Name: Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a expandir e purificar células NK humanas do sangue periférico usando células apresentadoras de antígeno artificiais. Este método permite obter grandes quantidades de células NK funcionais para imunoterapia contra câncer.

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Os autores gostariam de agradecer Laurence Cooper, Harjeet Singh, e Lenka Hurton por seu trabalho na criação da inicial K562 AAPC e mIL21 vetores de fusão. Financiamento para este trabalho foi fornecido pelo MD Anderson UT Programa Cientista Médico, a Fundação St. Baldrick, eo Legends of Friendswood.

1. Isolamento de PBMCs de Buffy Brasão Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são obtidos por centrifugação de empuxo sobre densidade Ficoll-Paque de doadores saudáveis ​​amostras obtidas por buffy coat leucaférese. <ol><li> A centrifugação Ficoll-Paque é feito como protocolo por fabricante, com pequenas modificações. </li><li> Adicionar PBS a um doador de sangue normal-bancárias buffy coat para um volume final de 140 mL (volume casaco típico buffy é 40-70 mL). </li><li> Camada de 35 mL de amostra buffy coat, em 15 mL de Ficoll-Paque (4 tubos). </li><li> Centrifugar a 400 g por 20 minutos sem freio. </li><li> Recuperar o PBMCs do Ficoll-Paque: interface plasma, não descartam a hemácias no fundo do Ficoll-Paque. </li><li> Lavar PBMCs três vezes com PBS, centrifugação cada vez menos 400g por 10 minutos. </li><li> PBMCs podem ser usados ​​diretamente para a expansão das células NK, nesta fase, ou células NK pode ser isolado por RosetteSep (Seção 4) </li><li> PBMCs restantes podem ser congelados em FBS contendo DMSO 10% em nitrogênio líquido. </li><li> Aspirar o Ficoll e recolher os glóbulos vermelhos a partir do passo 5 em duas tubo de centrífuga de 50 mL, lavar três vezes com PBS (adicionado a 50 mL marca), cada vez aspirar o sobrenadante desnatação do topo da camada de RBC para remover granulócitos. </li><li> Os glóbulos vermelhos podem ser utilizados imediatamente para RosetteSep  purificação das células NK (consulte a Seção 4) ou armazenado em volume igual de solução Alsever é a 4 ° C para uso posterior (Os glóbulos vermelhos pode ser reservado para um máximo de 4 semanas). </li></ol> 2. NK expansão celular A expansão das células NK pode ser iniciado usando PBMCs ou purificada de células NK. A quantidade de PBMCs usado para a expansão pode ser variado com base na quantidade de células NK desejado no final de uma expansão de três semanas, consulte a secção representativa resultados para obter detalhes. (Ver Nota 1) ESTIMULAÇÃO 1 Dia 0 <ol><li> Para cada 5x10 6 PBMCs ser expandido, contagem e irradiar 10x10 6 K562 CL9 mIL21 usando um irradiador gama a 100 Gy. </li><li> Pós-irradiação, lavar as células com PBS e ressuspender em células NK expansão media (Nkem). </li><li> Semente de 5x10 6 PBMCs com 10x10 6 irradiados K562 CL9 mIL21 (1:2) em 40 mL de Nkem em um frasco T75 e colocá-lo na posição vertical em uma incubadora a 37 ° CO C e 5% 2. </li></ol> Dias 3 e 5 <ol start="4"><li> Recuperar as células por centrifugação a 400g por 5 min e substituir metade da mídia com Nkem fresco (adicionando IL2 fresco para o volume de mídia inteira) e continuar a cultura. </li></ol> ESTIMULAÇÃO 2 Dia 7 <ol><li> Contar o número de células em cultura no final de uma semana. </li><li> Separe 5x10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo (ver nota 2) </li><li> Para cada 5x10 6 células para ser restimulated, contagem e irradiar 5x10 6 K562 CL9 mIL21 usando um irradiador gama a 100 Gy. </li><li> Adicionar um número igual de irradiados K562 CL9 mIL21 (1:1) e ressuspender em Nkem em 2.5x10 5 total de células / mL (Ver Nota 3). </li><li> Células de sementes em frascos T75 (máximo 50 mL por frasco). </li></ol> Dias 10 e 12 <ol start="6"><li> Contar o número de células. </li><li> Mudança de mídia inteira com Nkem fresco com base no número de células (Veja Nota 3). </li></ol> Dia 14 <ol start="8"><li> No final de duas semanas de expansão contar o número de células em cultura. </li><li> Separe 5x10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo (ver nota 2) </li><li> Se a expansão foi iniciada a partir de PBMCs as células NK pode ser purificado nesta fase de expansão utilizando o protocolo de purificação RosetteSep (consulte a Seção IV). Se a expansão foi iniciada a partir de células NK purificada proceder à estimulação 3. </li><li> Após purificação de lado 5x10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo para verificar a pureza das células NK (como no Passo 8). </li><li> Prosseguir com Estimulação 3 usando todas as células NK purificado (ver Nota 4). </li></ol> ESTIMULAÇÃO 3 <ol><li> Células NK ressuspender com irradiados K562 CL9 mIL21 (1:1) em Nkem com base em números de células (ver nota 3). </li></ol> Dias 17 e 19 <ol start="2"><li> Contar o número de células. </li><li> Mudança de mídia com Nkem fresco com base no número de células (ver nota 3). </li></ol> Dia 21 <ol start="4"><li> No final de três semanas de expansão contar o número de células em cultura. </li><li> Recuperar 1x10 6 células para análise de citometria de fluxo para o pleno NK painel de anticorpos de células fenotipagem (Ver Tabela 1). </li><li> Congelar células em FBS contendo DMSO 10%, a uma densidade máxima de 5x10 7 células por frasco para uso futuro. </li></ol> 3. NK ensaio de citotoxicidade celular <ol><li> Descongelar um frasco de células NK e sementes em Nkem, um dia antes da performing ensaio de citotoxicidade para permitir a recuperação. </li><li> Para cada ensaio de células NK citotoxicidade usando uma linha única célula-alvo, 6x10 5 células NK e 3x10 5 células-alvo são exigidos (ver nota 5). </li><li> Prepare CAM-Media diluindo calceína-AM (estoque 1 mg / mL em DMSO) em Nkem (Ver Nota 6). </li><li> Ressuspender 10 6 células-alvo em 1 mL de CAM-media (ver nota 7). </li><li> Incubar por 1 hora a 37 ° C, com agitação ocasional. </li><li> Células NK ressuspender em 1x10 6 células / mL e adicionar 200uL de suspensão de células NK a cada um dos três poços de um U-bottom 96 poços da placa a 10 correspondentes: 1 razão E: T mostrado na Figura 1. (Ver Nota 8) </li><li> Adicione 100uL de mídia completo para todos os poços restantes, exceto para "Máximo". </li><li> Adicione 100uL de 2% Triton X-100 a "máxima". </li><li> Realizar diluições em série das células NK para a E 5 subseqüentes: relações T, transferindo 100uL de células de cada vez, misture bem. Descartar 100uL dos poços passado (razão E: T de 0.3125:1). </li><li> Após 1 hora de carregamento calceína, lave as células-alvo em Nkem duas vezes, centrifugação por 5 min a 1200 rpm. (Ver Nota 9) </li><li> Re-contar as células-alvo e ressuspender em 1x10 5 células / mL. </li><li> Adicionar 100 mL de células-alvo para cada poço (1x10 4 / bem). Centrifugar por 1 min a 100g de iniciar o contato da célula. </li><li> Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 por 4 horas. </li><li> Misture delicadamente a cultura por pipetagem com uma pipeta de 100 L, a fim de suspender a uniformemente calceína lançado, spin down placa de 100g por 5 minutos para sedimentar as células e transferir 100 mL do sobrenadante para um novo prato com cuidado para evitar bolhas. Pop as bolhas que se podem formar com agulha fina. </li><li> Leia a placa usando um leitor de placas fluorescentes (excitação filtro de 485 nm, a emissão de filtro de 530 nm). Leitura de fundo é recomendado. </li><li> Calcule Lise Percentual específicas de acordo com a fórmula [(versão de testes de liberação espontânea) / (liberação máxima - liberação espontânea)] x 100. </li></ol> 4. NK Purificação celular por RosetteSep <ol><li> Tome de 100 vezes o excesso de glóbulos vermelhos ao de PBMCs ou células expandidas, em um tubo de 50 mL (100:1 RBC: PBMC). </li><li> Se usar os glóbulos vermelhos frescos prosseguir diretamente para a etapa seguinte ou se a hemácias foram armazenados em solução Alsever s, contar o número de hemácias e de lavagem adequados (100 vezes em excesso) quantidade de hemácias com PBS suplementado com 2% FBS três vezes, centrifugar a 1200 rpm por 10 minutos a cada vez. </li><li> Combine com hemácias PBMCs a partir do passo 1.7 ou células expandidas a partir do passo 2,10 em PBS + 2% de SFB para um volume final de 1 mL por 5x10 7 de PBMCs ou células expandidas. </li><li> Adicionar 1μL de RosetteSep  Human Enrichment Célula NK Cocktail por 1x10 6 de PBMCs ou células expandidas. </li><li> Misture bem e deixe em temperatura ambiente por 20 minutos, com suave mistura a cada 5 minutos. </li><li> Adicionar igual volume de PBS + 2% FBS mix suave e camada em cima de Ficoll-Paque. </li><li> Repita os passos de Ficoll-Paque centrifugação descrita para o isolamento de PBMC (Seção I). </li><li> Contagem das células NK recuperado após purificação e reserve 5x105 células para phenotpying por citometria de fluxo para NK pureza celular (Passo 8). </li></ol> 5. Notas NOTA 1. Células NK pode ser expandida diretamente de PBMCs, ou de RosetteSep  células purificadas NK. Temos observado a eficiência de expansão semelhante, mas alguns doadores podem ter muito baixo o número de células NK, resultando na purificação dificuldade RosetteSep antes da expansão. NOTA 2. Rotineiramente usamos CD56-FITC, CD16-PE, e CD3-PE-Cy5 para fenotipagem durante a expansão, enumerando as células NK como aqueles que são CD3-CD16 negativos e ou CD56-positivo. NOTA 3. A cada troca de mídia ou estimulação, as células ressuspender a 2,5 x 10 5 mL / para manter os números PBMC / NK de células iguais ou abaixo de 2 milhões por mL em estágios de pico de expansão. Isto irá prevenir a depleção de nutrientes e ajudar a alcançar a expansão máxima e sobrevivência. NOTA 4. A taxa de expansão NK é doador dependentes e no final de estímulos 1 ou 2 parte das células pode ser congelada e parte ampliada ainda mais, dependendo da necessidade experimental. Tivemos um bom sucesso na utilização das células congeladas por expansões em um momento posterior. NOTA 5. A fim de permitir espaço para erro recomendamos a utilização de um mínimo de 7x10 5 células NK ressuspenso em 700 uls de Nkem e 5 4x10 calceína-AM células-alvo manchada ressuspenso em 4 mL de Nkem para a configuração do ensaio de citotoxicidade. Se estiver usando uma pipeta multicanal para semeadura células-alvo volumes mais altos de células (até 6x10 5 em 6 mL) pode ser necessário com base no tamanho da mídia de bacia a ser utilizado. Também o número de células NK recomendado especificamente para a E: T mostram índices no protocolo, para a utilização de maior E: relações T aumentaro número de células NK por mL em conformidade (por exemplo, para um 40:1 E: T 4x10 uso proporção 6 células / mL) NOTA 6. Recomendamos realizar uma titulação calceína-AM carregamento preliminar para a linhagem de células-alvo de escolha, utilizando os seguintes diluições de 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 e 1:100 para alcançar diferença ideal entre a liberação máxima e espontânea. NOTA 7. Ao usar uma linha de células aderentes como alvo, primeiro preparar a suspensão única célula usando não enzimático celular buffer de dissociação. Se estiver executando ADCC, prepare um tubo duplicata de células-alvo no CAM-media. NOTA 8 Se executar ADCC, adicione mesmas células NK a 3 poços correspondentes a 10:1 E:. T para o ADCC. Repita o procedimento para doadores adicionais. Repita o procedimento para as células-alvo adicional. NOTA 9. Se realizar um experimento ADCC, após 45 minutos de carregamento calceína, adicione 10ug de anticorpos específicos para induzir o ADCC contra as células-alvo. Após mais 15 minutos, lave as células-alvo em meio completo, duas vezes, centrifugação por 5 min a 1200 rpm. Ressuspender as células em 1x10 5 células / mL e prossiga com a próxima etapa do protocolo. 6. RESULTADOS REPRESENTANTE <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Quando a expansão é realizada conforme o esquema descrito acima, usando 5x106 PBMCs como matéria-prima, típica das células NK rendimento varia de 1x10 outubro 09-10 células (variabilidade doador dependente). A figura mostra a expansão de células NK vezes (n = 19) em comparação com as células NK presentes no produto original (média + / - quartil). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. As células NK expandidas expressar vários receptores de células NK que são comparáveis ​​aos unexpanded principal células NK com algumas exceções (CD11b, CD160 e CD244). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. PBMCs recuperação de Buffy coat é doador dependente e pode variar de 6 a 300x10 800x10 6. Células NK pode incluir 2% - 18% das PBMCs. Para a purificação RosetteSep de células expandidas, recuperação de pura células NK no dia 14 faixas de 40-70%. Seguindo o protocolo recomendado de expansão e purificação, a pureza das células NK de 99% pode ser esperado. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Expanded células NK demonstraram citotoxicidade contra uma série de linhagens de células tumorais, incluindo neuroblastoma, AML, osteosarcoma e melanoma (representante matando AML mostrado como lise por cento específico).

<ol><li>McKenna, D. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy%3A+a+six-year+single-institution+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li>
<li>Koehl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+highly+purified+NK+cells+for+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Klinische+Padiatrie%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children.</a> Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).</li>
<li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li>
<li>Ayello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cord+blood+natural+killer+and+lymphokine+activated+killer+lymphocytes+following+ex+vivo+cellular+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).</li>
<li>Carlens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+in+vitro+expansion+of+cytotoxic+human+CD3-CD56%2B+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells.</a> Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).</li>
<li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li>
<li>North, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed+human+natural+killer+cells+lyse+NK-resistant+tumor+targets%3A+evidence+of+a+two-stage+process+in+resting+NK+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation.</a> J Immunol. 178, 85-85 (2007).</li>
<li>Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-grade+ex+vivo-expanded+human+natural+killer+cells+up-regulate+activating+receptors+and+death+receptor+ligands+and+have+enhanced+cytolytic+activity+against+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells.</a> Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+highly+cytotoxic+human+natural+killer+cells+for+cancer+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy.</a> Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li>
<li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A%2C+4-1BB+ligand%2C+and+interleukin-15%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

NK Expansão de células e meios de ativação (Nkem) <ul><li> 90% RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> 10% de soro fetal bovino (Gibco) </li><li> 1x Penicilina / Estreptomicina (Cellgro) </li><li> 1x L-Glutamine (Gibco) <ul><li> Esterilizar filtro media antes de usar. </li></ul></li><li> 50 U / mL IL2 (Proleukin, Vacinas e Diagnósticos da Novartis, Inc) <ul><li> - Diluído a partir de um estoque 200 IU / mL. Adicionar IL2 a quantidade desejada de mídia imediatamente antes da utilização cada vez. </li></ul></li></ul> PBMC e isolamento de células NK <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Alsever solução de (Sigma) </li><li> RosetteSep Human Enrichment NK Cocktail Cell (Stemcell Technologies) </li></ul> NK ensaio de citotoxicidade celular <ul><li> Calceína-AM (Invitrogen) <ul><li> Solução estoque é de 1 mg / mL loja, congelada em 50 alíquotas mL. Dissolver em media Nkem para alcançar diluição desejada para a coloração de células. </li></ul></li></ul> Anticorpos A lista dos anticorpos utilizados para fenotipagem de células NK estão listadas na tabela abaixo; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Anticorpo </td><td> Volume por teste </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tubo 1 </td><td valign="top"> Isotipo FITC Isotipo FITC Isotipo FITC Isotipo FITC FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tubo 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tubo 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen R &amp; D Systems Miltenyi Biotec R &amp; D Systems BD PharMingen BD PharMingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tubo de 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tubo 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tubo 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS buffer Volume Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD PharMingen BD PharMingen BD PharMingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansão, purificação e avaliação funcional de células nk do sangue periférico

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells 

Natural killer (NK) desempenham um papel importante na vigilância imune contra uma variedade de microorganismos infecciosos e tumores. Disponibilidade limitada de células NK e capacidade de expansão in vitro restringiu o desenvolvimento de NK imunoterapia celular. Aqui nós descrevemos um método eficiente para expandir a vastas quantidades de funcional NK ex vivo células usando células que expressam K562 ligada à membrana IL21, como uma célula apresentadora de antígeno artificial (AAPC). Terapias com células NK adotivos até à data têm utilizado um produto de células obtidas por steady-state leucaférese do doador seguida pela depleção de células T ou seleção positiva de células NK. O produto é geralmente activado no IL-2 durante a noite e então administrado no dia seguinte 1. Devido à baixa freqüência de células NK no sangue periférico, um número relativamente pequeno de células NK foram entregues nos ensaios clínicos. A incapacidade para propagar células NK in vitro tem sido o fator limitante para a geração de números de celular suficiente para um resultado clínico favorável. Alguma expansão das células NK (10/05 vezes ao longo de 1-2 semanas) tem ser alcançado através de altas doses de IL-2 sozinho 2. Ativação de células T autólogas podem mediar a expansão das células NK, presumivelmente, também através da liberação de citocinas local 3. Suporte com estroma mesenquimal ou células antígeno apresentando artificial (aAPCs) pode apoiar a expansão das células NK, tanto sangue periférico e sangue do cordão 4. NKp46 combinado e CD2 ativação por anticorpos revestido contas é atualmente comercializado para expansão de células NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resultando em expansão de cerca de 100 vezes em 21 dias. Ensaios clínicos utilizando AAPC-expandido ou ativadas as células NK estão em curso, uma utilizando a linha de células leucêmicas CTV-1 para o principal e ativar as células NK 5, sem expansão significativa. Um segundo julgamento utiliza EBV-LCL para expansão de células NK, atingindo uma média de expansão 490 vezes em 21 dias 6. A terceira utiliza uma AAPC K562 baseado transduzidas com 4-1BBL (CD137L) e ligada à membrana IL-15 (MIL-15) 7, que alcançou uma média de expansão NK 277 vezes em 21 dias. Embora, as células NK expandida usando K562-41BBL-mIL15 AAPC são altamente citotóxica in vitro e in vivo em comparação com unexpanded células NK, e participar no ADCC, sua proliferação é limitada pela senescência encurtamento dos telômeros atribuída a 8. Mais recentemente, uma expansão de 350 vezes das células NK foi relatado usando K562 MICA expressar, 4-1BBL e IL15 9. Nosso método de expansão de células NK aqui descritos produz rápida proliferação das células NK, sem senescência alcançar uma expansão média 21 mil vezes em 21 dias.

Aqui nós descrevemos um método eficiente para expandir e purificar um grande número de células NK e avaliar a sua função.

Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

As células natural killer (NK) desempenham um papel importante na vigilância imunológica contra uma variedade de microrganismos infecciosos e tumores. A disponibilidade limitada de...

O objetivo geral deste procedimento é expandir rapidamente grandes quantidades de células NK humanas. Ex vivo, comece isolando PBMCs ou células NK de amostra de coágulo de buffy ou sangue total. Em seguida, cultive pbmc em co-cultura com células apresentadoras de antígeno artificiais na expansão de células NK.Meio suplementado com IL-2 mantém o cultivo de células NK por três semanas, com estimulações semanais utilizando células APC, tomando o cuidado de manter o número de células NK abaixo de 1 × 10⁶ por mililitro de cultivo. Por fim, valida-se a eficácia funcional das células NK expandidas por meio de um ensaio de citotoxicidade não radioativo. Um rendimento típico de células NK com este esquema de expansão resulta em uma expansão mediana de 21.000 vezes após 21 dias, apresentando alta citotoxicidade contra diversos tumores, conforme determinado por um ensaio de liberação de cálcio.Este método pode ajudar a responder uma questão fundamental no campo da biologia das células NK, pois historicamente tem sido muito difícil obter grandes quantidades dessas células. Esta técnica tem implicações para a imunoterapia do câncer humano, pois gerar número suficiente de células NK para tal terapia tem sido historicamente muito difícil. A demonstração desta técnica será feita por Cecily, a assistente sênior de pesquisa do meu laboratório, para obter PBMCs a partir de sangue de doadores saudáveis.Normalmente, utiliza-se o coágulo sanguíneo do banco de sangue como fonte. Primeiro, adicione PBS para ajustar o volume do coágulo sanguíneo a 140 mililitros. Em seguida, sobreponha 35 mililitros da amostra sobre 15 mililitros de fial PA para a centrifugação de separação em gradiente a 400 G por 20 minutos.Sem a quebra. Recupere cuidadosamente os BMCs P da interface plasma Fial PA e reserve o tubo de hemácias para uso posterior. Lave os BMCs P três vezes com PBS, centrifugando cada vez a 400 ×g por 10 minutos.Utilize esta fração de BMCs para a expansão de células NK. Agora retorne ao tubo de gradiente. Aspire o fi.Chame e transfira as hemácias para dois tubos de centrífuga de 50 mililitros e lave com PBS adicionado até a marca de 50 mililitros. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante passando suavemente sobre a camada de hemácias. Para remover os granulócitos.Realize três lavagens, depois reconstitua os eritrócitos em um volume igual de solução else's e armazene a quatro graus Celsius por até um mês. Esta fração de eritrócitos pode ser usada para a purificação por rosetas SEP de células NK ao final de duas semanas de expansão. Para expandir eficientemente células NK funcionais ex vivo, utilize células do clone K 5 62 nove com IL 21 ligada à membrana, referidas doravante como K 5 62.Clone nove de IL-21 é usado como célula apresentadora de antígeno artificial. Primeiro, conte os PBMCs e calcule o volume necessário para cinco vezes 10 à sexta potência de células a serem semeadas para a expansão de células NK. Para cada contagem de cinco vezes 10 à sexta potência de PBMCs, irradie dez vezes 10 à sexta potência de células K562 clone nove IL-21. Utilize um irradiador gama a 100 Gy; as células irradiadas também podem ser congeladas para uso futuro. Agora, lave as células pré-irradiadas com PBS e re-suspenda-as em meio de expansão de células NK.Agora, observe uma proporção de dois para um de células irradiadas com PBMC em 40 mililitros de meio de expansão de células NK e coloque o frasco T75 em posição vertical em um incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no terceiro dia. Recupere as células estimuladas por centrifugação a 400 ×g durante cinco minutos e substitua metade do meio por NKEM fresco, continuando o cultivo. Repita a troca do meio no quinto dia. Ao final de uma semana, conte o número de células, separe cinco vezes 10 à quinta potência de células para fenotipagem por citometria de fluxo para a segunda estimulação, e irradie uma proporção de um para um de K562.Clone nove células IL 21 para expandir suas células e, em seguida, combine as células em meio de expansão de células NK a 2,5 vezes 10 à quinta células totais por mililitro. Agora, semeie as células em frascos T 75 e continue o cultivo nos dias 10 e 12, repassando as células em meio de expansão de células NK a 2,5 vezes 10 à quinta células por mililitro no dia 14 de expansão. Novamente, enumere as células e fenotipe uma amostra por citometria de fluxo.Realize a purificação dessa expansão celular derivada de PBMC utilizando o protocolo de purificação por separação em rosetas SEP e verifique a pureza das células NK por meio de fenotipagem por citometria de fluxo. Realize uma terceira estimulação nas células NK purificadas utilizando uma proporção de um para um de células K 5 62 clone nine IL 21 irradiadas. Finalmente, no dia 21, analise as células NK amplificadas por citometria de fluxo utilizando um painel completo de anticorpos para fenotipagem.Congele estoques de células em FBS contendo 10% de DMSO com densidade máxima de cinco vezes 10⁷ células por frasco. Utilize células NK frescas ou congeladas para o ensaio de citotoxicidade. Se utilizar células NK congeladas, descongele primeiro o frasco de células NK e semeie em NKEM por 24 horas para permitir a recuperação celular no dia do ensaio, ressuspenda 10⁶ células-alvo em um mililitro de NKEM contendo cálcio am e incube por uma hora a 37 °C com agitação ocasional em uma placa UBO de 96 poços; adicione, em triplicata, 200 microlitros de células NK ressuspensas a uma concentração de uma vez 10⁶ células por mililitro e realize diluições seriadas das células conforme indicado.Após uma hora de carregamento com cálcio, lave as células-alvo duas vezes no meio de expansão de células NK por centrifugação durante cinco minutos a 400 ×g. Reconte as células-alvo e reconstitua-as a uma concentração de um vezes 10 à quinta células por mililitro. Adicione 100 microlitros das células-alvo a cada poço de uma placa de 96 poços e centrifugue por um minuto a 100 ×g para iniciar o contato celular; incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas.Para suspender uniformemente o cálcio liberado, misture suavemente a cultura por pipetagem, centrifugando as células do pellet a 100 ×g durante cinco minutos e transfira 100 microlitros do sobrenadante para uma nova placa plana de 96 poços, tomando cuidado para evitar bolhas; se necessário, remova quaisquer bolhas que possam se formar usando uma agulha fina. Leitura da placa utilizando um leitor de placas com fluorescência ajustado ao filtro de excitação de 485 nanômetros e ao filtro de emissão de 530 nanômetros.Calcule a lise específica percentual. Normalmente, a expansão de cinco vezes 10 à sexta pbmc isoladas do coágulo de buffy produz entre um vezes 10 à nona e 10 à décima. Células NK, as células NK expandidas expressam vários receptores de células NK comparáveis aos de células NK primárias não expandidas presentes no coágulo de buffy.As células NK podem compor de 2 a 18% dos PBMC no dia 14. A purificação por rosetas SEP de células expandidas pode recuperar de 40 a 70% das células NK presentes na cultura, com uma pureza de células NK de 99%, indicada pelo CD três. Células NK expandidas negativas para CD 56 e positivas para células positivas demonstraram citotoxicidade contra uma variedade de linhagens celulares tumorais, incluindo neuroblastoma, leucemia mieloide aguda, osteossarcoma e melanoma.Aqui, a citotoxicidade representativa mediada por LMC é mostrada como porcentagem de lise específica. O vídeo BIOT ao vivo mostra a ação citotóxica de células NK sobre a linhagem de neuroblastoma CHP 134 carregada com amálgama de cálcio após este procedimento. Outros métodos, como a análise da produção de citocinas pelas células NK e a transferência adaptativa em modelos animais de tumor, podem ser realizados, você sabe, para responder perguntas adicionais sobre as funções das células NK.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expandir e purificar grandes quantidades de células NK. Isso pode ser realizado diretamente a partir de células mononucleares do sangue periférico, seguido da purificação das células NK, ou a expansão pode ser iniciada utilizando células NK purificadas pelo método de roseta. No início, um coágulo típico de leucócitos (buffy coat) fornecerá de 15 a 40 milhões de células NK, todas as quais podem ser utilizadas para expandir um número muito grande de células NK usando o esquema descrito neste método.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui nós descrevemos um método para ativar e expandir células humanas NKT de granel populações de células T com células artificiais apresentando antígeno (AAPC). O uso de CD1d baseado AAPC fornece um método padronizado para a geração de números elevados de células NKT funcionais.

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

Este vídeo demonstra uma técnica para a expansão de células natural killer (NK) diretamente de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) usando uma linhagem de células alimentadoras. As PBMCs são co-cultivadas com células alimentadoras linfoblastóides geneticamente modificadas que expressam interleucina-21 ligada à membrana (mIL-21), e a cultura é suplementada com as citocinas interleucina-2 (IL-2) e interleucina-15 (IL-15). Juntos, esse coquetel de ligantes leva à expansão prolongada...

Expansão ex vivo de células assassinas naturais de células mononucleares do sangue periférico

Este protocolo descreve o desenvolvimento, a expansão, e in vivo de imagens de células NK derivadas de hESCs e iPSCs.

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

Aqui apresentamos um protocolo adaptado que pode ser usado para gerar um grande número de células T natural killer invariantes murinas do baço de camundongo. O protocolo descreve uma abordagem pela qual as células iNKT esplênicas podem ser enriquecidas, isoladas e expandidas in vitro usando um número limitado de animais e reagentes.

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Um método baseado em citometria de fluxo para determinar quantitativamente a atividade citotóxica de células humanas de assassino natural é mostrado aqui.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Um protocolo para estudar eventos orientados pela FcγRIIIa por anticorpos terapêuticos em células assassinas naturais humanas é descrito aqui. Esta plataforma de estimulação artificial permite o interrogatório de funções de efeitos a jusante, como degranulação, produção de quimiocina/citocina, e caminhos de sinalização mediados pelas porções fcγriiia e fc de anticorpos envolvidos na vinculação.

Avaliação de Eventos celulares assassinos naturais humanos impulsionados pelo engajamento da FcγRIIIa na presença de anticorpos terapêuticos

Descrevemos um protocolo rápido e robusto para enriquecer células T (iNKT) invariantes do assassino natural do baço do rato e expandi-las in vitro para números adequados para estudos in vitro e in vivo.

Purificação e Expansão de Células T Assassinos Naturais Invariantes para Estudos In vitro e In vivo

Aqui, apresentamos um método para expandir o natural killer do sangue periférico (PBNK), células NK de tecidos hepáticos e células do receptor de antígeno quimérico (CAR)-NK derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou sangue do cordão umbilical (CB). Este protocolo demonstra a expansão das células NK e CAR-NK usando células alimentadoras de 221-mIL-21, além da pureza otimizada das células NK expandidas.

Natural Killer (NK) e Método de Expansão Celular CAR-NK usando a Linha Celular B Modificada por IL-21 Ligada à Membrana

O presente protocolo mostra como diferenciar células CD3−/CD45+CD56+ com citotoxicidade leve de células-tronco potenciais expandidas humanas (hEPSCs) em condições de cultura 3D e 2D. Isso permite a validação fenotípica de rotina sem a destruição do microambiente complexo.

Geração de células assassinas naturais a partir de células-tronco de potencial expandido humano

Aprenda a expandir e purificar células NK humanas do sangue periférico usando células apresentadoras de antígeno artificiais. Este método permite obter grandes quantidades de células NK funcionais para imunoterapia contra câncer.

Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

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