Uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no Flies

Olá, sou Thomas Maples do laboratório do Dr. Adrian Rothenfluh, do Departamento de Psiquiatria do Centro Médico UT Southwestern em Dallas. Hoje demonstrarei um procedimento simples para determinar a sensibilidade de moscas à sedação por etanol. Este ensaio baseia-se na perda do reflexo de endireitamento e da capacidade de locomoção das moscas após exposição ao etanol.

Essa medida pode ser usada para determinar as diferenças de sensibilidade ao álcool entre diferentes linhagens de drosófila e mutantes. Também podemos usar este ensaio para induzir tolerância em moscas, sendo a tolerância uma resposta reduzida ao álcool após exposições repetidas. Vamos começar.

Para este experimento, você precisará dos seguintes frascos. Com oito moscas-das-frutas, um espécime que você coletou um ou dois dias antes. Você pode realizar as exposições com machos ou fêmeas.

No entanto, cada frasco deve conter apenas um sexo. Um frasco de alimento vazio que não contenha moscas, uma lâmina de barbear, duas tampas de frasco feitas de material semelhante ao algodão. Se você não tiver esse tipo de tampa, também pode usar bolas de algodão, uma micropipeta de 1000 microlitros com ponteiras, etanol a 200 provas que contenha corante alimentar, que pode ser adquirido em qualquer mercearia, e um cronômetro.

A primeira coisa que precisamos fazer é criar uma câmara de exposição na qual exporemos as moscas ao etanol e monitoraremos sua mobilidade. Para criar essa câmara, primeiro corte ao meio uma tampa de frasco usando uma lâmina de barbear. Em seguida, empurre uma das metades até o fundo de um frasco, cobrindo o alimento.

Isso cria uma superfície nivelada e não aderente para as moscas andarem. Se você usar uma bola de algodão, pressione-a suavemente e tente deixá-la o menos felpuda possível para que as moscas não fiquem presas nos fios de algodão. Se estiver preparando múltiplas câmaras, certifique-se de que a comida e a tampa do frasco ocupem a mesma quantidade de espaço em cada câmara.

Isso garante que as moscas em cada câmara sejam expostas ao etanol no mesmo volume. Com prática, é fácil expor três frascos de moscas em paralelo. Uma vez que as câmaras de exposição estejam prontas, podemos agora expor as moscas ao etanol.

Primeiro, transfira um frasco com oito moscas para uma câmara de exposição, fechando a câmara com a tampa do frasco que originalmente continha as moscas. Em seguida, pipete 500 microlitros de etanol corado na concentração escolhida em uma das extremidades de uma tampa de frasco semelhante a algodão. Depois, substitua a tampa da câmara de exposição pela tampa revestida com etanol, inserindo a extremidade revestida com etanol dentro da câmara.

Imediatamente após a adição do tampão revestido com etanol à câmara de exposição, inicie um cronômetro. O corante no etanol ajuda a garantir que o etanol esteja voltado para dentro da câmara de exposição e não para a parede do frasco. Isso é especialmente importante se você usar bolas de algodão em vez de tampões específicos, pois qualquer lado de uma bola de algodão pode ficar voltado para dentro do frasco.

Nesta exposição, estamos utilizando álcool a 100%, que agora está se difundindo na câmara de exposição, onde as moscas o inalam pelo ar. A cada minuto após a adição da tampa revestida com etanol à câmara de exposição, contaremos quantas moscas se tornaram imóveis, ou seja, incapazes de se virar e andar. Quanto mais tempo as moscas permanecerem móveis, maior será a resistência delas em cada intervalo de um minuto.

Assuste as moscas batendo levemente o compartimento na bancada para garantir que todas as moscas que conseguem se mover estejam em movimento. Observe as moscas por 10 segundos após a batida, para dar tempo de começarem a se mover ou se virarem, a cada intervalo de um minuto. Registre quantas das oito moscas estão imóveis no início do experimento.

A maioria das moscas correrá rapidamente para cima do frasco após ser assustada. Após cerca de seis minutos de exposição ao etanol a 100%, começam a se mover lentamente e, às vezes, de forma errática por volta dos 12 minutos. A maioria das moscas ficará imóvel, incapaz de andar ou se virar quando estiver de costas.

Somente as moscas que conseguem se virar e andar devem ser contadas como moscas móveis; aquelas que apenas movem as pernas ou asas no mesmo lugar devem ser contadas como moscas estacionárias. As moscas que permanecem de costas durante todo o período de observação também devem ser contadas como estacionárias, pois a incapacidade de se virar é um sinal de intoxicação. Moscas que vibram vigorosamente as asas durante todo o período de observação de dez segundos devem igualmente ser consideradas estacionárias, mesmo que mudem de posição. A grande maioria dessas moscas permanece estacionária entre períodos de movimento rápido das asas.

Em resumo, moscas capazes de se virar e andar são moscas móveis; aquelas incapazes de se virar, mover as pernas e asas no lugar ou vibrar rapidamente as asas são estacionárias. Se aplicarmos essas regras, observamos que um número maior de moscas do tipo selvagem torna-se estacionário à medida que aumenta o tempo de exposição aos vapores de etanol. O valor que este ensaio utiliza para quantificar a sensibilidade ao etanol é o tempo mediano de sedação, ou TMS.

Definimos MST como os minutos de exposição ao etanol necessários para que quatro das oito moscas na câmara de exposição fiquem imóveis. Esse valor é facilmente determinado se exatamente quatro moscas estiverem imóveis em um período específico de observação. Por exemplo, se exatamente quatro moscas estiverem imóveis após 11 minutos de exposição, então 11 é o MST.

Se exatamente quatro moscas estiverem imóveis após 11 minutos de exposição e, aos 12 minutos, a mesma condição for observada, considere o primeiro valor como o momento em que as moscas atingem pela primeira vez seu TS. Se quatro moscas não estiverem imóveis em um determinado período de observação, é necessário interpolar linearmente o tempo em que quatro moscas se tornaram imóveis. Por exemplo, se o número de moscas imóveis saltar de três para cinco entre nove e dez minutos de exposição, pode-se determinar graficamente que o TSM é 9,5. Os seguintes dados coletados utilizando este ensaio mostram que este delineamento experimental é uma maneira precisa de medir a sensibilidade ao etanol.

Um N de seis a oito frascos foi utilizado nos experimentos a seguir, o que está indicado dentro das barras. O TMS de moscas machos do tipo selvagem expostas ao etanol a 100% é de aproximadamente 11 minutos, com um erro padrão baixo. A variabilidade dia a dia é baixa e, na maioria das vezes, não é estatisticamente significativa, mas ainda assim recomendamos que você meça seus grupos experimentais e controles em paralelo, no mesmo dia.

Observe também que as moscas expostas no dia A e no dia B não são os mesmos indivíduos. Trata-se de irmãos que representam o mesmo estoque genético. Moscas machos e fêmeas expostas ao Etanol 100% não mostram diferença no MST. Ainda assim, recomendamos manter-se com um único sexo.

Se expusermos moscas machos e fêmeas a doses crescentes de etanol, obtemos uma boa curva de resposta à dose que mostra uma diminuição estatisticamente significativa no MST em função do aumento da concentração de etanol. Este ensaio também reproduz fenótipos previamente publicados que foram medidos com um aparato mais elaborado de vaporização de etanol: moscas com a mutação *right rabbit one* apresentaram um aumento significativo no MST. Esse aumento foi observado tanto com etanol a 100% quanto com etanol a 90%.

Utilizando este ensaio, também podemos induzir e medir a tolerância ao etanol em moscas. A tolerância é definida como uma redução na resposta ao álcool após uma exposição prévia ao álcool para induzir a tolerância. Exponha um frasco de moscas ao etanol por aproximadamente duas vezes o seu TMS.

Por exemplo, expomos esses machos da linhagem selvagem Berlin a etanol 100% por 24 minutos. Após a exposição, bata suavemente no tubo para devolver as oito moscas ao frasco com alimento, onde serão deixadas em recuperação por quatro horas. Registre o TMS original das moscas no frasco após quatro horas de recuperação, exponha novamente exatamente as mesmas moscas à mesma dose de etanol e registre o segundo TMS.

Como é possível observar neste gráfico, o TMS da segunda exposição ao etanol é significativamente maior do que o TMS da primeira exposição, indicando que as moscas desenvolveram tolerância aos efeitos sedativos do etanol. Uma medida de tolerância é calculada dividindo o segundo TMS de um dado frasco de moscas pelo primeiro TMS das mesmas moscas e subtraindo um; o valor é expresso como porcentagem de tolerância, que, no nosso caso, é de aproximadamente 50%. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.