Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

O objetivo geral deste procedimento é criar embriões quiméricos por meio do transplante de ectoderma de embriões doadores para a mandíbula superior em desenvolvimento de embriões de galinha. Isso é realizado primeiramente removendo o derme doador para transplante. Em seguida, o local receptor é preparado para o enxerto.

O passo final do procedimento é posicionar o tecido doador no local receptor e fixar o enxerto em sua posição. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram o enxerto exclusivo do ectoderma doador, e por meio de análises moleculares e morfológicas, pode-se determinar a função do ectoderma doador. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como identificar o papel de diversos tecidos durante a morfogênese.

Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Diane, pesquisadora sênior do nosso laboratório. Antes de iniciar este procedimento, prepare o meio e certifique-se de que todas as soluções necessárias estejam acessíveis e na temperatura correta. Em seguida, usando proteção ocular adequada, puxe tubos capilares de microalça até obter uma ponta fina sobre uma chama de álcool.

Para fazer pinos de vidro, afie agulhas de tungstênio segurando-as na chama de um maçarico de propano. Comece a extração do embrião doador da casca colocando um pedaço de fita adesiva sobre a extremidade do ovo. Em seguida, use a ponta de uma agulha de dissecação para criar um pequeno orifício no centro da fita.

Insira uma seringa de 10 mililitros e uma agulha hipodérmica de calibre 18 no orifício e remova um mililitro de albúmina do ovo. Em seguida, usando uma agulha de dissecação, faça um pequeno orifício na parte superior da casca. Coloque um segundo pedaço de fita adesiva para cobrir esse orifício.

Corte uma abertura circular no ovo usando dois pares de pinças. Segure o embrião e coloque-o em um recipiente com PBS gelado para lavar. Após a remoção da cabeça do embrião, coloque-a em uma placa de cultura celular contendo DMEM sem soro à temperatura ambiente.

Coloque a placa sob o microscópio estereoscópico enquanto segura a cabeça com uma pinça. Use uma tesoura de mola para dissecar grosseiramente a mandíbula superior e o lagon do restante da cabeça. Em seguida, utilizando um porta-lâmina com uma lâmina de barbear afiada, retire o processo nasal frontal da mandíbula superior.

Utilize uma pipeta para transferir o processo nasal frontonasal para uma placa de Petri de 30 milímetros contendo um volume suficiente de diss em PBS e incube no gelo por 20 minutos. Após o tempo de incubação, aspire a solução de dispa sem perturbar o tecido. Em seguida, cubra completamente os tecidos com DMEM contendo 1% de BSA.

Para interromper a digestão, transfira o tecido para uma nova placa de cultura. Em seguida, trabalhando sob um microscópio estereoscópico, segure o tecido com uma agulha de tungstênio não afiada usando uma agulha de tungstênio afiada.

Se pare o ectoderma destacando-o dos outros tecidos. Após o preparo, armazene o tecido enxertado em DMEM com BSA sob gelo até que o hospedeiro esteja pronto para o transplante. Usando o método previamente demonstrado, crie uma janela no ovo de galinha.

Coloque o ovo contendo o embrião sob o microscópio estereoscópico usando dois pares de pinças. Segure a membrana IGN e o âmnio e rasgue suavemente para fazer um orifício e expor o embrião hospedeiro. Gire a cabeça colocando um par de pinças sobre o olho direito e aplicando pressão, ao mesmo tempo em que mantém a cabeça firme.

Use uma pinça e uma agulha para remover a derme do hospedeiro a fim de acomodar o enxerto. Adicione dois microlitros de vermelho neutro à placa de Petri contendo os enxertos preparados. Use uma pipeta de vidro para transferir o enxerto para o hospedeiro.

Posicione o enxerto para substituir o ectoderma removido. Insira um pino de vidro em cada canto do tecido enxertado para fixar o enxerto no lugar após o transplante. Feche a janela firmemente com fita.

Retorne o embrião ao incubador até o estágio de desenvolvimento necessário para a análise; esta imagem mostra tecido de um embrião de codorna URA que foi corado com anticorpo específico anti Q-C-P-N-A de codorna. O tecido enxertado está localizado entre as duas setas. Não há evidência de coloração por QCPN no tecido mesodérmico de uma quimera de camundongo, como visto aqui. Novamente, o tecido enxertado está localizado entre as duas setas em C, hibridização com sonda específica para a sequência repetitiva sign B dois.

A análise dos genes da classe um revela que a expressão do marcador B dois é restrita ao córtex que compreende o enxerto mostrado aqui como uma imagem de um espécime quimérico de codorna e pintinho, cuja coloração tricrômica torna o colágeno e o osso de cor azul. A duplicação do esqueleto da mandíbula superior é observada conforme indicado pela seta. Esta imagem mostra novamente um espécime quimérico de camundongo e pintinho submetido à coloração tricrômica.

Observa-se a duplicação do esqueleto da mandíbula superior. Esta imagem mostra a hibridização por radioautografia in situ da expressão normal de BMP7 no mesênquima de um embrião de galinha com enxerto. O tecido mostrado aqui é proveniente de uma quimera camundongo-galinha. Pode-se observar que a expressão de BMP7 é induzida no mesênquima adjacente ao enxerto, conforme indicado pela seta.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular embriões de galinha para avaliar os mecanismos que regulam o desenvolvimento do processo frontal e nasal.