Ortotópico do xeno-Human-luciferase Tagged maligna dos nervos periféricos Células Tumorais Bainha para In vivo Teste de Agentes Terapêuticos candidatos

Um método para enxertia confiável luciferase marcadas humana maligna dos nervos periféricos células tumorais em bainha do nervo ciático de ratos imunodeficientes é descrito. A utilização de imagem de bioluminescência para demonstrar estabelecimento adequado de enxertos tumor e critérios para a segregação aleatória dos animais em grupos de estudo são também discutidos.

O objetivo geral deste procedimento é determinar se um agente terapêutico candidato inibe efetivamente o crescimento de células MPN TS enxertadas no nervo ciático de camundongos imunodeficientes. Isso é feito removendo primeiro as células tumorais de um frasco de tecido, lavando-as e suspendendo-as na concentração adequada. O segundo passo do procedimento é expor cirurgicamente o nervo ciático e, em seguida, injetar no nervo 5.000 células.

O próximo passo é determinar o sucesso do enxerto usando imagens in vivo, baseadas em luz, randomizando a NIC para grupos de estudo e iniciando a terapia com o agente terapêutico candidato. A etapa final do procedimento é coletar os tumores 30 dias após o enxerto e analisar os efeitos que o agente terapêutico candidato teve sobre o tumor. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram se o agente terapêutico diminuiu o crescimento do tumor por meio de métodos como comparação de pesos tumorais, observando as taxas relativas de proliferação por meio de imunocoloração para KI 67 e avaliando os níveis de morte de células tumorais em camundongos de controle e tratados com ensaios de túnel.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o enxerto subcutâneo, é que ela modela o microambiente normal, que modela melhor o crescimento do MPST, demonstrando essa técnica, será Amy Turk, uma técnica do meu laboratório. Camundongos imunodeficientes não nus são preparados um dia antes da enxertia. Use uma tesoura para raspar o cabelo de um rato anestesiado trabalhando em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal.

Use um agente depilatório químico para remover qualquer cabelo restante. Depois que todo o cabelo for removido, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma gaiola de isolamento sem cama até que esteja totalmente recuperado. No dia da enxertia, centrifugue as células a 3000 RPM por cinco minutos.

Remover o snat com cuidado e ressuspender o sedimento celular em DMEM 10 sem pur micina até uma concentração final de cinco vezes 10 elevado a três células por três microlitros. Mantenha as células no gelo até que estejam prontas para uso. Para começar, coloque um animal anestesiado em uma almofada de aquecimento e aplique pomada oftálmica em cada olho.

Prenda uma etiqueta de orelha com um número de identificador exclusivo na orelha direita de cada mouse. Para facilitar a identificação durante todo o estudo, coloque o animal de bruços e abra as patas traseiras. Cubra o mouse com uma cortina estéril e exponha uma janela cirúrgica onde ocorrerá o enxerto.

Aplique Betadine no local da cirurgia com um aplicador com ponta de algodão, começando no centro do flanco e gradualmente espiralando para fora até as bordas da janela cirúrgica. O etanol a 70% é então aplicado no local da cirurgia da mesma maneira. Aplicações consecutivas de Betadine seguidas de etanol são repetidas mais duas vezes.

Remova as células do gelo e faça um vórtice suave ou mova o tubo para ressuspender as células sedimentadas. Use uma pipeta para remover 3,2 microlitros da suspensão celular e ejetá-la em um pedaço de paraforme. Puxe três microlitros da suspensão celular para uma seringa Hamilton de 10 microlitros.

Equipado com uma agulha de calibre 33. Segure as células e a célula que contém a seringa no gelo até que estejam prontas para uso. Use um cabo de bisturi número quatro, equipado com uma lâmina de bisturi número 22 para fazer uma incisão na pele do flanco logo abaixo e paralela ao fêmur.

Abra a incisão na pele com a pinça cirúrgica para expor o músculo subjacente. Use uma tesoura de ponta afiada para dissecar a fáscia ao longo do comprimento da perna e expor o nervo ciático que fica sob uma estrutura linear branca com a espessura de um fio grosso trabalhando sob um microscópio. Use um par de pinças curvas de ponta afiada para dissecar cuidadosamente sob o nervo, soltando-o do músculo subjacente.

Deixe a pinça no lugar para manter o nervo elevado e isolado com cuidado Insira a agulha da seringa de Hamilton no nervo tentando manter o ângulo de injeção o mais paralelo possível ao nervo, para não perfurar a parte inferior. Uma vez que a agulha esteja posicionada corretamente no nervo, relaxe a tensão produzida pela pinça e injete lentamente as células ao longo de 45 a 60 segundos. Uma injeção lenta é essencial para evitar uma retrolavagem das células tumorais, resultando em sua perda.

Depois que todas as células forem injetadas com sucesso, retire lentamente a agulha para minimizar a perda de material injetado. Após a conclusão da injeção, remova a pinça cirúrgica e a pinça. Em seguida, coloque cuidadosamente o nervo de volta em seu local original.

Feche a incisão com cola cirúrgica veterinária, segurando-a com uma pinça por aproximadamente 20 segundos para permitir que a cola seque. Coloque o animal em uma gaiola aquecida livre de cama até que esteja totalmente recuperado. Monitore a saúde dos ratos.

Camundongos diários são removidos do estudo. Se a carga tumoral exceder 10% do peso corporal normal do animal ou a perda de peso exceder 20% Para determinar o sucesso do procedimento, realize imagens de bioluminescência um e três dias após o enxerto. Injete um camundongo com 2,5 miligramas de Lúcifer e coloque o animal anestesiado na plataforma de imagem aquecida.

A emissão de luz da luciferase do vaga-lume expressa no tumor é detectada 10 minutos após a injeção do substrato. Usando o software da Xeno Gen, defina os tempos de aquisição de imagem para um intervalo de um segundo a 10 minutos. Em seguida, tire fotos em preto e branco dos ratos Pseudocolor.

A escala da bioluminescência é sobreposta a essas imagens para fornecer uma medida da intensidade da emissão de luz. Para serem elegíveis para inclusão em uma coorte de ensaios pré-clínicos, os camundongos devem ter um sinal de bioluminescência detectável, um e três dias após o enxerto, e a intensidade do sinal deve aumentar entre os dias um e três. Aqui é mostrado um aumento progressivo típico na bioluminescência observado de um a 18 dias após o enxerto em um xenoenxerto ortotópico adequadamente estabelecido em um camundongo nu.

Observe a semelhança nos sinais detectados na região de interesse de diferentes camundongos. A recriação de imagens 10 dias e 18 dias após o enxerto mostra que os sinais bioluminescentes aumentam progressivamente no local do enxerto em camundongos individuais. A quantificação dos sinais bioluminescentes observados de um a 24 dias após a enxertia mostra que, embora esses sinais aumentem progressivamente, o crescimento do tumor acelera acentuadamente nos estágios posteriores do período de estudo.

Dado o crescimento agressivo de M pns ts, as células tumorais enxertadas freqüentemente rompem as barreiras normais do nervo e invadem os tecidos adjacentes. Esta micrografia fotográfica do local do enxerto demonstra o crescimento do tumor e a invasão focal no músculo esquelético adjacente Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um camundongo em 10 minutos quando feita corretamente.