Name: Uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no Flies (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprenda a medir a sensibilidade ao etanol em Drosophila melanogaster usando um ensaio simples baseado na perda do reflexo de endireitamento. Este método permite quantificar diferenças na sensibilidade alcoólica entre diferentes linhagens e mutantes de moscas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Aylin Rodan para a leitura crítica do manuscrito, e os membros do laboratório para discussão útil. Esta pesquisa é apoiada pelo NIH, R01AA019526.

1. Criando a câmara de exposição <ol><li> Cortar um plug frasco pela metade utilizando uma lâmina de barbear. Alternativamente, use bolas de algodão. </li><li> Empurrar o meia ficha frasco, ou a bola de algodão, para o fundo de um frasco de comida para fazer uma superfície lisa que as moscas não vai ficar preso dentro </li><li> Se fazer câmaras de exposição múltipla, certifique-se que o plugue do frasco e alimentos ocupam o mesmo volume em cada câmara. A marca na parede do frasco pode facilitar este processo. </li></ol> 2. Expondo as moscas <ol><li> Colete 8 voa de um sexo, idade 1-5 dias, o dia antes da exposição em frascos de alimentos regulares, sem fermento. </li><li> Classificá-los em código, de modo que o experimentador é cego para o genótipo real / cepa utilizada. </li><li> Transferência dos oito voa para as câmaras de exposição tocando. Não anestesiar. </li><li> Adicionar uma pequena quantidade de alimentos corantes, por exemplo, ácido azul 9, a 200 etanol prova para torná-lo facilmente visível. </li><li> Brasão fundo do frasco de um plug, ou bola de algodão, com 0,5 ml de etanol. </li><li> Insira o plugue de etanol para o frasco de exposição. Garantir que o álcool é voltada para o frasco, e não em direção à parede do frasco. </li><li> Iniciar um temporizador de contagem acima. </li></ol> 3. Intoxicação registro induzida por etanol <ol><li> Cada minuto após o timer é iniciado, toque na câmara de exposição no banco de reservas para surpreender as moscas e observá-los por dez segundos. </li><li> Registrar o número de moscas estacionárias para cada minuto. Moscas são estacionários se eles não podem sair de costas, permanecem em um local, ou rapidamente vibrar as asas durante toda a dez segundos período de observação. As moscas últimos são considerados estacionários porque a grande maioria destas moscas são estacionários entre os períodos de movimento rápido das asas. Moscas não são estacionários se eles podem sair as costas e ir embora e / ou até a parede do frasco. </li><li> Um ensaio de exposição termina quando quatro ou mais moscas são registrados como estacionário. </li><li> Descartar moscas e deixar o ar câmara de exposição para fora para reutilização posterior. </li></ol> 4. Determinar o tempo de sedação 50% O tempo para sedação de 50% (ST50) é o tempo após o início da exposição ao etanol, quando quatro dos oito moscas permanecem estacionários. Isto é determinado da seguinte forma: Ou: no minuto primeira medição, quando exatamente quatro moscas são estacionárias. Ou: se menos de quatro moscas (Y1) são estacionários em um ponto do tempo (X minutos), e mais de quatro (Y2) no próximo ponto de medição do tempo (minutos X +1), então linearmente interpolar o ST50 utilizando a fórmula: ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X 5. Repita a exposição para determinar a tolerância Expondo as moscas <ol><li> Determinar o ST50 (wt) para uma estirpe de controlo do tipo selvagem utilizado na experiência. </li><li> Expor os grupos experimentais de moscas para o etanol, como descrito acima. </li><li> Medir a sua ST50 (1), mas continuam a expor até chegar o tempo 2x ST50 (wt). </li><li> Transferência das moscas de volta em um frasco vazio de alimentos, e segure por 4 horas. </li><li> Re-expor as moscas, e determinar o ST50 (2) da exposição 2. </li></ol> Determinar a tolerância Calcule a tolerância em% como (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100. 6. Resultados representativos: Mostrados aqui, são alguns resultados representativos obtivemos com 6-8 frascos de moscas por genótipo e dose. Se o seu erro padrão é substancialmente maior, então um problema sistemático provavelmente ocorreu. Certifique-se de que o etanol enfrenta nas câmaras de exposição, e que as câmaras são o mesmo volume. <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Curva de resposta de dose do tipo selvagem voa expostos a aumento do percentual de etanol. Oito frascos de moscas foram expostos por dose e sexo. Machos e das fêmeas mostram o ST50 mesmo em cada dose (p&gt; 0,22, 2-way ANOVA), enquanto o ST50 em doses diminui significativamente com a dose crescente de etanol (p &lt;0,001). Note que voa de superlotado garrafas pode ser substancialmente menor do que os de garrafas saudável, e esta diferença de tamanho pode afetar o ST50. Garrafa de semente, cada uma com fêmeas 15-20 postura por 1-2 dias para obter a densidade larval ótimo por garrafa. <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Expondo voa para tanto o etanol 90%, ou 100% reproduz o anteriormente descrito etanol resistência causada pelo branco rabbit1 mutation2 (p &lt;0,001, 2-way ANOVA). <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Repita a exposição ao etanol a 100%, espaçadas por um intervalo de recuperação de 4 horas, causa um aumento significativo na ST50 após a segunda exposição (p &lt;0,001, t emparelhado-Teste). Note que as moscas foram expostos por 24 minutos durante a primeira exposição (correspondente a duas vezes ve nd suas ST50). Exposição para um curto período de tempo (12 minutos) não causou um aumento significativo na ST50 sobre a re-exposição (dados não mostrados).

<ol><li>Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y., Singh, C. S., Moore, M. S. Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).</li>
<li>Rothenfluh, A., Threlkeld, R. J., Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y. Cell. 127, 199-211 (2006).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).</li>
<li>Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. S., Heberlein, U. Neuron. 28, 261-271 (2000).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nesta apresentação, nós esboçamos uma maneira simples para determinar a intoxicação induzida por etanol com base em ensaios anteriores descritos por Bainton et al. 2000 1, e Rothenfluh et al. 2006 2. Desde sedação induzida pelo álcool está correlacionado com a preferência de beber álcool 3, este ensaio é relevante para o estudo dos transtornos por uso de álcool. O ensaio descrito baseia-se em sobressalto induzida geotaxis negativo, e como a exposição de um álcool interfere com a resposta inata. Antes de iniciar a exposição, certifique-se todas as suas moscas mostram uma resposta normal a um tal de sobressalto, isto é, depois de tocar as moscas dentro do frasco de alimentos, todas devem subir de baixo para dentro de um tempo de observação de 10 segundos. Exemplos de moscas ter reduzido geotaxis negativos incluem mutantes bang-sensível apreensão 5, e com deficiência de locomoção moscas causada por degeneração dos neurônios dopaminérgicos 6. Mesmo que o ensaio descrito é relativamente simples, duas variáveis ​​merecem a maior atenção para garantir a reprodutibilidade dos resultados. Primeiro, todos os frascos de exposição deve ser o mesmo volume. Isto inclui assegurar que o fundo do frasco contém o mesmo volume de alimentos bola + frasco ficha / algodão, bem como inserir o plug-etanol contendo a mesma distância para cada frasco. Um frasco completamente vazio pode ser utilizado para este ensaio, mas leva a valores mais ST50, diminuindo a transmissão do ensaio. Este ensaio também é adequado para determinar a quantidade de moscas tolerância desenvolver após a exposição de etanol repetir. Uma série de variáveis ​​devem ser consideradas quando se faz exposições repetidas. Primeiro, o intervalo inter-exposição é aqui descrito como 4 horas. Esta variável pode ser alterado, mas recomendamos que não seja inferior a 2 horas, para garantir a liberação de etanol a partir da primeira exposição. Ver Scholz et al. 2000 4 para a cinética de desenvolvimento do etanol de tolerância e decadência. A segunda variável a considerar é a duração da primeira exposição. Isto, obviamente, tem que ser o mesmo para o controle e as moscas experimental. No entanto, isto não pode resultar na mesma quantidade de etanol entregue a estas duas estirpes voar. Moscas sedado absorvem mais etanol do que as moscas ativo 2, portanto, uma tensão que sedates anteriores podem receber uma dose mais elevada do que uma cepa mais tarde sedativo, e assim desenvolver mais tolerância devido a uma dose inicial mais elevado. É altamente advertir o leitor ao comparar o desenvolvimento de tolerância de estirpes que mostram diferenças na ST50 inicial (1). O ensaio aqui descrito é uma ferramenta útil em determinar facilmente reproduzível e moscas respostas comportamentais ao álcool.

<table><tbody><tr><td>Frascos de exposição</td><td>www.flystuff.com</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Tampões</td><td>www.flystuff.com</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Azul 9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861146</td><td></td></tr></tbody></table>

uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no flies

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Baixas doses de etanol causa voa para tornar-se hiperativas, enquanto altas doses sedativas. A sensibilidade ao etanol induzida sedação de uma cepa voar dado é correlacionado com a preferência que a tensão s etanol, e, portanto, a sedação é uma medida altamente relevantes para o estudo da genética das respostas de álcool e beber. Nós demonstramos uma forma simples para expor voa para o etanol e medir seus efeitos inebriantes. O ensaio descrevemos pode determinar a sensibilidade aguda, assim como tolerância ao etanol induzida pela exposição repetida. Ele não requer uma instalação tecnicamente envolvidos, e pode, portanto, ser aplicada em qualquer laboratório com as ferramentas básicas da cultura voar.

Um ensaio simples para medir os efeitos sedativos do etanol na<em&gt; Drosophila</em&gt; Moscas, com base na perda do reflexo de endireitamento, é descrito.

Uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no Flies

Doses baixas de etanol fazem com que as moscas se tornem hiperativas, enquanto doses altas são sedativas. A sensibilidade à sedação induzida por etanol de uma determinada linhagem de moscas ...

Olá, sou Thomas Maples do laboratório do Dr. Adrian Rothenfluh, do Departamento de Psiquiatria do Centro Médico UT Southwestern em Dallas. Hoje demonstrarei um procedimento simples para determinar a sensibilidade de moscas à sedação por etanol. Este ensaio baseia-se na perda do reflexo de endireitamento e da capacidade de locomoção das moscas após exposição ao etanol.Essa medida pode ser usada para determinar as diferenças de sensibilidade ao álcool entre diferentes linhagens de drosófila e mutantes. Também podemos usar este ensaio para induzir tolerância em moscas, sendo a tolerância uma resposta reduzida ao álcool após exposições repetidas. Vamos começar.Para este experimento, você precisará dos seguintes frascos. Com oito moscas-das-frutas, um espécime que você coletou um ou dois dias antes. Você pode realizar as exposições com machos ou fêmeas.No entanto, cada frasco deve conter apenas um sexo. Um frasco de alimento vazio que não contenha moscas, uma lâmina de barbear, duas tampas de frasco feitas de material semelhante ao algodão. Se você não tiver esse tipo de tampa, também pode usar bolas de algodão, uma micropipeta de 1000 microlitros com ponteiras, etanol a 200 provas que contenha corante alimentar, que pode ser adquirido em qualquer mercearia, e um cronômetro.A primeira coisa que precisamos fazer é criar uma câmara de exposição na qual exporemos as moscas ao etanol e monitoraremos sua mobilidade. Para criar essa câmara, primeiro corte ao meio uma tampa de frasco usando uma lâmina de barbear. Em seguida, empurre uma das metades até o fundo de um frasco, cobrindo o alimento.Isso cria uma superfície nivelada e não aderente para as moscas andarem. Se você usar uma bola de algodão, pressione-a suavemente e tente deixá-la o menos felpuda possível para que as moscas não fiquem presas nos fios de algodão. Se estiver preparando múltiplas câmaras, certifique-se de que a comida e a tampa do frasco ocupem a mesma quantidade de espaço em cada câmara.Isso garante que as moscas em cada câmara sejam expostas ao etanol no mesmo volume. Com prática, é fácil expor três frascos de moscas em paralelo. Uma vez que as câmaras de exposição estejam prontas, podemos agora expor as moscas ao etanol.Primeiro, transfira um frasco com oito moscas para uma câmara de exposição, fechando a câmara com a tampa do frasco que originalmente continha as moscas. Em seguida, pipete 500 microlitros de etanol corado na concentração escolhida em uma das extremidades de uma tampa de frasco semelhante a algodão. Depois, substitua a tampa da câmara de exposição pela tampa revestida com etanol, inserindo a extremidade revestida com etanol dentro da câmara.Imediatamente após a adição do tampão revestido com etanol à câmara de exposição, inicie um cronômetro. O corante no etanol ajuda a garantir que o etanol esteja voltado para dentro da câmara de exposição e não para a parede do frasco. Isso é especialmente importante se você usar bolas de algodão em vez de tampões específicos, pois qualquer lado de uma bola de algodão pode ficar voltado para dentro do frasco.Nesta exposição, estamos utilizando álcool a 100%, que agora está se difundindo na câmara de exposição, onde as moscas o inalam pelo ar. A cada minuto após a adição da tampa revestida com etanol à câmara de exposição, contaremos quantas moscas se tornaram imóveis, ou seja, incapazes de se virar e andar. Quanto mais tempo as moscas permanecerem móveis, maior será a resistência delas em cada intervalo de um minuto.Assuste as moscas batendo levemente o compartimento na bancada para garantir que todas as moscas que conseguem se mover estejam em movimento. Observe as moscas por 10 segundos após a batida, para dar tempo de começarem a se mover ou se virarem, a cada intervalo de um minuto. Registre quantas das oito moscas estão imóveis no início do experimento.A maioria das moscas correrá rapidamente para cima do frasco após ser assustada. Após cerca de seis minutos de exposição ao etanol a 100%, começam a se mover lentamente e, às vezes, de forma errática por volta dos 12 minutos. A maioria das moscas ficará imóvel, incapaz de andar ou se virar quando estiver de costas.Somente as moscas que conseguem se virar e andar devem ser contadas como moscas móveis; aquelas que apenas movem as pernas ou asas no mesmo lugar devem ser contadas como moscas estacionárias. As moscas que permanecem de costas durante todo o período de observação também devem ser contadas como estacionárias, pois a incapacidade de se virar é um sinal de intoxicação. Moscas que vibram vigorosamente as asas durante todo o período de observação de dez segundos devem igualmente ser consideradas estacionárias, mesmo que mudem de posição. A grande maioria dessas moscas permanece estacionária entre períodos de movimento rápido das asas.Em resumo, moscas capazes de se virar e andar são moscas móveis; aquelas incapazes de se virar, mover as pernas e asas no lugar ou vibrar rapidamente as asas são estacionárias. Se aplicarmos essas regras, observamos que um número maior de moscas do tipo selvagem torna-se estacionário à medida que aumenta o tempo de exposição aos vapores de etanol. O valor que este ensaio utiliza para quantificar a sensibilidade ao etanol é o tempo mediano de sedação, ou TMS.Definimos MST como os minutos de exposição ao etanol necessários para que quatro das oito moscas na câmara de exposição fiquem imóveis. Esse valor é facilmente determinado se exatamente quatro moscas estiverem imóveis em um período específico de observação. Por exemplo, se exatamente quatro moscas estiverem imóveis após 11 minutos de exposição, então 11 é o MST.Se exatamente quatro moscas estiverem imóveis após 11 minutos de exposição e, aos 12 minutos, a mesma condição for observada, considere o primeiro valor como o momento em que as moscas atingem pela primeira vez seu TS. Se quatro moscas não estiverem imóveis em um determinado período de observação, é necessário interpolar linearmente o tempo em que quatro moscas se tornaram imóveis. Por exemplo, se o número de moscas imóveis saltar de três para cinco entre nove e dez minutos de exposição, pode-se determinar graficamente que o TSM é 9,5. Os seguintes dados coletados utilizando este ensaio mostram que este delineamento experimental é uma maneira precisa de medir a sensibilidade ao etanol.Um N de seis a oito frascos foi utilizado nos experimentos a seguir, o que está indicado dentro das barras. O TMS de moscas machos do tipo selvagem expostas ao etanol a 100% é de aproximadamente 11 minutos, com um erro padrão baixo. A variabilidade dia a dia é baixa e, na maioria das vezes, não é estatisticamente significativa, mas ainda assim recomendamos que você meça seus grupos experimentais e controles em paralelo, no mesmo dia.Observe também que as moscas expostas no dia A e no dia B não são os mesmos indivíduos. Trata-se de irmãos que representam o mesmo estoque genético. Moscas machos e fêmeas expostas ao Etanol 100% não mostram diferença no MST. Ainda assim, recomendamos manter-se com um único sexo.Se expusermos moscas machos e fêmeas a doses crescentes de etanol, obtemos uma boa curva de resposta à dose que mostra uma diminuição estatisticamente significativa no MST em função do aumento da concentração de etanol. Este ensaio também reproduz fenótipos previamente publicados que foram medidos com um aparato mais elaborado de vaporização de etanol: moscas com a mutação *right rabbit one* apresentaram um aumento significativo no MST. Esse aumento foi observado tanto com etanol a 100% quanto com etanol a 90%.Utilizando este ensaio, também podemos induzir e medir a tolerância ao etanol em moscas. A tolerância é definida como uma redução na resposta ao álcool após uma exposição prévia ao álcool para induzir a tolerância. Exponha um frasco de moscas ao etanol por aproximadamente duas vezes o seu TMS.Por exemplo, expomos esses machos da linhagem selvagem Berlin a etanol 100% por 24 minutos. Após a exposição, bata suavemente no tubo para devolver as oito moscas ao frasco com alimento, onde serão deixadas em recuperação por quatro horas. Registre o TMS original das moscas no frasco após quatro horas de recuperação, exponha novamente exatamente as mesmas moscas à mesma dose de etanol e registre o segundo TMS.Como é possível observar neste gráfico, o TMS da segunda exposição ao etanol é significativamente maior do que o TMS da primeira exposição, indicando que as moscas desenvolveram tolerância aos efeitos sedativos do etanol. Uma medida de tolerância é calculada dividindo o segundo TMS de um dado frasco de moscas pelo primeiro TMS das mesmas moscas e subtraindo um; o valor é expresso como porcentagem de tolerância, que, no nosso caso, é de aproximadamente 50%. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

a-simple-way-to-measure-ethanol-sensitivity-in-flies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Drosophila surgiu como um sistema modelo importante para dissecar as bases celulares e moleculares de respostas comportamentais ao álcool. Aqui é apresentado um protocolo para a recolha de dados de sensibilidade do álcool em um contexto circadiano que pode ser facilmente aplicado a outros ensaios e é bem adequada para a pesquisa de graduação.

O Flybar: Administração álcool para Moscas

Ensaios simples para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em Drosophila facilitam o uso deste organismo modelo para investigar esses importantes comportamentos relacionados ao etanol. Aqui, um ensaio relativamente simples e escalável para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em moscas é descrito.

Um Ensaio Behavioral Barato, escalável para medição Ethanol Sedação sensibilidade e tolerância rápida em<em&gt; Drosophila</em

C. elegans é um modelo útil para estudar os efeitos do etanol no comportamento. Apresentamos um ensaio comportamental que quantifica os efeitos do etanol na velocidade de locomoção de vermes rastejantes; tanto a sensibilidade inicial quanto o desenvolvimento de tolerância funcional aguda ao etanol podem ser medidos com este ensaio.

Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

O ensaio CApillary FEeder (CAFE) é um método simples, econômico e altamente confiável para investigar os mecanismos subjacentes à ingestão de alimentos. Usado com o organismo modelo genético altamente versátil Drosophila melanogaster, ele fornece um meio poderoso de obter novos insights sobre os mecanismos regulatórios da ingestão de alimentos.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Os métodos atuais para medir a sensibilidade ao álcool em Drosophila são projetados para testar grupos de moscas. Apresentamos um ensaio simples, de baixo custo e de alto custo para avaliar a sensibilidade à sedação de álcool em um grande número de moscas simples. O método não requer ferramentas especializadas e pode ser realizado em qualquer laboratório utilizando materiais comuns.

Método de alta duração para medir o tempo de sedação de álcool de melanogaster individual drosophila

O ensaio Flypub mede os comportamentos que a mosca da fruta Drosophila melanogaster exibe sob a influência do etanol. O ensaio pode ser facilmente dominado por experimentadores em todos os níveis e aplicado a vários estímulos vaporizados, facilitando o abuso de substâncias e estudos de dependência.

Flypub estuda desinibição comportamental induzida pelo etanol e sensibilização

O Vermicelli e Testes Handling Capellini de destreza forepaw aproveitar a inclinação natural dos roedores para manipular alimentos usando forepaw hábil e movimentos dígito. Os animais são filmados durante o manuseio cadeias curtas de massas secas cozidas. Reprodução de vídeo em câmera lenta permite a quantificação dos ajustamentos de pata.

O Vermicelli e Testes Handling Capellini: Simple medidas quantitativas da função forepaw dexterous em ratos e camundongos

Camundongos e ratos, devido à sua prudência inata, são inicialmente lento em consumir um alimento novo, particularmente em um lugar novo. Este hyponeophagia podem ser facilmente medidos em laboratório, apesar de animais de laboratório são muito menos ansiosos do que suas contrapartes...

Hyponeophagia: Uma Medida de ansiedade no rato

Um método para determinar o curso de tempo da concentração de etanol no cérebro de ratos durante etanol operante a auto-administração é descrita. Cromatografia em fase gasosa com detecção por ionização de chama é utilizado para quantificar o etanol nas amostras de dialisato, porque não tem a sensibilidade necessária para os pequenos volumes que são gerados.

Microdiálise de etanol durante a operante determinação auto-administração de etanol e etanol por cromatografia gasosa

Aprenda a medir a sensibilidade ao etanol em Drosophila melanogaster usando um ensaio simples baseado na perda do reflexo de endireitamento. Este método permite quantificar diferenças na sensibilidade alcoólica entre diferentes linhagens e mutantes de moscas.

Uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no Flies

Explorar mais vídeos