Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

O objetivo geral do experimento a seguir é obter uma imagem quantitativa de uma infecção em animais vivos que possa permitir a localização do organismo infectante nos tecidos e órgãos do hospedeiro. Camundongos anestesiados são primeiro infectados por via intratraqueal com bactérias bioluminescentes. Os camundongos infectados são então injetados com Luciferian, o que permite a realização de imagens ao vivo no sistema IVIS.

Uma vez obtidas as imagens de corpo inteiro, os pulmões infectados são colhidos. A imagem dos órgãos isolados pode ser realizada para demonstrar a verdadeira localização do patógeno. Após a imagem, os pulmões são homogeneizados e diluídos em meio de crescimento bacteriano para quantificação da carga microbiana.

Por fim, são obtidos resultados que mostram a localização e o número de patógenos presentes no hospedeiro em tempo real. A principal vantagem desta técnica sobre o método existente é que os patógenos podem ser visualizados e monitorados em animais vivos por imagens em tempo real, fornecendo informações sobre os tiques espaciais da infecção microbiana. Demonstrando este procedimento estarão o Dr. Mihi Chang, um pós-doutorando em meu laboratório, e SWAT Cillo, um pesquisador em meu laboratório.

Comece por intraperitoneal, injetando camundongos com válvula C de seis a 12 semanas de idade com uma solução anestésica pré-misturada contendo 100 microgramas de cetamina e 10 microgramas de xilazina por grama de peso do camundongo. Coloque os ratos de volta em suas gaiolas até que o anestésico faça efeito. Para determinar se a anestesia está completa, aperte a almofada do pé de cada mouse e certifique-se de que não ocorra nenhuma reação reflexa do pedal.

Assim que os animais estiverem totalmente anestesiados, pegue um camundongo e coloque-o na intubação. Fique deitado de costas. Use fita adesiva para fixar as pernas e os braços do mouse no suporte.

Fixe um elástico no suporte de intubação. Em seguida, coloque-o sob os incisivos superiores do mouse. Assim que o mouse estiver imobilizado, use uma pinça para puxar suavemente a língua para fora da boca.

Em seguida, insira suavemente o espéculo com o otoscópio dentro da boca do camundongo e encontre a abertura da laringe, localizada na frente do esôfago, no lado ventral da orofaringe. Uma vez identificada a abertura da laringe, insira um cateter de calibre 22 de uma polegada contendo um fio-guia na traqueia até que o cubo do cateter atinja os incisivos. Remova o fio-guia e conecte o cateter à bomba de plástico.

Em seguida, empurre o ar para dentro do cateter. O peito do rato inflará se a intubação estiver correta. Uma vez confirmada a colocação correta do cateter, pipete 50 microlitros de solução bacteriana bioluminescente na concentração desejada no cateter e conecte uma seringa de um mililitro com 50 microlitros de ar para empurrar a solução para os pulmões do camundongo.

Duas ou três vezes, remova o cateter e coloque o camundongo de volta em sua gaiola para permitir que ele se recupere da anestesia. Antes de realizar a imagem de bioluminescência, anestesiar os camundongos usando isoflurano. Assim que os camundongos estiverem totalmente anestesiados, remova-os da câmara de indução e aplique suavemente pomada óptica para proteger os olhos do animal.

Durante a imagem, coloque os camundongos na câmara de imagem e um dos cones do nariz no coletor de anestesia. Use um defletor de luz entre os camundongos para evitar o reflexo da luz entre os animais adjacentes. Finalmente, injete em cada camundongo por via intraperitoneal 150 microgramas por grama de peso corporal de Lúcifer.

Deixe o Lúcifer se dispersar pelo corpo do animal por 10 minutos. Em seguida, comece a criar imagens. Inicie o software de imagem viva e inicialize o sistema de imagem IVIS.

Para definir os parâmetros primeiro, clique em configuração de sequência. Em seguida, selecione o modo de luminescência e imagem fotográfica. Selecione imagens fotográficas luminescentes e de luz estrutural como parte da sequência de imagens para permitir a reconstrução DLIT 3D.

Em seguida, defina o tempo de exposição para um minuto. Em seguida, ajuste o binning para médio e o F-stop para um. Defina o filtro de excitação para bloquear e os filtros de emissão para abrir para reconstrução 3D permitem vários filtros de diferentes comprimentos de onda.

Para permitir a localização precisa da fonte do sinal, selecione o FOV correspondente ao número de mouses que estão sendo visualizados. Depois que todas as configurações forem definidas, clique em adicionar no assistente de imagem no painel de controle de aquisição para adicionar a configuração da sequência e clique em adquirir para iniciar a sequência de imagens durante a aquisição. Registre detalhes e condições experimentais na janela de edição de imagem e salve as imagens.

Finalmente, remova os camundongos da câmara de imagem e devolva-os às suas gaiolas. Monitore os animais constantemente até que eles se recuperem da anestesia. Para imagens de tecidos, eutanasiar humanamente os camundongos.

Neste ponto, colha assepticamente os pulmões de cada camundongo e transfira os órgãos para uma placa de Petri estéril. Coloque a placa de Petri contendo os pulmões infectados dentro da câmara de imagem e adquira imagens de bioluminescência da mesma maneira descrita anteriormente neste vídeo. Uma vez obtidas as imagens, remova a placa de Petri da câmara de imagem e, usando uma pinça estéril, transfira os pulmões para um tubo contendo um mililitro de PBS estéril usando um homogeneizador homogeneizar os pulmões por dois a cinco minutos.

Preparar a diluição em série dos homogeneizados pulmonares em PBS estéril. Em seguida, coloque 100 microlitros de cada diluição em placas de Petri contendo meio seletivo. Incube as culturas a 37 graus Celsius até que as colônias bacterianas sejam claramente visíveis.

Em seguida, conte a UFC para avaliar o nível de infecção. Inicie o software de imagem viva e abra os arquivos de imagem desejados no navegador de arquivos. Na paleta de ferramentas.

Clique em ajustar imagem para modificar as configurações de correção e filtragem, bem como os limites da escala de cores. Para quantificar a intensidade da luminescência, use as ferramentas de região de interesse ou ROI na lista suspensa, selecione o número e o tamanho da forma de ROI. Em seguida, clique em medição de ROI e salve a saída de dados quantitativos para reconstruir imagens 3D.

Primeiro, carregue a sequência de imagens, incluindo as imagens de luz estruturada. Clique em topografia de superfície na paleta de ferramentas. Em seguida, na lista suspensa, selecione a guia reconstruir para gerar uma topografia de superfície.

Em seguida, selecione Reconstrução 3D DILT na paleta de ferramentas. Clique na guia de propriedades na lista suspensa e defina as propriedades do tecido e o espectro de origem para o músculo. Clique na guia analisar e selecione o comprimento de onda para análise.

Em seguida, clique em iniciar. Depois que todas as configurações forem ajustadas, clique em reconstruir para iniciar a análise 3D. Quando a reconstrução 3D estiver concluída, selecione a visualização 3D para exibir os resultados clicando na guia de resultados, densidade de fótons, voxels de dados e parâmetros de algoritmo podem ser visualizados, salve os resultados e exporte os dados e imagens para análise posterior.

Como mostrado nesta figura, os dois camundongos à direita que foram infectados intratraquealmente com 10 elevado à sexta UFC de bactérias bioluminescentes produzem um forte sinal da área pulmonar, enquanto o camundongo não infectado à esquerda não. Uma análise semelhante Usando pulmões dissecados apenas de camundongos infectados confirma que a luminescência emana dos pulmões e não de algum outro tecido justaposto. O sinal que emana da amostra pode ser facilmente quantificado como fluxo total dentro de uma região de interesse.

Uma análise de tomografia confirma que a posição da luminescência exibida nessas imagens como caixas vermelhas está dentro da área que contém os pulmões do camundongo, conforme determinado pela reconstrução 3D. Finalmente, a semelhança entre a curva de densidade de fótons medida à esquerda e a curva de densidade de fótons simulada à direita atestam a boa qualidade da reconstrução. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens de animais infectados com precedentes e analisar as imagens para localização e quantificação de reminiscências.