Name: Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a técnica de transplante de ectodérmica para criar embriões quiméricos em galinhas. Este método permite estudar propriedades de sinalização e padrão durante o desenvolvimento craniofacial.

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Este trabalho foi financiado pelo R01-R01-DE018234 e DE019638.

1. Preparar o tecido do doador <ol><li> Prepare meios de cultura, sharpen pinos de vidro, afiar agulhas de tungstênio. </li><li> Coletar embriões a partir de casca, lavar em PBS gelado. <ol class="lalpha"><li> Usando uma seringa de 10 ml e uma agulha de calibre 18 remover 1,0 mL de albumina da extremidade pontiaguda da casca do ovo. </li><li> Faça um pequeno furo na parte superior do escudo usando o ponto de tesouras, e depois cortar uma abertura circular para expor o embrião </li></ol></li><li> Retire a cabeça e coloque em DMEM (soro livre, temperatura ambiente) </li><li> Dissecar processo frontonasal do embrião (ou o site de outros doadores, como processo maxilar ou mandibular) </li><li> Digest em 2.4U / mL em PBS dispase em gelo por 20 minutos </li><li> Cobrir tecidos com DMEM com BSA 1% para parar a digestão </li><li> Use agulha de tungstênio afiadas para ectoderma separado, mesênquima, e neuroectoderma </li><li> Loja de tecidos do enxerto em DMEM BSA 1% em gelo até anfitrião está pronto para transplante </li></ol> 2. Preparando o Host <ol><li> Expor o embrião <ol class="lalpha"><li> Usando uma seringa de 10 ml e uma agulha de calibre 18 remover 1,0 mL de albumina da extremidade pontiaguda da casca do ovo. </li><li> Faça um pequeno furo na parte superior do escudo usando o ponto de tesouras. Coloque um pedaço de fita adesiva sobre o furo, e depois cortar uma abertura circular para expor o embrião. </li></ol></li><li> Usando dois pares de fórceps, segure o âmnio e gentilmente lacrimogêneo para fazer um buraco. </li><li> Gire a cabeça, colocando um par de fórceps no olho direito e aplicar pressão. Enquanto segura a cabeça firme, use uma agulha de tungstênio para remover o ectoderma host para acomodar o enxerto. </li><li> Transferência do enxerto ao hospedeiro, utilizando uma pipeta de vidro. </li><li> Posição do enxerto para substituir o ectoderma removido. Insira um alfinete de vidro em cada canto do tecido enxertado para fixar o enxerto no local. Para fazer com que os pinos de vidro, puxe um tubo microcapilar a um ponto fino sobre uma chama de álcool. </li><li> Coloque fita firmemente em cima do buraco e voltar embrião para a incubadora para o comprimento de tempo adequado para análise. </li><li> veja também: 9 </li></ol> 3. Resultados representativos: Para avaliar quimeras, os embriões devem ser coletadas e processadas para análise da distribuição de host e tecidos de doadores. Para a detecção de células de codorna, imunohistoquímica utilizando o anticorpo QcPN (descrito em: 3) é empregado, e para a detecção de células de camundongo, hibridização in situ em cortes de parafina é usada 6. Células do doador deve ser restrito ao epitélio, e não deve haver nenhuma evidência de tecidos de doadores mesenquimais (Figura 1). A presença de células do doador isolado no mesênquima indica a presença de células da crista neural contaminação que irá confundir qualquer interpretação morfológica devido à influência dessas células em muitos aspectos do desenvolvimento facial (por exemplo, 10). Uma vez convencidos de que a técnica de enxerto é livre de contaminação mesênquima, medidas de resultados ainda morfológicas ou moleculares podem ser utilizados para avaliar as quimeras. Para nossos propósitos, que detectou a presença de cartilagens e ossos ectópica que correspondeu a duplicação da mandíbula superior, que foram induzidos pelos tecidos transplantados (Figura 2), e alterações moleculares nos tecidos mesenquimais, em resposta ao ectoderma enxertado (Figura 3) 5,6. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Avaliação do quimerismo (A) coloração Anti-QcPN é usado para detectar células de codorna em codorna-chick quimeras. Não há nenhuma evidência de coloração no mesênquima. (B) A hibridização in situ é usado para detectar a expressão de transcritos SINE B2 em grão-de-rato quimeras. Expressão é restrita ao ectoderma que compõem o enxerto. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Coloração Tricrômico mostra a duplicação do esqueleto maxilar superior em (A) de codorna-chick quimera, e (B) do mouse grão-de-quimeras. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. O ectoderma regultes expressão gênica no mesênquima. (A) expressão Bmp7 normal no mesênquima de um embrião de galinha (radioativo hibridização in situ com o positivo sinal vermelho pseudo-colorido no Adobe Photoshop). (B) expressão Bmp7 é induzida no mesênquima adjacente ao enxerto (Seta) em embriões quiméricos.

<ol><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Neural+Crest+in+Patterning+of+Avian+Cranial+Skeletal%2C+Connective%2C+and+Muscle+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues.</a> Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mesodermal+Tissues+on+Avian+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration.</a> Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+can+form+cartilages+normally+derived+from+mesoderm+during+development+of+the+avian+head+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton.</a> Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).</li>
<li>Couly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Hox-negative+cephalic+neural+crest+cells+and+the+foregut+endoderm+in+patterning+the+facial+skeleton+in+the+vertebrate+head%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head.</a> Development. 129, 1061-1061 (2002).</li>
<li>Evans, D. J., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relations+between+avian+craniofacial+neural+crest+and+paraxial+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells.</a> Dev Dyn. , (2006).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130, 1749-1749 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Dev Biol. 325, 200-200 (2009).</li>
<li>Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+derivatives+of+the+neural+crest%3A+analysis+of+chimaeric+quail+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).</li>
<li>Bollag, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+repetitive+mouse+B2+element+to+identify+transplanted+mouse+cells+in+mouse-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras.</a> Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-duck+chimeras+reveal+spatiotemporal+plasticity+in+molecular+and+histogenic+programs+of+cranial+feather+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development.</a> Development. 132, 1499-1499 (2005).</li>
<li>Odent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Sonic+hedgehog+%28SHH+%29+gene+during+early+human+development+and+phenotypic+expression+of+new+mutations+causing+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly.</a> Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).</li>
<li>Szabo-Rogers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skeletogenic+patterning+roles+for+the+olfactory+pit%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit.</a> Development. 136, 219-219 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Usando este método de transplante nos permitiu determinar que o ectoderma contém informações de sinalização que regula a polaridade dorsoventral e extensão proximodistal do maxilar superior. A similaridade de resultados quando se utiliza codorniz ou ectoderma mouse, ea conservação dos sinais moleculares neste tecido entre muitas espécies 6,11 indica que este é um centro altamente conservada entre os vertebrados de sinalização. Além disso, outros pesquisadores usaram técnicas semelhantes para testar as proprie...

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>University of California - San Francisco</td><td>CCFDA003</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 35x10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont nº 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulha</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de tungstênio</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcapilar </td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-225-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para lâmina</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliar propriedades sinalização de ectodérmica epitélio durante o desenvolvimento craniofacial

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

A acessibilidade dos embriões aviária ajudou embriologistas experimental entender o destino das células durante o desenvolvimento eo papel das interações tecido que regulam padronização e morfogênese de vertebrados (eg, 1, 2, 3, 4). Aqui, nós ilustrar um método que explora essa acessibilidade para testar a sinalização e as propriedades padrões dos tecidos durante o desenvolvimento ectodérmico facial. Nesses experimentos, nós criamos codornas-chick 5 ou 6 do mouse grão-de-quimeras transplantando o ectoderma cefálica que cobre a mandíbula superior de codorniz ou o mouse para qualquer região do mesmo ou uma região ectópica de embriões de galinha. O uso de codorna como tecido do doador para o transplante em pintos foi desenvolvido para tirar vantagem de um marcador nucleolar presente em codornas mas não células de bico, permitindo assim que os pesquisadores a distinguir host e tecidos de doadores 7. Da mesma forma, um elemento repetitivo está presente no genoma do rato e é expressa ubiquitously, que nos permite distinguir host e tecidos de doadores em grão-de-rato quimeras 8. O uso de ectoderma mouse como tecido do doador será extremamente estender nossa compreensão dessas interações tecido, porque isso irá permitir-nos testar as propriedades de sinalização do ectoderma derivado de vários embriões mutantes.

Este artigo descreve uma técnica de transplante de tecido que foi projetado para testar a sinalização e padronização das propriedades ectoderma de superfície cefálica durante o desenvolvimento craniofacial.

Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

A acessibilidade de embriões aviários tem ajudado embriologistas experimentais a compreender os destinos das células durante o desenvolvimento e o papel do tecido...

O objetivo geral deste procedimento é criar embriões quiméricos por meio do transplante de ectoderma de embriões doadores para a mandíbula superior em desenvolvimento de embriões de galinha. Isso é realizado primeiramente removendo o derme doador para transplante. Em seguida, o local receptor é preparado para o enxerto.O passo final do procedimento é posicionar o tecido doador no local receptor e fixar o enxerto em sua posição. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram o enxerto exclusivo do ectoderma doador, e por meio de análises moleculares e morfológicas, pode-se determinar a função do ectoderma doador. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como identificar o papel de diversos tecidos durante a morfogênese.Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Diane, pesquisadora sênior do nosso laboratório. Antes de iniciar este procedimento, prepare o meio e certifique-se de que todas as soluções necessárias estejam acessíveis e na temperatura correta. Em seguida, usando proteção ocular adequada, puxe tubos capilares de microalça até obter uma ponta fina sobre uma chama de álcool.Para fazer pinos de vidro, afie agulhas de tungstênio segurando-as na chama de um maçarico de propano. Comece a extração do embrião doador da casca colocando um pedaço de fita adesiva sobre a extremidade do ovo. Em seguida, use a ponta de uma agulha de dissecação para criar um pequeno orifício no centro da fita.Insira uma seringa de 10 mililitros e uma agulha hipodérmica de calibre 18 no orifício e remova um mililitro de albúmina do ovo. Em seguida, usando uma agulha de dissecação, faça um pequeno orifício na parte superior da casca. Coloque um segundo pedaço de fita adesiva para cobrir esse orifício.Corte uma abertura circular no ovo usando dois pares de pin&ccedil;as. Segure o embri&atilde;o e coloque-o em um recipiente com PBS gelado para lavar. Ap&oacute;s a remo&ccedil;&atilde;o da cabe&ccedil;a do embri&atilde;o, coloque-a em uma placa de cultura celular contendo DMEM sem soro &agrave; temperatura ambiente.Coloque a placa sob o microscópio estereoscópico enquanto segura a cabeça com uma pinça. Use uma tesoura de mola para dissecar grosseiramente a mandíbula superior e o lagon do restante da cabeça. Em seguida, utilizando um porta-lâmina com uma lâmina de barbear afiada, retire o processo nasal frontal da mandíbula superior.Utilize uma pipeta para transferir o processo nasal frontonasal para uma placa de Petri de 30 milímetros contendo um volume suficiente de diss em PBS e incube no gelo por 20 minutos. Após o tempo de incubação, aspire a solução de dispa sem perturbar o tecido. Em seguida, cubra completamente os tecidos com DMEM contendo 1% de BSA.Para interromper a digestão, transfira o tecido para uma nova placa de cultura. Em seguida, trabalhando sob um microscópio estereoscópico, segure o tecido com uma agulha de tungstênio não afiada usando uma agulha de tungstênio afiada.Se pare o ectoderma destacando-o dos outros tecidos. Após o preparo, armazene o tecido enxertado em DMEM com BSA sob gelo até que o hospedeiro esteja pronto para o transplante. Usando o método previamente demonstrado, crie uma janela no ovo de galinha.Coloque o ovo contendo o embrião sob o microscópio estereoscópico usando dois pares de pinças. Segure a membrana IGN e o âmnio e rasgue suavemente para fazer um orifício e expor o embrião hospedeiro. Gire a cabeça colocando um par de pinças sobre o olho direito e aplicando pressão, ao mesmo tempo em que mantém a cabeça firme.Use uma pinça e uma agulha para remover a derme do hospedeiro a fim de acomodar o enxerto. Adicione dois microlitros de vermelho neutro à placa de Petri contendo os enxertos preparados. Use uma pipeta de vidro para transferir o enxerto para o hospedeiro.Posicione o enxerto para substituir o ectoderma removido. Insira um pino de vidro em cada canto do tecido enxertado para fixar o enxerto no lugar após o transplante. Feche a janela firmemente com fita.Retorne o embrião ao incubador até o estágio de desenvolvimento necessário para a análise; esta imagem mostra tecido de um embrião de codorna URA que foi corado com anticorpo específico anti Q-C-P-N-A de codorna. O tecido enxertado está localizado entre as duas setas. Não há evidência de coloração por QCPN no tecido mesodérmico de uma quimera de camundongo, como visto aqui. Novamente, o tecido enxertado está localizado entre as duas setas em C, hibridização com sonda específica para a sequência repetitiva sign B dois.A análise dos genes da classe um revela que a expressão do marcador B dois é restrita ao córtex que compreende o enxerto mostrado aqui como uma imagem de um espécime quimérico de codorna e pintinho, cuja coloração tricrômica torna o colágeno e o osso de cor azul. A duplicação do esqueleto da mandíbula superior é observada conforme indicado pela seta. Esta imagem mostra novamente um espécime quimérico de camundongo e pintinho submetido à coloração tricrômica.Observa-se a duplicação do esqueleto da mandíbula superior. Esta imagem mostra a hibridização por radioautografia in situ da expressão normal de BMP7 no mesênquima de um embrião de galinha com enxerto. O tecido mostrado aqui é proveniente de uma quimera camundongo-galinha. Pode-se observar que a expressão de BMP7 é induzida no mesênquima adjacente ao enxerto, conforme indicado pela seta.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular embriões de galinha para avaliar os mecanismos que regulam o desenvolvimento do processo frontal e nasal.

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Biologia

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Dissecção<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crista neural para<em&gt; In vitro</em&gt; Cultura Explant ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplante

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