Name: Ortotópico do xeno-Human-luciferase Tagged maligna dos nervos periféricos Células Tumorais Bainha para In vivo Teste de Agentes Terapêuticos candidatos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda a técnica de enxerto ortotópico de células tumorais malignas de bainha de nervo periférico marcadas com luciferase em camundongos imunodeficientes. Este método utiliza imagem de bioluminescência para monitorar o crescimento tumoral in vivo e avaliar agentes terapêuticos candidatos em modelo de neuro-oncologia.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e Derrames (R01 NS048353 a SLC), o Instituto Nacional do Câncer (R01 CA122804 a SLC, R01 CA134773 para Kevin A. Roth e SLC e CA13148-35 para KRZ) e do Departamento de defesa (X81XWH-09-1-0086 a SLC). Fundos de apoio à operação da UAB Comprehensive Cancer Center instalação de Pequenos Animais de imagem Shared foram fornecidos por um Core Suporte NCI subvenção (P30 CA13148-35; E. Partridge, PI). Agradecemos ao Alabama Neuroscience Blueprint Core Center (P30 NS57098) eo Núcleo UAB Neuroscience Center (P30 NS47466) pela sua assistência. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional de Saúde ou o Departamento de Defesa.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método ortotópico detalhada xeno aqui apresentado é aquele que desenvolvemos usando células ST88-14 MPNST, uma linha que é amplamente utilizado em estudos desses NF1 associada tumores de bainha de nervo periférico. No entanto, essa metodologia é facilmente adaptável para os estudos pré-clínicos com outras linhagens de células MPNST. Por exemplo, temos também realizada ortotópico xeno com STS-26T 10 células, uma linha derivada de uma MPNST esporadicamente ocorrendo e T265-2c 11 células, que são derivados de uma MPNST NF1-associados, com sucesso semelhante ao que observamos com ST88 -14 células. Dito isto, gostaríamos de observar que as condições exatas que descrevemos aqui para ortotópico xeno-enxerto de células ST88-14 não podem ser diretamente adotado para a enxertia de linhas MPNST outros. Em vez disso, os parâmetros-chave da metodologia deve ser determinado empiricamente para cada linhagem celular. Estes parâmetros incluem o número de células inicialmente MPNST enxertadas, o prazo concedido para o desenvolvimento do enxerto e, em menor grau, o volume em que as células do tumor são injetados. Para estabelecer esses parâmetros para uma nova linha, que grupos de enxerto de camundongos (5 ratos por grupo) com outubro 03-05 x 10 6 células tumorais, verificando duas concentrações de células para cada ordem de grandeza (ie, 10 3 células, 5 x 10 3 células, 10 4 células, 5 x 10 4 células, etc.) Maior número de células tumorais (&gt; 10 6) deve ser injetado em um maior volume; descobrimos que até 5 mL podem ser injetadas sem perda de células do nervo enxertado. Temos também descobriu que não mais que 5 x 10 6 células tumorais por 5 mL de volume pode ser injetado como suspensões mais denso tornar-se cada vez mais propenso a tesoura que mata as células do tumor. Nós seguimos estes ratos até pelo menos três animais dentro de cada grupo têm tumores palpáveis, em que ponto nós pôr termo a esse grupo e examinar o nervo histologicamente para confirmar o crescimento do enxerto. Obviamente, o tempo necessário para chegar a este ponto será diferente, dependendo do número de células injetadas, em geral, estamos buscando uma concentração de células que irá atingir o crescimento tumoral máxima permitida dentro de 30-60 dias. Crescimento mais rápido pode tornar difícil para alcançar concentrações terapêuticas eficazes antes do término do experimento e / ou evitar o acúmulo de pontos de dados de imagem de bioluminescência suficiente ao longo dos experimentos. Um curso de tempo superior a 60 dias faz ajustando os parâmetros experimentais pesadas e prolonga desnecessariamente a duração dos experimentos planejados. Finalmente, gostaríamos de observar também que temos utilizado esta metodologia ortotópico xeno com ST88-14 células enxertadas em camundongos NIH III para demonstrar a eficácia terapêutica do tamoxifeno 6. Uma descrição detalhada dos métodos que usam rotineiramente para avaliar os efeitos de agentes terapêuticos candidato em xenoenxertos ortotópico pode ser encontrado nesse manuscrito. Também tem sido demonstrado que as células neurofibroma pode ser enxertadas com sucesso em nervo periférico 12, sugerindo que, com modificações, os procedimentos descritos neste protocolo pode ser usado para realizar ensaios pré-clínicos com agentes terapêuticos dirigidos contra candidato neurofibromas.

<table><tbody><tr><td>Camundongos SCID outbred Foxchase</td><td>Charles River Laboratories</td><td>#236</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos NIH III</td><td>Taconic</td><td>#NIHBNX</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos NOD-SCID&amp;#947;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>Cell Stripper</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-056-cl</td><td></td></tr><tr><td>Cola cirúrgica Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Hamilton Co</td><td>#80030</td><td>volume de 10 &amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Agulhas para seringa Hamilton</td><td>Hamilton Co</td><td>#7803-05</td><td>33 Ga., 0,5 polegada, PT4 (fabricado sob encomenda)</td></tr><tr><td>Chips de orelha</td><td>National Band and Ear Tag Co.</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

ortotópico do xeno-human-luciferase tagged maligna dos nervos periféricos células tumorais bainha para in vivo teste de agentes terapêuticos candidatos

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Embora em telas vitro são essenciais para a identificação inicial de agentes terapêuticos candidato, uma avaliação rigorosa da capacidade da droga para inibir o crescimento do tumor deve ser realizado em um modelo animal adequado. O tipo de modelo animal que é melhor para esta finalidade é um tema de intensa discussão. Algumas evidências indicam que estudos pré-clínicos de examinar os efeitos da droga em tumores que surjam em camundongos transgênicos são mais preditivo do resultado clínico 1 e assim por agentes candidato terapêuticas são frequentemente testados nesses modelos. Infelizmente, os modelos transgênicos não estão disponíveis para vários tipos de tumor. Além disso, os modelos transgênicos têm, frequentemente, outras limitações, tais como preocupações sobre a forma como os modelos bem tumor do mouse seu homólogo humano, penetrância incompleta do fenótipo do tumor e uma incapacidade de prever quando irá desenvolver tumores. Conseqüentemente, muitos pesquisadores utilizam modelos xenoenxerto (células tumorais humanas enxertados em camundongos imunodeficientes) para os ensaios pré-clínicos, se necessário modelos de tumor transgênicos não estão disponíveis. Mesmo os modelos transgênicos estão disponíveis, são muitas vezes em parceria com modelos como o último xenoenxerto facilitar a determinação rápida de faixas terapêuticas. Além disso, esta parceria permite uma comparação da eficácia do agente em tumores transgênicos e genuíno células tumorais humanas. Historicamente, xeno tem sido muitas vezes realizada através da injeção de células tumorais por via subcutânea (xenoenxertos ectópica). Esta técnica é rápida e reprodutível, relativamente barata e permite a quantificação contínua de crescimento do tumor durante o período terapêutico 2. No entanto, o espaço subcutâneo não é o microambiente normal para a maioria neoplasias e por isso os resultados obtidos com xeno ectópica pode ser enganadora, devido a fatores como a ausência de órgãos específicos expressão do tecido do hospedeiro e dos genes do tumor. Foi assim fortemente recomendado que ectópica estudos de enxertia ser substituídos ou complementados por estudos em que as células tumorais humanas são enxertados em seu tecido de origem (xeno ortotópico) 2. Infelizmente, a implementação desta recomendação é muitas vezes frustrada pelo fato de que ortotópico metodologias xeno ainda não foram desenvolvidos para vários tipos de tumor. Tumores malignos da bainha dos nervos periféricos (MPNSTs) são sarcomas altamente agressivos que ocorrem esporadicamente ou em associação com neurofibromatose tipo 1 3 e mais comumente surgem no nervo ciático 4. Aqui nós descrevemos um método tecnicamente simples em que firefly luciferase marcadas MPNST células humanas são orthopically xenografted no nervo ciático de ratos imunodeficientes. Nossa abordagem para avaliar o sucesso do procedimento de enxerto em animais individuais e randomização não-tendenciosa subseqüentes em grupos de estudo também é discutida.

Um método para enxertia confiável luciferase marcadas humana maligna dos nervos periféricos células tumorais em bainha do nervo ciático de ratos imunodeficientes é descrito. A utilização de imagem de bioluminescência para demonstrar estabelecimento adequado de enxertos tumor e critérios para a segregação aleatória dos animais em grupos de estudo são também discutidos.

Ortotópico do xeno-Human-luciferase Tagged maligna dos nervos periféricos Células Tumorais Bainha para In vivo Teste de Agentes Terapêuticos candidatos

Embora as triagens in vitro sejam essenciais para a identificação inicial de agentes terapêuticos candidatos, uma avaliação rigorosa da capacidade da droga de...

O objetivo geral deste procedimento é determinar se um agente terapêutico candidato inibe efetivamente o crescimento de células M-P-N-S-T enxertadas no nervo ciático de camundongos imunodeficientes. Isso é realizado primeiramente removendo as células tumorais de um frasco de tecido, lavando-as e ressuspendendo-as na concentração adequada. O segundo passo do procedimento consiste em expor cirurgicamente o nervo ciático e, em seguida, injetar no nervo 5.000 células.O próximo passo é determinar o sucesso do enxerto utilizando imagemagem in vivo baseada em luz, randomizando os CIN em grupos de estudo e iniciando a terapia com o agente terapêutico candidato. O passo final do procedimento é coletar os tumores 30 dias após o enxerto e analisar os efeitos que o agente terapêutico candidato teve sobre o tumor. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram se o agente terapêutico reduziu o crescimento tumoral por meio de métodos como comparação dos pesos tumorais, análise das taxas relativas de proliferação por meio de imunomarcação para KI 67 e avaliação dos níveis de morte celular tumoral em camundongos controle e tratados com ensaios TUNEL.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o enxerto subcutâneo, é que ela modela o microambiente normal, o que representa melhor o crescimento de M-P-N-S-T. A demonstração desta técnica será realizada por Amy Turk, uma técnica do meu laboratório. Camundongos imunodeficientes não nus são preparados no dia anterior ao enxerto. Utilize tesouras elétricas para raspar os pelos de um camundongo anestesiado, trabalhando sobre uma placa aquecida para manter a temperatura corporal.Utilize um agente depilatório químico para remover qualquer pelos remanescentes. Após a remoção completa dos pelos, coloque o camundongo sobre uma placa aquecida em uma gaiola de isolamento sem cama até a recuperação total. No dia do enxerto, centrifugue as células a 3000 RPM por cinco minutos.Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em DMEM 10 sem puromicina até uma concentração final de cinco vezes 10 à terceira células por três microlitros. Mantenha as células no gelo até o momento do uso. Para começar, posicione um animal anestesiado sobre uma placa aquecida e aplique pomada oftálmica em cada olho.Prenda uma etiqueta na orelha com um número de identificação exclusivo na orelha direita de cada camundongo. Para facilitar a identificação durante todo o estudo, posicione o animal em decúbito ventral e afaste suas patas traseiras. Cubra o camundongo com um campo estéril e exponha uma janela cirúrgica onde será realizado o enxerto.Aplicar Betadine no local cirúrgico com um aplicador de algodão, começando no centro da região lombar e espiralando gradualmente para fora até as bordas da janela cirúrgica. Em seguida, aplica-se etanol 70% no local cirúrgico da mesma maneira. Aplicações consecutivas de Betadine seguidas por etanol são repetidas mais duas vezes.Retire as células do gelo e, suavemente, vortexe ou sacuda o tubo para ressuspender as células sedimentadas. Use uma pipeta para remover 3,2 microlitros da suspensão celular e expulse-a sobre um pedaço de paraforma. Aspire três microlitros da suspensão celular para dentro de uma seringa Hamilton de 10 microlitros.Equipado com uma agulha de calibre 33. Mantenha as células e a seringa contendo as células em gelo até o momento do uso. Utilize um cabo de bisturi número quatro, equipado com uma lâmina de bisturi número 22, para fazer uma incisão na pele da região lateral do flanco logo abaixo e paralela ao fêmur.Abra a incisão na pele com a pinça cirúrgica para expor o músculo subjacente. Use uma tesoura de ponta fina para realizar uma dissecação romba pela fáscia que percorre o comprimento da perna e expor o nervo ciático, que se encontra abaixo de uma estrutura linear branca com aproximadamente a espessura de um fio grosso, trabalhando sob um microscópio. Use uma pinça curva de ponta fina para dissecar cuidadosamente sob o nervo, soltando-o do músculo subjacente.Deixe a pin&ccedil;a no lugar para manter o nervo elevado e isolado com cuidado. Insira a agulha da seringa Hamilton no nervo, tentando manter o &acirc;ngulo da inje&ccedil;&atilde;o o mais paralelo poss&iacute;vel ao nervo, para n&atilde;o perfurar at&eacute; a face inferior. Uma vez que a agulha esteja adequadamente posicionada no nervo, relaxe a tens&atilde;o produzida pela pin&ccedil;a e injete lentamente as c&eacute;lulas ao longo de 45 a 60 segundos. Uma inje&ccedil;&atilde;o lenta &eacute; essencial para evitar o refluxo de c&eacute;lulas tumorais, o que resultaria em sua perda.Após todas as células terem sido injetadas com sucesso, retire lentamente a agulha para minimizar a perda do material injetado. Após a conclusão da injeção, remova o grampo cirúrgico e a pinça. Em seguida, coloque cuidadosamente o nervo de volta em sua localização original.Fecher a incisão com cola cirúrgica vet bond, mantendo-a fechada com pinça durante aproximadamente 20 segundos para permitir que a cola seque. Colocar o animal em uma gaiola aquecida, sem cama, até que esteja totalmente recuperado. Monitorar a saúde dos camundongos.Camundongos são removidos diariamente do estudo. Se a carga tumoral exceder 10% do peso corporal normal do animal ou a perda de peso exceder 20%, para determinar o sucesso do procedimento, realize imagem de bioluminescência um e três dias após o enxerto. Injete um camundongo com 2,5 miligramas de luciferina e coloque o animal anestesiado na plataforma de imagem aquecida.A emissão de luz da luciferase da vaga-lume expressa pelo tumor é detectada 10 minutos após a injeção do substrato. Utilizando o software da Xeno Gen, defina os tempos de aquisição de imagem em uma faixa de um segundo a 10 minutos. Em seguida, tire fotografias em preto e branco dos camundongos e aplique pseudocoloração.A escala da bioluminescência é sobreposta a essas imagens para fornecer uma medida da intensidade da emissão de luz. Para serem elegíveis para inclusão em um grupo de ensaio pré-clínico, os camundongos devem apresentar um sinal de bioluminescência detectável tanto um quanto três dias após o enxerto, e a intensidade do sinal deve aumentar entre o primeiro e o terceiro dia. É mostrado aqui um aumento típico e progressivo da bioluminescência observado de um a 18 dias após o enxerto em um xenoenxerto ortotópico adequadamente estabelecido em um camundongo nu.Observe a semelhança nos sinais detectados na região de interesse de diferentes camundongos. A reimagem realizada 10 e 18 dias após o enxerto mostra que os sinais bioluminescentes aumentam progressivamente no local do enxerto em camundongos individuais. A quantificação dos sinais bioluminescentes observados de um a 24 dias após o enxerto mostra que, embora esses sinais aumentem progressivamente, o crescimento tumoral acelera marcadamente nas fases posteriores do período do estudo.Dado o crescimento agressivo de M pns ts, as células tumorais enxertadas frequentemente rompem as barreiras normais do nervo e invadem tecidos adjacentes. Esta microfotografia do local do enxerto demonstra o crescimento tumoral e a invasão focal no músculo esquelético adjacente. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um camundongo em 10 minutos quando executada corretamente.

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Luciferase modificados xenotransplantes tumorais humanos cerebral intracraniana pode ser estabelecida em camundongos atímicos, com posterior acompanhamento do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem de bioluminescência. Em combinação com a análise de sobrevivência, o monitoramento bioluminescência é uma ferramenta de pesquisa essencial para ensaios pré-clínicos de terapias sendo considerado para o tratamento de tumores cerebrais.

Estabelecer xenoenxertos tumor intracraniano Cérebro com posterior análise do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem Bioluminescência

Aqui, descrevemos os métodos para construir, visualizar e quantificar as reações bioluminescentes de ambos vagalume e Renilla enzimas luciferase expressos em células de câncer de mama metastático durante o seu crescimento e...

In vivo dupla Substrato Bioluminescent imagem

Nós descrevemos um método integrado para a implantação, precisa estereotáxica de células de glioblastoma multiforme humano no cérebro de camundongos nude e série...

Implantação estereotáxica intracraniana e<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent de xenoenxertos de tumores em um Sistema Modelo de Rato Glioblastoma Multiforme

Uma melhor compreensão da biologia do câncer de pâncreas é criticamente necessário para permitir o desenvolvimento de melhores opções terapêuticas para o tratamento de câncer no pâncreas. Para atender a essa necessidade, nós demonstramos um modelo ortotópico de câncer pancreático que permite o monitoramento não-invasivo de progressão do câncer...

Modelo ortotópico bioluminescente de progressão do câncer de pâncreas

As células de glioma GL261 fornecem um modelo animal imunocompetente útil de glioblastoma. Os objetivos deste protocolo são demonstrar técnicas adequadas para monitorar o crescimento do tumor intracraniano usando imagens de bioluminescência in vivo e verificar a utilidade das células GL261 modificadas com luciferase para estudar a imunologia tumoral e abordagens imunoterapêuticas para o tratamento do glioblastoma.

Bioluminescência imagem de um modelo animal para imunocompetentes Glioblastoma

imagem de bioluminescência é uma ferramenta bem conhecida para localizar tumores e metástases, mas a quantificação dessas imagens muitas vezes requer cálculos complexos e instrumentos particulares. Nós descrevemos o método luminoscore de usar fácil, com base nas condições de aquisição precisas, sem necessidade de cálculos, e permitindo que a carga tumoral e resposta ao tratamento a ser monitorado em modelos do rato.

Método Tumor Quantificação Baseada em bioluminescência para a progressão do tumor Monitoramento e efeitos do tratamento em modelos de ratos linfoma

Aqui, apresentamos um protocolo utilizar injeção guiada por ultra-som de neuroblastoma (NB) e células (ES) de sarcoma de Ewing (estabeleceu linhas celulares e células tumorais do paciente-derivado) biologicamente relevantes locais para criar modelos pré-clínicos confiáveis para câncer pesquisa.

Utilização do ultra-som guiado implantação celular tecido-dirigido para o estabelecimento de Xenografts biologicamente relevantes Tumor metastático

Aqui usamos bioluminescentes, raio-x e positron-emissão calculado a tomografia computadorizada/tomografia computadorizada de imagem para estudar a atividade como a inibição de mTOR impactos tumores de medula óssea-incorporada do mieloma múltiplo em um modelo de transplante. Isto permite análises fisiologicamente relevantes, não-invasivo e multimodais do efeito antimieloma de terapias direcionamento incorporada a medula óssea mieloma tumores na vivo.

Imagem de tomografia computadorizada multimodal bioluminescentes e emissão positrônica Tomography/computacional de mieloma múltiplo Xenografts de medula óssea em camundongos NOG

Descrevemos o transplante intraparenquimal de células progenitoras neurais transduzidas com um vetor de repórter duplo expressando proteína fluorescente verde-luciferase (GFP) no cérebro do camundongo. Após o transplante, o sinal de luciferase é repetidamente medido usando bioluminescência in vivo e células enxertadas expressas por GFP identificadas em seções cerebrais usando microscopia de fluorescência.

Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro do camundongo

Um grande desafio do desenvolvimento de novas terapias para o câncer de pulmão inclui a modelagem do microambiente tumoral à medida que a doença regional progride para a doença metastática. Aqui, descrevemos um método simples de estabelecer um modelo singênico ortotópico de câncer de pulmão que permite o rastreamento in vivo da doença ao longo do tempo.

Um método minimamente invasivo para gerar um modelo ortotópico singênico de câncer de pulmão em camundongos

A neurofibromatose tipo 1 (NF1) leva a tumores benignos da bainha do nervo periférico (neurofibromas) que requerem um microambiente nervoso específico para o crescimento. Um modelo de xenoenxerto ortotópico otimizado foi desenvolvido, usando injeção intraneural de células humanas de Schwann em camundongos NSG. Este modelo recapitula neurofibromas humanos e fornece uma plataforma valiosa para avaliar estratégias terapêuticas.

Um Xenoenxerto Ortotópico do Nervo Ciático para Neurofibromatose Tipo 1

Aprenda a técnica de enxerto ortotópico de células tumorais malignas de bainha de nervo periférico marcadas com luciferase em camundongos imunodeficientes. Este método utiliza imagem de bioluminescência para monitorar o crescimento tumoral in vivo e avaliar agentes terapêuticos candidatos em modelo de neuro-oncologia.

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