Métodos para a transferência rápida e localização de Patógenos Doença de Lyme no intestino Tick
14 de fevereiro de 2011
Estudos de pesquisa a doença de Lyme muitas vezes exigem a geração de carrapatos infectados com o patógeno Borrelia burgdorferi, um processo que normalmente leva várias semanas. Aqui nós demonstramos uma microinjeção baseado procedimento de infecção do carrapato que pode ser realizado em poucas horas. Nós também demonstramos um método de imunofluorescência para na localização in situ de B. burgdorferi dentro de carrapatos.
O objetivo geral deste procedimento é microinjetar e localizar células de borrelia berg de ferry no intestino do carrapato. Isso é feito preparando primeiro as agulhas capilares de vidro e enchendo-as com células de beberg de ferry. Em seguida, as células de adiamento de Beberg são transferidas para o intestino do carrapato por meio de microinjeção.
O carrapato é então dissecado e os tecidos intestinais são removidos. Finalmente, a marcação por imunofluorescência de beberg defer no intestino do carrapato é realizada. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a localização de beberg para transportar no intestino do carrapato usando microscopia confocal.
Olá, sou a Dra. Ruth Paul Paul, professora assistente da Universidade de Maryland no Departamento de Medicina Veterinária. Hoje, dois dos meus membros do laboratório, Toro Cairo, um pós-doutorando e Adam Coleman, um estudante de pós-graduação, mostrarão o procedimento para infecção artificial de carrapatos por microinjeção que fazemos rotineiramente no laboratório. Após a microinjeção, dissecaremos o carrapato e faremos a imagem das bactérias no intestino do carrapato usando o microscópio confocal CE.
A principal vantagem da microinjeção de carrapatos de uma geração de carrapatos naturais infectados é a duração do procedimento. A microinjeção encurta todo o procedimento de semanas horas, pois são necessárias aproximadamente cinco semanas para gerar carrapatos infectados pelo processo de alimentação natural. Essa técnica também pode ser adaptada para injetar outros reagentes úteis, como RNA de fita dupla para RNAi ou anti-soros para interferência específica de anticorpos dentro do carrapato.
Para começar, fabrique várias agulhas de microinjeção aquecendo e puxando tubos capilares de vidro de um milímetro em um dispositivo de tração de micropipeta de vidro. Remova cuidadosamente os tubos capilares frágeis. Guarde as agulhas agrupadas com a ponta voltada para cima em fita adesiva em uma placa de Petri.
Em seguida, cresça b berg de ferry na cultura BSK. Média a uma concentração de cerca de 10 a sete células por mililitro de pellet b berg de ferry por centrifugação a 3000 vezes G por 10 minutos. À temperatura ambiente, remova o snat e ressuspenda completamente o pellet em meio BSK, passando suavemente por uma microponta estéril de 200 microlitros até uma concentração final de 10 a nove células por mililitro.
Uma vez que as células são ressuspensas em alta densidade celular e podem se aglomerar, a suspensão celular deve ser usada imediatamente para microinjeção para preparar carrapatos, coloque fita adesiva dupla face transparente em uma lâmina de vidro trabalhando em um tapete pegajoso, remova cuidadosamente os carrapatos do recipiente Usando uma pequena escova, coloque o número necessário de carrapatos a serem injetados na fita adesiva com o lado ventral voltado para cima na mesma direção. Carregue cinco microlitros da cultura beberg de ferry na agulha capilar agrupada. Usando uma microcarga de 20 microlitros da ponta da pipeta, inspecione a agulha quanto a bolhas de ar presas e recarregue a agulha com cultura bacteriana.
Se necessário, visualize o carrapato sob o microscópio binocular de dissecação e concentre-se na área da abertura anal do carrapato. Toque suavemente a ponta da agulha capilar para quebrar o tubo onde o diâmetro é ligeiramente menor que o da abertura anal do carrapato que forma a agulha de microinjeção. Esta etapa é crítica, pois qualquer tentativa de injetar carrapatos com pontas de agulha não apropriadas causa ferimentos e possível morte.
Para o carrapato injetado. Coloque os carrapatos imobilizados sob o microscópio binocular de dissecação e concentre-se na abertura anal, que é coberta por duas placas anais móveis. Usando uma pinça fina, toque suavemente e aplique uma pressão muito leve em qualquer área próxima à abertura anal.
Isso permitirá a separação das placas anais e a abertura do poro anal que se conecta ao intestino. Insira cuidadosamente a ponta da agulha levemente na abertura anal através da abertura forçada das placas anais. A inserção da agulha deve ser reduzida ao mínimo, pois a ponta de vidro pode danificar o intestino posterior semitransparente que se conecta ao reto.
Usando um microinjetor equipado com um controle de pé automatizado, injete a solução beberg de ferry usando os seguintes parâmetros. 1000 Hector Pascals pressão de injeção 0,2 segundos de tempo de injeção e oito pressão de compensação de Hector Pascal. Cada carrapato recebe uma única injeção após a microinjeção.
O carrapato deve mostrar sinais de movimento ou rastejar em resposta a estímulos semelhantes aos anteriores à injeção. Para dissecar carrapatos para microscopia de imunofluorescência, primeiro coloque uma gota de solução salina tamponada com fosfato em uma lâmina de vidro limpa para dissecção e outra em uma lâmina revestida de poli L lisina Para microscopia, prepare outra lâmina de vidro com fita adesiva dupla face. Em seguida, remova o carrapato do recipiente e coloque-o em fita adesiva dupla face.
Usando um pequeno pincel sob a visão do microscópio de dissecção e concentre-se no carrapato, coloque uma lâmina de barbear afiada no carrapato entre o primeiro e o segundo pares de pernas. Pressione para baixo cortando firmemente o carrapato em dois pedaços, expondo o abdômen imediatamente submerso o abdômen em uma gota de PBS usando uma pinça fina. Pegue o exoesqueleto dorsal e ventral ao redor do local do corte.
Puxe cuidadosamente o escudo dorsal para cima e para longe do carrapato, expondo o diverticular intestinal de cor acastanhada. Tenha cuidado para manter os carrapatos dissecando sob o PBS o tempo todo. Os feixes semitranslúcidos da glândula sali estão localizados em ambos os lados da região anterior do intestino e podem ser removidos neste ponto, se desejado.
Segurando o exoesqueleto restante no lugar com uma pinça, puxe cuidadosamente o intestino para fora do abdômen. Limpe cuidadosamente o intestino, removendo quaisquer tecidos presos, como a traquéia. Usando a ponta de uma pinça fina, transfira rapidamente o intestino do carrapato para uma gota de PBS em uma lâmina de vidro de poli L lisina.
Separe o intestino em pedaços menores usando lâminas finas ou pressionando suavemente com a ponta de uma pinça fina. Aspire cuidadosamente o excesso de PBS ao redor dos tecidos intestinais. Deixe os tecidos intestinais secarem ao ar e temperatura ambiente.
Corrija o intestino do carrapato submergindo-o em acetona por 10 minutos. Deixe secar ao ar livre As lâminas de temperatura ambiente podem ser armazenadas nesta etapa por meses a menos 20 graus Celsius em um recipiente hermético. Para a marcação imunofluorescente do intestino, desenhe um círculo ao redor do intestino fixo do carrapato com uma caneta de Papanicolau ou outro dispositivo de revestimento de barreira hidrofóbica.
Isso ajudará a reter as soluções de coloração durante as etapas subsequentes de incubação. Cubra o intestino do carrapato com uma ou algumas gotas de tampão de bloqueio por 30 minutos. À temperatura ambiente.
O soro usado para bloqueio depende da fonte do animal hospedeiro para o anticorpo. Não deixe a lâmina secar deste ponto para a frente. Aspire lentamente o tampão de bloqueio.
Incubar o intestino com soluções de anticorpos primários e/ou secundários apropriados. Usamos fluoresceína, isotiocianato ou FXI marcado como anti B berg. Adie o anticorpo em uma diluição de um a 100 no tampão de bloqueio por uma hora.
À temperatura ambiente, cubra o recipiente com papel alumínio para limitar a exposição à luz. Remova a solução de anticorpos por aspiração suave. Incube o intestino com um corante fluorescente para rotular tecidos de carrapatos, como DPI ou iodeto de propídio.
Normalmente usamos 20 microgramas por mililitro de iodeto de perídio em PBS por cinco minutos em temperatura ambiente, lavamos três vezes com 0,05% entre 20 em PBS por cinco minutos. Por fim, monte a lâmina em glicerol tamponado contendo um reagente Antifa e cubra cuidadosamente com uma tampa de vidro. As lâminas deslizantes podem ser armazenadas nesta etapa por alguns meses a quatro graus Celsius em uma imagem de recipiente hermético e localizadas em um microscópio confocal.
Uma microinjeção de carrapato é mostrada aqui com uma agulha cheia de azul brilhante kumasi para visibilidade. Pinças finas são usadas para aplicar uma leve pressão no corpo, o que permite a separação das placas anais e a abertura do poro anal para microinjeção. Aqui, a região anterior de um divertículo intestinal é mostrada com balsa de Beberg dentro do intestino.
Os núcleos intestinais e as espiroquetas são marcados com iodeto de propídio ou balsa anti-beberg conjugada fitzy, respectivamente. Uma vez dominado, descobrimos que 10 carrapatos podem ser micro injetados com naturalmente cem mil sobreviventes e infectados com fer. Embora os carrapatos possam ser usados imediatamente para outros experimentos, geralmente esperamos um ou dois dias para garantir que os carrapatos sobrevivam ao procedimento antes de prosseguir.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar carrapatos infectados artificiais por micro e insetos de barreira localizados dentro do intestino do carrapato usando fluxos imunológicos confocais. Micro Trabalhar com carrapatos e agulhas de vidro finas cheias de um patógeno humano, como brelia brior fry, pode ser perigoso enquanto você está trabalhando. Esteja ciente da localização de carrapatos e agulhas e pratique as precauções de nível dois de biossegurança em todos os momentos.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método baseado em microinjeção para infectar carrapatos com Borrelia burgdorferi, reduzindo significativamente o tempo necessário para a infecção do carrapato. Além disso, uma técnica de imunofluorescência é demonstrada para localizar o patógeno nos tecidos do carrapato.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Biologia dos vetores
- Localização de patógenos
Fundamentos
- A doença de Lyme é causada pela bactéria Borrelia burgdorferi.
- Os carrapatos são os principais vetores para a transmissão deste patógeno.
- Os métodos tradicionais para infectar carrapatos são demorados.
- Métodos de infecção rápida podem aumentar a eficiência da pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método mais rápido para infectar carrapatos com B. burgdorferi.
- Permitir a localização in situ do patógeno nos tecidos do carrapato.
- Melhorar a compreensão das interações carrapato-patógeno.
Métodos Utilizados
- Preparação de agulhas de capilar de vidro para microinjeção.
- Microinjeção de células de B. burgdorferi no intestino do carrapato.
- Dissecção dos carrapatos para isolar os tecidos do intestino.
- Marcação por imunofluorescência de B. burgdorferi nos tecidos do intestino.
Principais Resultados
- Microinjeção bem-sucedida de B. burgdorferi nos intestinos dos carrapatos.
- Localização eficaz do patógeno demonstrada através de imunofluorescência.
- Resultados visualizados usando microscopia confocal.
- O método reduz significativamente o tempo de infecção do carrapato.
Conclusões
- A técnica de microinjeção é uma alternativa viável para a infecção de carrapatos.
- A imunofluorescência permite a localização precisa de patógenos.
- Esta abordagem pode facilitar mais pesquisas sobre a transmissão da doença de Lyme.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Rapid and controlled infection of tick vectors with Borrelia burgdorferi enables efficient study of pathogen-vector interactions critical for Lyme disease research. This microinjection approach reduces infection timelines from weeks to hours, supporting high-throughput screening and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides reproducible pathogen delivery, enhancing predictive confidence in target validation and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Borrelia burgdorferi-tick gut interactions to validate therapeutic targets involved in pathogen persistence and transmission.
- Operational Value: Delivers standardized pathogen loads across tick cohorts, reducing variability in infection models and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports functional target de-risking by allowing controlled exposure to pathogen strains, including those attenuated in murine models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates infected tick tissues suitable for downstream immunofluorescence and confocal imaging assays to quantify pathogen localization and burden.
- Operational Value: Produces quantifiable, microscopy-ready outputs that enable standardization of pathogen detection readouts across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large numbers of uniformly infected ticks, supporting assay reproducibility and platform reuse in vector-based screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a disease-relevant system for studying Borrelia burgdorferi localization in the tick gut, bridging in vitro findings to vector-based pathophysiology.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of pathogen distribution within tick tissues, informing hypotheses about tissue-specific virulence factors and transmission mechanisms.
- Preclinical Model Refinement: Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering consistent pathogen exposure for evaluating intervention efficacy in tick-borne disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation by enabling rapid generation of infected tick vectors and standardized pathogen localization readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of pathogen-vector interactions by delivering controlled quantities of Borrelia burgdorferi to the tick gut for mechanistic interrogation.
- Screening: Produces standardized, infected tick tissues suitable for quantitative immunofluorescence assays, enhancing reproducibility in pathogen detection workflows.
- Analytics: Generates confocal microscopy-based readouts of pathogen localization and burden, enabling comparative analysis across experimental conditions and interventions.
- Translational Research: Connects in vitro pathogen culture to tick tissue localization, supporting biomarker alignment and pathophysiological relevance in vector-borne disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for infecting ticks with diverse biological agents, including antibodies and RNAi reagents, extending utility beyond Borrelia burgdorferi studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pathogen-vector interactions through localized pathogen detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of tick infection models, reducing time and resource investment compared to natural feeding methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency in early discovery by providing rapid, standardized pathogen exposure models for target de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of Lyme disease research initiatives through reliable, high-fidelity infection models that reduce biological variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques, tick handling, and confocal immunofluorescence microscopy.
- Depends on glass capillary needle preparation, microinjector instrumentation, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of injection parameters and gut dissection protocols across teams to ensure consistent pathogen delivery and localization readouts.
- Adaptation to different tick species or pathogen strains may require optimization of needle size, injection pressure, and bacterial concentration.
- Practical limitations include the technical skill required for successful microinjection and gut dissection, as well as the need for biosafety level two containment when handling human pathogens.
