Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

O objetivo geral deste procedimento é expandir rapidamente grandes quantidades de células NK humanas. Ex vivo, comece isolando PBMCs ou células NK de amostra de coágulo de buffy ou sangue total. Em seguida, cultive pbmc em co-cultura com células apresentadoras de antígeno artificiais na expansão de células NK.

Meio suplementado com IL-2 mantém o cultivo de células NK por três semanas, com estimulações semanais utilizando células APC, tomando o cuidado de manter o número de células NK abaixo de 1 × 10⁶ por mililitro de cultivo. Por fim, valida-se a eficácia funcional das células NK expandidas por meio de um ensaio de citotoxicidade não radioativo. Um rendimento típico de células NK com este esquema de expansão resulta em uma expansão mediana de 21.000 vezes após 21 dias, apresentando alta citotoxicidade contra diversos tumores, conforme determinado por um ensaio de liberação de cálcio.

Este método pode ajudar a responder uma questão fundamental no campo da biologia das células NK, pois historicamente tem sido muito difícil obter grandes quantidades dessas células. Esta técnica tem implicações para a imunoterapia do câncer humano, pois gerar número suficiente de células NK para tal terapia tem sido historicamente muito difícil. A demonstração desta técnica será feita por Cecily, a assistente sênior de pesquisa do meu laboratório, para obter PBMCs a partir de sangue de doadores saudáveis.

Normalmente, utiliza-se o coágulo sanguíneo do banco de sangue como fonte. Primeiro, adicione PBS para ajustar o volume do coágulo sanguíneo a 140 mililitros. Em seguida, sobreponha 35 mililitros da amostra sobre 15 mililitros de fial PA para a centrifugação de separação em gradiente a 400 G por 20 minutos.

Sem a quebra. Recupere cuidadosamente os BMCs P da interface plasma Fial PA e reserve o tubo de hemácias para uso posterior. Lave os BMCs P três vezes com PBS, centrifugando cada vez a 400 ×g por 10 minutos.

Utilize esta fração de BMCs para a expansão de células NK. Agora retorne ao tubo de gradiente. Aspire o fi.

Chame e transfira as hemácias para dois tubos de centrífuga de 50 mililitros e lave com PBS adicionado até a marca de 50 mililitros. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante passando suavemente sobre a camada de hemácias. Para remover os granulócitos.

Realize três lavagens, depois reconstitua os eritrócitos em um volume igual de solução else's e armazene a quatro graus Celsius por até um mês. Esta fração de eritrócitos pode ser usada para a purificação por rosetas SEP de células NK ao final de duas semanas de expansão. Para expandir eficientemente células NK funcionais ex vivo, utilize células do clone K 5 62 nove com IL 21 ligada à membrana, referidas doravante como K 5 62.

Clone nove de IL-21 é usado como célula apresentadora de antígeno artificial. Primeiro, conte os PBMCs e calcule o volume necessário para cinco vezes 10 à sexta potência de células a serem semeadas para a expansão de células NK. Para cada contagem de cinco vezes 10 à sexta potência de PBMCs, irradie dez vezes 10 à sexta potência de células K562 clone nove IL-21. Utilize um irradiador gama a 100 Gy; as células irradiadas também podem ser congeladas para uso futuro. Agora, lave as células pré-irradiadas com PBS e re-suspenda-as em meio de expansão de células NK.

Agora, observe uma proporção de dois para um de células irradiadas com PBMC em 40 mililitros de meio de expansão de células NK e coloque o frasco T75 em posição vertical em um incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no terceiro dia. Recupere as células estimuladas por centrifugação a 400 ×g durante cinco minutos e substitua metade do meio por NKEM fresco, continuando o cultivo. Repita a troca do meio no quinto dia. Ao final de uma semana, conte o número de células, separe cinco vezes 10 à quinta potência de células para fenotipagem por citometria de fluxo para a segunda estimulação, e irradie uma proporção de um para um de K562.

Clone nove células IL 21 para expandir suas células e, em seguida, combine as células em meio de expansão de células NK a 2,5 vezes 10 à quinta células totais por mililitro. Agora, semeie as células em frascos T 75 e continue o cultivo nos dias 10 e 12, repassando as células em meio de expansão de células NK a 2,5 vezes 10 à quinta células por mililitro no dia 14 de expansão. Novamente, enumere as células e fenotipe uma amostra por citometria de fluxo.

Realize a purificação dessa expansão celular derivada de PBMC utilizando o protocolo de purificação por separação em rosetas SEP e verifique a pureza das células NK por meio de fenotipagem por citometria de fluxo. Realize uma terceira estimulação nas células NK purificadas utilizando uma proporção de um para um de células K 5 62 clone nine IL 21 irradiadas. Finalmente, no dia 21, analise as células NK amplificadas por citometria de fluxo utilizando um painel completo de anticorpos para fenotipagem.

Congele estoques de células em FBS contendo 10% de DMSO com densidade máxima de cinco vezes 10⁷ células por frasco. Utilize células NK frescas ou congeladas para o ensaio de citotoxicidade. Se utilizar células NK congeladas, descongele primeiro o frasco de células NK e semeie em NKEM por 24 horas para permitir a recuperação celular no dia do ensaio, ressuspenda 10⁶ células-alvo em um mililitro de NKEM contendo cálcio am e incube por uma hora a 37 °C com agitação ocasional em uma placa UBO de 96 poços; adicione, em triplicata, 200 microlitros de células NK ressuspensas a uma concentração de uma vez 10⁶ células por mililitro e realize diluições seriadas das células conforme indicado.

Após uma hora de carregamento com cálcio, lave as células-alvo duas vezes no meio de expansão de células NK por centrifugação durante cinco minutos a 400 ×g. Reconte as células-alvo e reconstitua-as a uma concentração de um vezes 10 à quinta células por mililitro. Adicione 100 microlitros das células-alvo a cada poço de uma placa de 96 poços e centrifugue por um minuto a 100 ×g para iniciar o contato celular; incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas.

Para suspender uniformemente o cálcio liberado, misture suavemente a cultura por pipetagem, centrifugando as células do pellet a 100 ×g durante cinco minutos e transfira 100 microlitros do sobrenadante para uma nova placa plana de 96 poços, tomando cuidado para evitar bolhas; se necessário, remova quaisquer bolhas que possam se formar usando uma agulha fina. Leitura da placa utilizando um leitor de placas com fluorescência ajustado ao filtro de excitação de 485 nanômetros e ao filtro de emissão de 530 nanômetros.

Calcule a lise específica percentual. Normalmente, a expansão de cinco vezes 10 à sexta pbmc isoladas do coágulo de buffy produz entre um vezes 10 à nona e 10 à décima. Células NK, as células NK expandidas expressam vários receptores de células NK comparáveis aos de células NK primárias não expandidas presentes no coágulo de buffy.

As células NK podem compor de 2 a 18% dos PBMC no dia 14. A purificação por rosetas SEP de células expandidas pode recuperar de 40 a 70% das células NK presentes na cultura, com uma pureza de células NK de 99%, indicada pelo CD três. Células NK expandidas negativas para CD 56 e positivas para células positivas demonstraram citotoxicidade contra uma variedade de linhagens celulares tumorais, incluindo neuroblastoma, leucemia mieloide aguda, osteossarcoma e melanoma.

Aqui, a citotoxicidade representativa mediada por LMC é mostrada como porcentagem de lise específica. O vídeo BIOT ao vivo mostra a ação citotóxica de células NK sobre a linhagem de neuroblastoma CHP 134 carregada com amálgama de cálcio após este procedimento. Outros métodos, como a análise da produção de citocinas pelas células NK e a transferência adaptativa em modelos animais de tumor, podem ser realizados, você sabe, para responder perguntas adicionais sobre as funções das células NK.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expandir e purificar grandes quantidades de células NK. Isso pode ser realizado diretamente a partir de células mononucleares do sangue periférico, seguido da purificação das células NK, ou a expansão pode ser iniciada utilizando células NK purificadas pelo método de roseta. No início, um coágulo típico de leucócitos (buffy coat) fornecerá de 15 a 40 milhões de células NK, todas as quais podem ser utilizadas para expandir um número muito grande de células NK usando o esquema descrito neste método.