Name: Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a técnica de transplante de ectodérmica para criar embriões quiméricos em galinhas. Este método permite estudar propriedades de sinalização e padrão durante o desenvolvimento craniofacial.

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Este trabalho foi financiado pelo R01-R01-DE018234 e DE019638.

1. Preparar o tecido do doador <ol><li> Prepare meios de cultura, sharpen pinos de vidro, afiar agulhas de tungstênio. </li><li> Coletar embriões a partir de casca, lavar em PBS gelado. <ol class="lalpha"><li> Usando uma seringa de 10 ml e uma agulha de calibre 18 remover 1,0 mL de albumina da extremidade pontiaguda da casca do ovo. </li><li> Faça um pequeno furo na parte superior do escudo usando o ponto de tesouras, e depois cortar uma abertura circular para expor o embrião </li></ol></li><li> Retire a cabeça e coloque em DMEM (soro livre, temperatura ambiente) </li><li> Dissecar processo frontonasal do embrião (ou o site de outros doadores, como processo maxilar ou mandibular) </li><li> Digest em 2.4U / mL em PBS dispase em gelo por 20 minutos </li><li> Cobrir tecidos com DMEM com BSA 1% para parar a digestão </li><li> Use agulha de tungstênio afiadas para ectoderma separado, mesênquima, e neuroectoderma </li><li> Loja de tecidos do enxerto em DMEM BSA 1% em gelo até anfitrião está pronto para transplante </li></ol> 2. Preparando o Host <ol><li> Expor o embrião <ol class="lalpha"><li> Usando uma seringa de 10 ml e uma agulha de calibre 18 remover 1,0 mL de albumina da extremidade pontiaguda da casca do ovo. </li><li> Faça um pequeno furo na parte superior do escudo usando o ponto de tesouras. Coloque um pedaço de fita adesiva sobre o furo, e depois cortar uma abertura circular para expor o embrião. </li></ol></li><li> Usando dois pares de fórceps, segure o âmnio e gentilmente lacrimogêneo para fazer um buraco. </li><li> Gire a cabeça, colocando um par de fórceps no olho direito e aplicar pressão. Enquanto segura a cabeça firme, use uma agulha de tungstênio para remover o ectoderma host para acomodar o enxerto. </li><li> Transferência do enxerto ao hospedeiro, utilizando uma pipeta de vidro. </li><li> Posição do enxerto para substituir o ectoderma removido. Insira um alfinete de vidro em cada canto do tecido enxertado para fixar o enxerto no local. Para fazer com que os pinos de vidro, puxe um tubo microcapilar a um ponto fino sobre uma chama de álcool. </li><li> Coloque fita firmemente em cima do buraco e voltar embrião para a incubadora para o comprimento de tempo adequado para análise. </li><li> veja também: 9 </li></ol> 3. Resultados representativos: Para avaliar quimeras, os embriões devem ser coletadas e processadas para análise da distribuição de host e tecidos de doadores. Para a detecção de células de codorna, imunohistoquímica utilizando o anticorpo QcPN (descrito em: 3) é empregado, e para a detecção de células de camundongo, hibridização in situ em cortes de parafina é usada 6. Células do doador deve ser restrito ao epitélio, e não deve haver nenhuma evidência de tecidos de doadores mesenquimais (Figura 1). A presença de células do doador isolado no mesênquima indica a presença de células da crista neural contaminação que irá confundir qualquer interpretação morfológica devido à influência dessas células em muitos aspectos do desenvolvimento facial (por exemplo, 10). Uma vez convencidos de que a técnica de enxerto é livre de contaminação mesênquima, medidas de resultados ainda morfológicas ou moleculares podem ser utilizados para avaliar as quimeras. Para nossos propósitos, que detectou a presença de cartilagens e ossos ectópica que correspondeu a duplicação da mandíbula superior, que foram induzidos pelos tecidos transplantados (Figura 2), e alterações moleculares nos tecidos mesenquimais, em resposta ao ectoderma enxertado (Figura 3) 5,6. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Avaliação do quimerismo (A) coloração Anti-QcPN é usado para detectar células de codorna em codorna-chick quimeras. Não há nenhuma evidência de coloração no mesênquima. (B) A hibridização in situ é usado para detectar a expressão de transcritos SINE B2 em grão-de-rato quimeras. Expressão é restrita ao ectoderma que compõem o enxerto. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Coloração Tricrômico mostra a duplicação do esqueleto maxilar superior em (A) de codorna-chick quimera, e (B) do mouse grão-de-quimeras. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. O ectoderma regultes expressão gênica no mesênquima. (A) expressão Bmp7 normal no mesênquima de um embrião de galinha (radioativo hibridização in situ com o positivo sinal vermelho pseudo-colorido no Adobe Photoshop). (B) expressão Bmp7 é induzida no mesênquima adjacente ao enxerto (Seta) em embriões quiméricos.

<ol><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Neural+Crest+in+Patterning+of+Avian+Cranial+Skeletal%2C+Connective%2C+and+Muscle+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues.</a> Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mesodermal+Tissues+on+Avian+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration.</a> Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+can+form+cartilages+normally+derived+from+mesoderm+during+development+of+the+avian+head+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton.</a> Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).</li>
<li>Couly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Hox-negative+cephalic+neural+crest+cells+and+the+foregut+endoderm+in+patterning+the+facial+skeleton+in+the+vertebrate+head%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head.</a> Development. 129, 1061-1061 (2002).</li>
<li>Evans, D. J., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relations+between+avian+craniofacial+neural+crest+and+paraxial+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells.</a> Dev Dyn. , (2006).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130, 1749-1749 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Dev Biol. 325, 200-200 (2009).</li>
<li>Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+derivatives+of+the+neural+crest%3A+analysis+of+chimaeric+quail+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).</li>
<li>Bollag, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+repetitive+mouse+B2+element+to+identify+transplanted+mouse+cells+in+mouse-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras.</a> Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-duck+chimeras+reveal+spatiotemporal+plasticity+in+molecular+and+histogenic+programs+of+cranial+feather+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development.</a> Development. 132, 1499-1499 (2005).</li>
<li>Odent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Sonic+hedgehog+%28SHH+%29+gene+during+early+human+development+and+phenotypic+expression+of+new+mutations+causing+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly.</a> Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).</li>
<li>Szabo-Rogers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skeletogenic+patterning+roles+for+the+olfactory+pit%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit.</a> Development. 136, 219-219 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Usando este método de transplante nos permitiu determinar que o ectoderma contém informações de sinalização que regula a polaridade dorsoventral e extensão proximodistal do maxilar superior. A similaridade de resultados quando se utiliza codorniz ou ectoderma mouse, ea conservação dos sinais moleculares neste tecido entre muitas espécies 6,11 indica que este é um centro altamente conservada entre os vertebrados de sinalização. Além disso, outros pesquisadores usaram técnicas semelhantes para testar as proprie...

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>University of California - San Francisco</td><td>CCFDA003</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 35x10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont nº 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulha</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de tungstênio</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcapilar </td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-225-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para lâmina</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliar propriedades sinalização de ectodérmica epitélio durante o desenvolvimento craniofacial

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

A acessibilidade dos embriões aviária ajudou embriologistas experimental entender o destino das células durante o desenvolvimento eo papel das interações tecido que regulam padronização e morfogênese de vertebrados (eg, 1, 2, 3, 4). Aqui, nós ilustrar um método que explora essa acessibilidade para testar a sinalização e as propriedades padrões dos tecidos durante o desenvolvimento ectodérmico facial. Nesses experimentos, nós criamos codornas-chick 5 ou 6 do mouse grão-de-quimeras transplantando o ectoderma cefálica que cobre a mandíbula superior de codorniz ou o mouse para qualquer região do mesmo ou uma região ectópica de embriões de galinha. O uso de codorna como tecido do doador para o transplante em pintos foi desenvolvido para tirar vantagem de um marcador nucleolar presente em codornas mas não células de bico, permitindo assim que os pesquisadores a distinguir host e tecidos de doadores 7. Da mesma forma, um elemento repetitivo está presente no genoma do rato e é expressa ubiquitously, que nos permite distinguir host e tecidos de doadores em grão-de-rato quimeras 8. O uso de ectoderma mouse como tecido do doador será extremamente estender nossa compreensão dessas interações tecido, porque isso irá permitir-nos testar as propriedades de sinalização do ectoderma derivado de vários embriões mutantes.

Este artigo descreve uma técnica de transplante de tecido que foi projetado para testar a sinalização e padronização das propriedades ectoderma de superfície cefálica durante o desenvolvimento craniofacial.

Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

A acessibilidade de embriões aviários tem ajudado embriologistas experimentais a compreender os destinos das células durante o desenvolvimento e o papel do tecido...

O objetivo geral deste procedimento é criar embriões quiméricos por meio do transplante de ectoderma de embriões doadores para a mandíbula superior em desenvolvimento de embriões de galinha. Isso é realizado primeiramente removendo o derme doador para transplante. Em seguida, o local receptor é preparado para o enxerto.O passo final do procedimento é posicionar o tecido doador no local receptor e fixar o enxerto em sua posição. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram o enxerto exclusivo do ectoderma doador, e por meio de análises moleculares e morfológicas, pode-se determinar a função do ectoderma doador. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como identificar o papel de diversos tecidos durante a morfogênese.Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Diane, pesquisadora sênior do nosso laboratório. Antes de iniciar este procedimento, prepare o meio e certifique-se de que todas as soluções necessárias estejam acessíveis e na temperatura correta. Em seguida, usando proteção ocular adequada, puxe tubos capilares de microalça até obter uma ponta fina sobre uma chama de álcool.Para fazer pinos de vidro, afie agulh

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Biologia

Cartilagens craniofacial desenvolver em estreito contato com outros tecidos e são difíceis de manipular em animais vivos. Estamos usando eletroporação para entregar ferramentas moleculares durante o crescimento do esqueleto craniofacial, enquanto ignorando cedo efeitos embrionárias. Esta abordagem irá permitir-nos testar de forma eficiente as moléculas de...

Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

O mesênquima craniana sofre movimentos morfogênicos dramáticas que provavelmente fornece uma força motriz para a elevação das pregas...

Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

Um protocolo para a separação da ectoderme embrionária facial e mesênquima é descrito. Usamos Dispase II para tratar embriões inteiros primeiro, dissecar todo proeminências faciais, e então separar o ectoderma facial e mesênquima.

Separação de Ectoderma embrionárias de camundongos Facial e mesênquima

Uma técnica para o transplante "Extreme Anterior Domain" tecido facial entre embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Tecidos podem ser movidos de um gene de expressão fundo em outra, permitindo o estudo das necessidades locais para o desenvolvimento craniofacial e sinalização para as interações entre as regiões faciais.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Este protocolo descreve como dissecar crista neural craniana premigratory (NC) de Xenopus laevis neurulas. Estes explantes podem ser semeadas em fibronectina e cultivadas in vitro, ou enxertados em embriões hospedeiros. Esta técnica permite estudar os mecanismos da transição epitélio NC-to-mesênquima, migração e diferenciação.

Dissecção<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crista neural para<em&gt; In vitro</em&gt; Cultura Explant ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplante

Time-lapse confocal de imagem é uma poderosa técnica útil para caracterizar o desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos a metodologia e caracterizar morfogênese craniofacial no tipo selvagem, bem como PDGFRA, smad5, e SMO embriões mutantes.

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Este artigo descreve um método para gerar embriões quiméricos que são projetados para testar as contribuições específicas de espécies de crista neural e / ou outros tecidos para o desenvolvimento craniofacial.

Avaliando Contribuições Espécies específicas Para o Desenvolvimento Craniofacial Utilizando Quimeras Codorniz-pato

Protocolos que usam barreiras impermeáveis para bloquear eventos de indução entre os tecidos do eixo e flanco do corpo principal no embrião de galinha necessários para a formação do membro são descritos. Grânulos embebidos em sinais indutivos candidatos são usados para superar o efeito da colocação da barreira e a análise da expressão gênica confirma isso.

Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para detectar e quantificar níveis da proteína durante a morfogênese/patogénese craniofacial pela imunocoloração usando tecidos craniofacial do rato como exemplos. Além, nós descrevemos um método para a preparação e o criossecção de tecidos duros secçóes dos ratos novos para a imunocoloração.

Preparo tecidual e imunocoloração de tecidos craniofaciais do camundongo e osso não-descalcificado

Este artigo descreve uma técnica de transplante tecidual que foi projetada para testar as propriedades de sinalização e padronização do prosencéfalo basal durante o desenvolvimento craniofacial.

Criando quimeras do prosencéfalo aviário para avaliar o desenvolvimento facial

O protocolo apresenta um método para isolar os lises de proteínas celulares inteiras de processos faciais de embriões de camundongos dissecados ou células de mesenquime palatina embrionárias cultivadas e realizar posteriormente manchas ocidentais para avaliar os níveis de proteína fosfoilada.

Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína

Aprenda a técnica de transplante de ectodérmica para criar embriões quiméricos em galinhas. Este método permite estudar propriedades de sinalização e padrão durante o desenvolvimento craniofacial.

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