Name: Polietileno Glicol eficiente Transformação Mediada (PEG) do Moss Physcomitrella patens /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Aprenda a transformar protoplastos de Physcomitrella patens usando PEG para engenharia genética em plantas. Este método eficiente permite expressão de proteínas fluorescentes e estudos de função gênica em musgos.

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1. Tornando o Protoplastos <ol><li> Adicionar 9 ml de 8% manitol a uma placa de Petri. </li><li> Usando uma espátula, coloque sete dias de idade musgo 2-3 PPNH4 placas de 5 - na placa de Petri contendo manitol. </li><li> Adicionar 3 mL de Driselase 2% (Sigma D9515-25G) para a placa de Petri. </li><li> Incubar a placa de Petri, à temperatura ambiente com agitação suave durante 1 hora. </li><li> Filtrar a suspensão de protoplastos através de uma malha M 100 (BD Falcon 352.350). </li><li> Gire a suspensão filtrada em 250 g por 5 minutos. Remover o sobrenadante. </li><li> Re-suspender a protoplastos muito suavemente, com 500 mL de manitol 8%. </li><li> Adicionar 9,5 mL de manitol 8% no tubo de cultura. Certifique-se de protoplastos são totalmente suspensos. </li><li> Repita a filtragem e re-suspensão etapas (1.6, 1.7 e 1.8) mais duas vezes. </li><li> Tomar 10 mL da solução de protoplastos e contar os protoplastos em um hemocitômetro. </li><li> Multiplicar o número de protoplastos em uma área de 16 quadrados por 10 mil para obter o número de protoplastos por mL (Figura 1). </li></ol> 2. Transformação <ol><li> Gire a suspensão de protoplastos em 250 g por 5 minutos. Remover o sobrenadante. </li><li> Re-suspender de protoplastos em solução de MMG na concentração de 1,6 milhões de protoplastos / mL. </li><li> Incubar a suspensão de protoplastos em temperatura ambiente por 20 minutos. </li><li> Adicionar 600 mL da suspensão de protoplastos em um tubo de cultura contendo 60 g de DNA. Agitar o tubo cuidadosamente. </li><li> Adicionar 700 mL de PEG / Ca solução na mistura de protoplastos / DNA. Redemoinho suavemente o tubo até que a mistura toda é homogênea. </li><li> Incubar a mistura à temperatura ambiente por 30 minutos. </li><li> Durante este período de espera, cubra PRM-B placas com papel celofane (80 círculos mm de diâmetro, AA Packaging Limited, UK); permitir celofane para hidratar na superfície da placa durante pelo menos 5 min. </li><li> Com uma espátula, retire as bolhas de ar presas entre o celofane eo prato. </li><li> Diluir a mistura com 3 mL de solução W5. </li><li> Girar a mistura de 250 g por 5 minutos. Remover o sobrenadante. </li><li> Re-suspender de protoplastos em 2 mL da PRM derreteu-T (antes de adicioná-lo ao protoplastos esta solução pode ser mantido líquido a 42 ° C). Placa de 1 mL de re-suspensão de protoplastos por PRM-B placa coberta por papel celofane. Enrole as placas com micropore (3M, Cuidados de Saúde). Mantenha as placas a 25 ° C em câmara de crescimento. </li><li> Alternativamente, protoplastos pode ser re-suspenso em 1 mL de meio de revestimento líquido e 0,5 mL semeadas em uma placa de PRM-B coberto com papel celofane. Isto permite acelerar a regeneração, mas o número de plantas em regeneração é menor. </li><li> Câmara de crescimento é definida para uma hr 16. luz e 8 horas. ciclo escuro. </li><li> Mover o celofane para a uma placa nova seleção quatro dias após a transformação. </li></ol> 3. Resultados representativos: Um exemplo de transformação é mostrado na Figura 2. O DNA utilizado neste exemplo foi um superenrolado 7,8 kb do plasmídeo carregando uma fita resistente à higromicina. A quantidade de protoplastos banhado foi reduzida para 50% para a fotografia. As fotos foram tiradas duas semanas depois que as plantas foram transferidas para as placas de seleção. A eficiência de transformação não é afetada pela concentração de DNA até 60 mg. Maiores concentrações de DNA são prejudiciais para a eficiência de transformação. Os dados mostraram que este método proporciona resultados consistentes em uma ampla faixa de quantidades de DNA. Este método também pode gerar transformantes estáveis ​​de forma eficaz, como mostrado na Tabela 1, podemos obter cerca de 4 transformantes estáveis ​​por micrograma de DNA linearizado, que é muito maior do que o que foi relatado anteriormente 14. Também testamos o efeito do choque térmico sobre a eficiência de transformação, transformando um plasmídeo superenrolado carregando um gene de uma proteína fluorescente como um marcador. O choque térmico foi realizada 10 minutos após incubação à temperatura ambiente (dentro de Passo 2.6), incubando a mistura em banho-maria a 45 ° C por 3 minutos. A mistura foi incubada em banho-maria à temperatura ambiente imediatamente após o choque térmico durante 17 min. Os resultados foram registrados 22 horas após a transformação. Os rácios de transformantes obtidos com e sem choque térmico foram muito semelhantes (~ 25%), mas observamos um efeito adverso de choque térmico sobre a viabilidade da protoplastos (dados não mostrados). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ver de protoplastos em hemocitômetro. A seção necessária para a contagem de protoplastos é indicado por um quadrado vermelho. Observe a 16 quadrados necessários para a contagem de protoplastos (ver 1.11), a imagem mostra uma contagem de 24 de protoplastos (240.000 células / mL). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fotos de 18 dias de idade transformantes transitória. Protoplastos foram transformado com a quantidade indicada de plasmídeo superenrolado. A: 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg. <table border="1"><tbody><tr><td> Quantidade de DNA (mg) </td><td> Eficiência (tranformants / DNA mg) </td></tr><tr><td> 15, superenrolado plasmídeo </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30, superenrolado plasmídeo </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60, superenrolado plasmídeo </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120, superenrolado plasmídeo </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60, linearizado plasmídeo </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> Tabela de eficiência de transformação 1. DNA em quantidades diferentes.

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado permite uma transformação DNA simples e consistente em protoplastos Physcomitrella patens. Este método foi originalmente desenvolvido para Arabidopsis 1, mas aqui nós demonstramos que ele executa bem com protoplastos de Physcomitrella patens, uma planta simples e diferente. Portanto, esse método pode ser aplicado a outras espécies vegetais com pequenas modificações. Possíveis modificações para a otimização incluem concentração de protoplastos em MMG, tempo de incubação em solução de MMG e PEG / Ca. Nós escolhemos usar 60 mg de DNA em nossos experimentos de rotina porque o número de transformantes aumenta linearmente com a concentração de DNA até este ponto (Tabela 1). Poderíamos obter aproximadamente 7.000 transformantes transitória ou 200 transformantes estáveis ​​em um único transformação DNA 60 mg, que permite a triagem e análise de uma grande população de plantas. Os protoplastos transformados podem ser distribuídos com o meio de revestimento líquido ou PRM-T. Embora a eficiência de regeneração é menor quando o meio de revestimento líquido é usado, escolhemos este método quando os protoplastos foram transformadas com plasmídeos superenrolado. Como mostrado na Tabela 1, as transformações feitas com DNA plasmidial superenrolado transformantes gerar muitos mais e, assim, ainda podemos obter um grande número de plantas com meio de revestimento líquido. Além disso, espalhando protoplastos com o meio líquido de revestimento permite acelerar a regeneração, o que é importante para experimentos envolvendo fenótipos transitórios, tais como RNAi derrubar experimentos 9,15. Além disso, a ausência de agar top permite o isolamento planta fácil para a imunocoloração e RT-PCR 9,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Ingrediente </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1,84 mM KH 2 PO 4 3,4 mM Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2,72 mM de tartarato diamónico 54 M FeSO 4 .7 H 2 O 9,93 mM H 3 BO 3 1,97 mM MnCl 2 .4 H 2 O 0,23 mM CoCl 2 .6 H 2 O 0,19 mM ZnSO 4. 7H 2 O 0,22 mM CuSO 4. 5H 2 O 0,10 mM Na 2 MoO 4 .2 H 2 O 0,168 mM KI Adicionar agar 0,7% para meio sólido. </td></tr><tr><td> PRM-B </td><td> PPNH 4 com manitol 6% e ágar 0,8%. Adicionar 10 mL 1M CaCl 2 a 1 L antes de coloca placas. </td></tr><tr><td> PRM-T </td><td> PPNH 4 com manitol 6% e ágar 0,6%. Adicionar 0,5 mL 1M CaCl 2 a 50 mL antes do uso. </td></tr><tr><td> Médio Plating líquido </td><td> PPNH 4 com manitol 8,5%, sem agar. Adicionar 0,5 mL 1M CaCl 2 a 50 mL antes do uso. </td></tr><tr><td> Driselase 2% </td><td> Adicionar 4 g de Driselase (Sigma D9515-25G) para 200 mL de manitol 8%. Mexa delicadamente por 30 min. à temperatura ambiente, incubar 30 min. a 4 ° C, e mexa delicadamente por 5 min. à temperatura ambiente. Spin-2500 g por 10 min, descarte da pelota. Filtro com 0,22 mM, e armazenar congelados como alíquotas de 10 mL. Descongelar em banho-maria à temperatura ambiente antes de usar. </td></tr><tr><td> MMG </td><td> 0,4 M manitol 15 mM MgCl 2 4 mM MES (pH 5,7) </td></tr><tr><td> PEG / Ca </td><td> 4 g PEG4000 3 mL H 2 O 2,5 mL 0,8 M manitol 1 mL CaCl 2 1M </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 mM NaCl 125 mM CaCl 2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5,7) </td></tr></tbody></table>

polietileno glicol eficiente transformação mediada (peg) do moss physcomitrella patens</em

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

<p class="jove_content"&gt; Um método simples e eficiente para transformar<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplastos é descrito. Este método é adaptado de protocolos para<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplastos e<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Transformação de protoplastos do mesófilo<sup&gt; 1</sup&gt;. Devido à sua capacidade de se submeter a mitose eficiente recombinação homóloga<em&gt;, Physcomitrella patens</em&gt; Surgiu como um sistema modelo importante nos últimos anos<sup&gt; 2</sup&gt;. Esta capacidade permite que altas freqüências de gene targeting<sup&gt; 09/03</sup&gt;, Que não é visto em plantas modelo, tais como<em&gt; Arabidopsis</em&gt;. Para tirar o máximo partido deste sistema, precisamos de um método eficaz e fácil de entregar DNA em células de musgo. As formas mais comuns de transformar este musgo são bombardeio de partículas<sup&gt; 10</sup&gt; E DNA mediada por PEG captação<sup&gt; 11</sup&gt;. Embora bombardeio de partículas pode produzir uma alta eficiência de transformação<sup&gt; 12</sup&gt;, Armas gene não são prontamente disponíveis para muitos laboratórios e que o protocolo é de difícil padronização. Por outro lado, PEG transformação mediada não requer equipamentos especializados, e pode ser realizada em qualquer laboratório com um capuz estéril. Aqui, vamos mostrar um método simples e altamente eficiente para a transformação de protoplastos musgo. Este método pode gerar mais de 120 transformantes por micrograma transitória de DNA, que é uma melhoria a partir do protocolo mais eficiente relatado anteriormente<sup&gt; 13</sup&gt;. Devido à sua simplicidade, eficiência e reprodutibilidade, este método pode ser aplicado a projetos que exigem grande número de transformantes, bem como para a transformação de rotina.</p

Um método simples e eficiente para transformar<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplastos é descrito. Este método é adaptado de protocolos para<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplastos e<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Transformação de protoplastos do mesófilo<sup&gt; 1</sup&gt;.

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O objetivo geral deste procedimento é transformar protoplastos de SCO Metre. Isso é realizado primeiramente digerindo as plantas com Drizly. Em seguida, os protoplastos são lavados com manitol para remover o Drizly e, então, incubados com DNA e PEG.Por fim, os protoplastos transformados são espalhados em placas e incubados. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram protoplastos transformados expressando proteínas marcadas com fluorescência por meio de microscopia de fluorescência. Demonstrará o procedimento Y lu, um pós-doutorando do meu laboratório.A principal vantagem desta técnica é que ela é eficaz e gera consistentemente protoplastos que expressam a proteína de interesse. Para isolar protoplastos de musgo, comece adicionando nove mililitros de manitol a 8% em uma placa de Petri usando uma espátula. Coloque musgo com cinco a sete dias de idade, proveniente de duas a três placas PP NH quatro, no manitol. Consulte o protocolo escrito acompanhante para este e outros preparos de reagentes. Em seguida, adicione três mililitros de drizly a 2% e incube à temperatura ambiente com agitação suave por uma hora.Filtre a mistura através de uma malha de 100 microns para obter uma suspensão homogênea verde. Em seguida, centrifugue o filtrado a 250 G durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante com muito cuidado.Resuspenda os protoplastos em 500 microlitros de manitol a 8%. Em seguida, adicione mais 9,5 mililitros de manitol a 8%. Certifique-se de que os protoplastos estejam completamente suspensos.Realize os passos de lavagem mais duas vezes, centrifugando novamente a solução a 250 G por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os protoplastos primeiro em 500 microlitros.Em seguida, 9,5 mililitros de manitol 8% utilizando um hemocitômetro. Conte o número de protoplastos em 10 microlitros da suspensão para transformar o DNA nos protoplastos isolados. Primeiro, centrifugue a mistura de protoplastos a 250 ×g durante cinco minutos.Remova o sobrenadante e ressuspenda os protoplastos a 1,6 milhão por mililitro em solução MMG. Incube a suspensão à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, adicione 600 microlitros da solução de protoplastos a um tubo de cultura contendo 60 microgramas de DNA. Agite.Adicione cuidadosamente 700 microlitros de solução de PEG com cloreto de cálcio e agite. Incube bem a amostra à temperatura ambiente por 30 minutos durante este período de espera. Cubra as placas de PRMB com papel celofane.Em seguida, dilua a suspensão com três mililitros da solução W5 e centrifugue a 250 ×g durante cinco minutos. Para remover o PEG, re-suspenda os protoplastos em dois mililitros de meio PRMT e plaque um mililitro por placa PRMB coberta com celofane. Mantenha as placas a 25 graus Celsius em uma câmara de crescimento.Finalmente, quatro dias após a transformação, transfira a celulose para placas de seleção frescas. Esta figura mostra um exemplo de plantas com 18 dias de idade regeneradas a partir de protoplastos, transformados com 15 microgramas de plasmídeo superenrolado, DNA, contendo um cassete de resistência à higromicina. Aqui, 30 microgramas do mesmo plasmídeo superenrolado, DNA, foram transformados em protoplastos.60 microgramas de DNA xadrez foram transformados nesta amostra. E, finalmente, essas plantas foram regeneradas a partir de protoplastos que foram transformados com 120 microgramas do mesmo DNA plasmidial superenrolado contendo o cassete de resistência à higromicina. A eficiência de transformação não é afetada por concentrações de DNA de até 60 microgramas.No entanto, concentrações mais elevadas de DNA são prejudiciais a este procedimento. Os dados indicam que este método fornece resultados consistentes em uma ampla faixa de quantidades de DNA por semestre. Esta técnica pode ser realizada em três horas, se for executada corretamente.Após este procedimento, métodos adicionais como RNAi transitório e interrupção gênica podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a função gênica.

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