desenvolvem essas habilidades, o conhecimento sobre essa técnica pode facilitar sua transição para pesquisas de nível avançado ou pós-graduação.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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