Microscopia intravital do linfonodo inguinal
4 de abril de 2011
Uma técnica para a realização de microscopia intravital do linfonodo inguinal (LN) é descrito. Tal técnica permite em tempo real, In vivo Estudo da microvasculatura linfonodo e estrutura, tanto durante a homeostase e infecção. Esta técnica pode ser adaptada para estudos de células e tráfico para sites outro nó de linfa.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar e avaliar in vivo a artéria que irriga o linfonodo inguinal. Isso é realizado primeiramente criando um retalho de pele mediante a dissecção cuidadosa da pele na região inguinal do camundongo, que cobre o linfonodo inguinal. Em seguida, o tecido conjuntivo que recobre a área do linfonodo é destacado.
Em seguida, o tecido adiposo circundante deve ser removido para expor a vasculatura arterial de suprimento do linfonodo. Por fim, as alterações na vasculatura do linfonodo são visualizadas e avaliadas por microscopia intravital P. Embora a preparação que você verá hoje seja a microcirculação do linfonodo inguinal, as técnicas cirúrgicas podem ser utilizadas para outras preparações, como músculo esquelético, bem como cérebro.
De modo geral, ao realizar esta técnica, indivíduos iniciantes enfrentam dificuldades por duas razões principais. Primeiro, porque se está lidando com um animal vivo, e segundo, porque, ao realizar cirurgia em uma área muito pequena, qualquer tipo de perturbação no vaso propriamente dito ou na área circundante pode ter um impacto negativo, o que seria prejudicial para o experimento que se deseja conduzir. A demonstração visual desta técnica é fundamental para o sucesso.
Existem várias etapas complexas envolvidas, que não se traduzem muito bem do texto para a execução prática da técnica. É importante vê-la para realizá-la corretamente. Com muito sucesso.
O camundongo é primeiramente anestesiado e a área cirúrgica é depilada. Consulte o manuscrito textual para obter detalhes. Em seguida, o camundongo pode ser posicionado sobre uma placa cirúrgica transparente em posição supina.
Prenda o camundongo à placa fixando cada pata com fita adesiva. No dia anterior ao experimento, misture o thes guard 180 4 de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, utilizando uma placa de Petri descartável padrão como molde, despeje a mistura até uma profundidade de aproximadamente um quarto de polegada e deixe curar durante a noite. Retire o thes guard da placa de Petri e coloque-o sobre a placa cirúrgica.
Posicione o camundongo anestesiado e depilado sob o microscópio estereoscópico. Faça uma incisão mediana ao longo da superfície ventral da cavidade abdominal utilizando pinças de aço inoxidável número cinco e lâminas retas, tesoura de mola. Em seguida, continue a incisão mediana diagonalmente em direção aos membros e retrai a pele em direção à coluna vertebral.
Uma vez que o ln esteja facilmente visível, fixe a pele retratada usando pinos de insetos de aço inoxidável e pinças revestidas com epóxi inox sobre o pedestal 180 4. Adicione solução salina fisiológica ou SSF à área.
Em seguida, remova a fina camada de tecido conjuntivo que recobre a região ao redor do ln. Com pinça, levante cuidadosamente pequenos fragmentos de tecido conjuntivo e disséque-os do ln. Usando tesoura de mola, remova então o tecido adiposo que recobre e envolve o LN até que o leito microvascular seja exposto.
Nesta etapa, é importante ter cuidado para nunca fazer contato com a vasculatura de interesse usando instrumentos cirúrgicos ou lesionar os vasos ao aplicar força excessiva sobre eles durante a manipulação dos tecidos ao redor. A gordura é melhor removida do gânglio linfático (ln) ao afrouxar o tecido conjuntivo, segurando o tecido adiposo com pinça e, em seguida, removendo suavemente o tecido adiposo até que o campo de visão esteja limpo. Uma vez que os tecidos conjuntivo e adiposo tenham sido removidos, o segmento arterial principal adjacente ao LN e a veia acompanhante sobrejacente podem ser visualizados.
Uma vez que o segmento vascular de interesse tenha sido exposto sob o microscópio estereoscópico, fixe a preparação no microscópio intravital. Configure as linhas de superfusão e sucção. Durante esta parte do procedimento, é essencial que o tecido exposto seja sempre mantido sob superfusão com a solução PSS equilibrada.
A superfusão de PSS ocorre por gravidade. Alimente a partir de um reservatório inicial até um reservatório aquecido por camisa d'água, que é perfundido com 5% de dióxido de carbono em equilíbrio com nitrogênio, e depois conduza por uma linha de gotejamento a uma taxa de 10 mililitros por minuto. Deve-se utilizar uma linha de sucção para continuar removendo o PSS superfundido da preparação, colocando-a na parte inferior da aba de pele; em seguida, deve-se verificar e ajustar a temperatura do banho de água circulante e a taxa de superfusão de PSS para atingir uma temperatura ótima de aproximadamente 36 graus Celsius.
Durante o preparo, permita que a vasculatura entre em equilíbrio com PSS por pelo menos 60 minutos. Assegure-se de que o animal não desenvolva hipotermia utilizando um termômetro retal e forneça uma lâmpada de aquecimento externa. Enquanto o PSS está em equilíbrio, quantifique o diâmetro do vaso.
Utilize os paquímetros de vídeo em múltiplos pontos temporais para garantir que o vaso tenha estabilizado; a estabilização é definida como o tamanho do diâmetro permanecendo constante dentro de cinco micrômetros por um período de 20 minutos. As medições de diâmetro são registradas em um computador utilizando o software Chart Lab. Após o período de equilíbrio, avalie a saúde do vaso usando um agonista específico para músculo liso, como a fenilefrina, conforme mostrado aqui com fenilefrina.
Adicione o agonista ao suse. Oito agonistas devem ser avaliados em cada log, com aumento na concentração cumulativa do agonista à medida que é adicionado ao destino SUP entre as administrações de cada agonista. Uma fase de lavagem utilizando PSS deve ser realizada por 30 minutos ou até que o vaso retorne ao diâmetro de repouso.
Aqui estão resultados representativos de um linfonodo inguinal após o período de equilíbrio. A perfusão da artéria com solução salina fisiológica produz uma imagem nítida que permite a identificação da artéria de suprimento, indicada aqui pela seta vermelha, e da veia, indicada pela seta verde, que suprem o linfonodo inguinal. O gráfico mostra uma resposta vasoativa típica de uma artéria linfonodal inguinal à adição cumulativa de fenilefrina SUP fundida à solução salina fisiológica.
De uma concentração de 10 à potência de menos nove molar até 10 à potência de menos cinco molar, a presença de uma vasoconstrição acentuada sugere função normal do músculo liso presente na artéria. Neste gráfico, mostra-se uma resposta vasoativa típica à adição cumulativa de acetilcolina ao salino fisiológico. É apresentada uma concentração de 10 à potência de menos nove molar até 10 à potência de menos cinco molar.
A presença de uma vasodilatação acentuada sugere função endotelial normal presente na artéria. Ao tentar este preparo, uma das principais considerações é minimizar a perturbação do vaso e da área circundante para maximizar o sucesso. Após este procedimento, outros métodos podem ser introduzidos, como a fluorescência, para explorar outras funções celulares, tais como o tráfego celular.
Após o desenvolvimento desta técnica, abriu-se caminho para integrar os campos da imunologia e da biologia vascular em um novo campo: a imunologia vascular.
Visão Geral
Este artigo descreve uma técnica para realizar microscopia intravital do linfonodo inguinal, permitindo o estudo em tempo real e in vivo da microvasculatura e estrutura do linfonodo durante a homeostase e infecção. O método pode ser adaptado para estudos de tráfego celular e outros sítios de linfonodos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imagem Microvascular
- Microscopia Intravital
Contexto
- A microscopia intravital permite a visualização de tecidos vivos.
- O linfonodo inguinal é crucial para estudos da resposta imune.
- O entendimento da vasculatura linfonodal é importante para diversas pesquisas biológicas.
- As técnicas podem ser aplicadas a outros tecidos, como músculo esquelético e cérebro.
Objetivo do Estudo
- Visualizar e avaliar a artéria aferente do linfonodo inguinal in vivo.
- Avaliar alterações na vasculatura do linfonodo durante diferentes estados fisiológicos.
- Fornecer um guia procedural detalhado para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Criação de um retalho cutâneo para expor o linfonodo inguinal.
- Dissecação dos tecidos conjuntivo e adiposo ao redor do linfonodo.
- Uso de microscopia intravital para visualizar o leito microvascular.
- Administração de solução salina fisiológica para condições ideais de imagem.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida da vasculatura do linfonodo inguinal.
- Demonstração da função normal do músculo liso na resposta arterial.
- Avaliação quantitativa da estabilidade do diâmetro dos vasos.
- Identificação clara das estruturas arteriais e venosas que suprimem o linfonodo.
Conclusões
- A técnica fornece insights críticos sobre a microcirculação dos linfonodos.
- Demonstrações visuais aprimoram a compreensão dos passos cirúrgicos intrincados.
- Este método pode ser adaptado para diversos desenhos experimentais em biologia vascular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia intravital do linfonodo inguinal permite a visualização em tempo real da dinâmica microvascular, essencial para compreender o tráfego de células imunes e as interações entre vasos sanguíneos e o sistema imunológico. Esta técnica auxilia na redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta, fornecendo leituras funcionais e quantitativas da saúde vascular e da resposta funcional em condições fisiológicas. Ela integra imunologia e biologia vascular, oferecendo valor preditivo para a validação de alvos em pipelines de inflamação, infecção e imuno-oncologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização de respostas microvasculares em tempo real a agentes vasoativos, apoiando a validação funcional de alvos.
- Valor Operacional: Fornece medidas quantitativas do diâmetro vascular que servem como biomarcadores reprodutíveis da função vascular em modelos de doença.
- Confiabilidade Preditiva: Avalia a função do músculo liso e do endotélio, ajudando a reduzir os riscos associados a alvos envolvidos na regulação vascular e no recrutamento de células imunes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes, estabelecendo a função e estabilidade vascular basal antes da realização de testes com compostos.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio de protocolos controlados de superfusão e critérios de estabilização (diâmetro dentro de 5 µm por 20 min), garantindo avaliação confiável de compostos.
- Escalabilidade: Permite a realização de imagens longitudinais ao longo de várias horas, facilitando a avaliação de respostas dependentes do tempo em campanhas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, permitindo o monitoramento longitudinal das respostas vasculares em modelos relevantes para a doença.
- Valor Operacional: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao quantificar a funcionalidade vascular, um determinante chave da eficácia da resposta imune nos linfonodos.
- Alinhamento de Biomarcadores Translacionáveis: O diâmetro e a reatividade dos vasos atuam como biomarcadores translacionáveis, correlacionando-se com o tráfego de células imunes e a função do linfonodo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de compostos iniciais, fornecendo leituras funcionais vasculares que orientam a seleção de alvos e a compreensão mecanicista.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a observação direta das interfaces microvasculares-imunes durante a homeostase e perturbações.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de uma vasculatura estabilizada e saídas quantitativas (diâmetro, reatividade) que permitem comparação entre condições experimentais.
- Análises: Gera resultados mensuráveis, incluindo alterações no diâmetro dos vasos e respostas de vasoconstrição/vasodilatação, permitindo comparação estatística dos efeitos de tratamentos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar as contribuições vasculares na resposta imune, relevante para o desenvolvimento de adjuvantes e imunomoduladores.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de imagem intravital reutilizável, aplicável em múltiplos sítios de linfonodos e modelos de doenças, maximizando o investimento em infraestrutura.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na comunicação vascular-imunológica.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de superfusão controlada, regulação de temperatura e critérios de estabilização.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados vasculares funcionais que reduzem riscos biológicos em estágios avançados em programas imunomoduladores.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em dados de funcionalidade vascular, apoiando o avanço eficiente em termos de capital.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microcirurgia e imagem intravital para minimizar a perturbação dos vasos durante o preparo do tecido.
- Depende de um equipamento de microscopia intravital com sistema de superfusão e linhas de sucção para condições estáveis de imagem.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de quantificação vascular (por exemplo, medição do diâmetro por paquímetros de vídeo) para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar a técnica em outros sítios de linfonodos ou tecidos, como músculo esquelético ou cérebro.
- Limitado pelo desafio técnico de manter a viabilidade da vasculatura durante períodos prolongados de imagem, exigindo cuidadosa gestão térmica e de perfusão.
