Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

O objetivo geral deste procedimento é criar embriões quiméricos transplantando ectoderma de embriões de doadores para a mandíbula superior em desenvolvimento de embriões de pintinhos. Isso é feito removendo primeiro a derme doadora para transplante. Em seguida, o local hospedeiro é preparado para o enxerto.

A etapa final do procedimento é colocar o tecido doador no local hospedeiro e fixar o enxerto na posição. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram enxerto exclusivo de ectoderma doador e, por meio de análise molecular e morfológica, a função do derme recodificador do doador pode ser determinada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como identificar o papel de vários tecidos durante a morfogênese.

Demonstrando o procedimento estará a Dra. Diane, que é uma investigadora sênior de nosso laboratório. Antes de iniciar este procedimento, prepare o meio e certifique-se de que todas as soluções necessárias estejam acessíveis e na temperatura correta. Em seguida, enquanto estiver usando proteção adequada para os olhos, puxe os tubos microcapilares até uma ponta fina sobre uma chama de álcool.

Para fazer pinos de vidro, afie agulhas de tungstênio, segurando-as na chama de uma tocha de propano. Comece a extração do embrião doador da casca colocando um pedaço de fita adesiva sobre a extremidade do óvulo. Em seguida, use a ponta de uma agulha de dissecação para criar um pequeno orifício no centro da fita.

Insira uma seringa de 10 mililitros e uma agulha hipodérmica de calibre 18 no orifício e remova um mililitro de albumina do ovo. Em seguida, usando uma agulha de dissecação, faça um pequeno orifício na parte superior da casca. Coloque um segundo pedaço de fita adesiva para cobrir este buraco.

Corte uma abertura circular no ovo usando dois pares de pinças. Segure o embrião e coloque-o em um prato de PBS gelado para lavar. Depois de a cabeça do embrião ter sido removida, colocá-la numa placa de cultura de tecidos contendo DMEM livre de soro à temperatura ambiente.

Coloque o prato sob o microscópio de dissecação enquanto segura a cabeça com uma pinça. Use uma tesoura de mola para dissecar grosseiramente a mandíbula superior e o lagon do resto da cabeça. Em seguida, usando um porta-lâmina com uma lâmina de barbear afiada, apare o processo nasal frontal da mandíbula superior.

Use uma pipeta para transferir o processo nasal frontonal para uma placa de Petri de 30 milímetros contendo um volume suficiente de diss em PBS e incube no gelo por 20 minutos. Decorrido o tempo de incubação, aspirar a solução dispa sem perturbar o tecido. Em seguida, cubra completamente os tecidos com DMEM contendo 1% BSA.

Para interromper a digestão, transfira o tecido para uma nova placa de cultura. Em seguida, trabalhando sob um microscópio de dissecação. Segure o tecido com uma agulha de tungstênio não afiada usando uma agulha de tungstênio afiada.

Separe o ectoderma retirando-o dos outros tecidos. Uma vez preparado, armazene o tecido do enxerto em DMEM com BSA no gelo até que o hospedeiro esteja pronto para o transplante. Usando o método demonstrado anteriormente, crie uma janela no ovo de galinha.

Coloque o ovo contendo o embrião sob o microscópio de dissecação usando dois pares de pinças. Segure a membrana IGN e o âmnio e rasgue suavemente para fazer um orifício e expor o embrião hospedeiro. Gire a cabeça colocando um par de pinças no olho direito e aplicando pressão enquanto mantém a cabeça firme.

Use uma língua e uma agulha para remover a derme hospedeira para acomodar o enxerto. Adicione dois microlitros de vermelho neutro à placa de Petri que contém os enxertos preparados. Use uma pipeta de vidro para transferir o enxerto para o hospedeiro.

Coloque o enxerto na posição para substituir o ectoderma removido. Insira um pino de vidro em cada canto do tecido enxertado para prender o enxerto no lugar Após o enxerto. Feche bem a janela com fita adesiva.

Retorne o embrião à incubadora até o estágio de desenvolvimento necessário para análise, esta imagem mostra o tecido de um pintinho de codorna URA que foi corado com anticorpo específico de codorna anti QCPNA. O tecido enxertado está localizado entre as duas setas. Não há evidência de coloração QCPN no tecido tipo meen de um espelho de carrilhão de pintinho de camundongo é visto aqui Novamente, o tecido enxertado está localizado entre as duas setas em C duas hibridização com aprovação específica para o sinal B duas sequências repetitivas.

No espelhamento de genes de classe um revela que a expressão do sinal B dois é restrita ao oma que compreende o enxerto mostrado aqui como uma imagem de um espelho de carrilhão de pintinho de codorna que foi corado com tricrômico coloração tricromática torna o colágeno e o osso de cor azul. A duplicação do esqueleto da mandíbula superior é vista conforme indicado pela seta. Esta imagem mostra um espelho de carrilhão de pintinho de rato que foi manchado com tricrômico novamente.

Observa-se duplicação do esqueleto da mandíbula superior. Esta imagem mostra a hibridização radioativa em C dois da expressão normal de BMP sete na mechy de um embrião de pintinho rafted mostrado aqui é tecido de um espelho de carrilhão de pintinho de camundongo. Pode-se observar que a expressão de BMP seven é induzida na membrana adjacente ao enxerto, conforme indicado pela seta.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manipular embriões de pintinhos para avaliar os mecanismos que regulam o desenvolvimento do processo frontal e nasal.